Name: Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Öğrenin, kuru film yöntemiyle katyonik nanolipozom üretimini ve bunların hücrelerde mRNA alımını artırarak protein ekspresyonunu yükseltme yöntemini. Bu teknik hücre canlılığını etkilemeden stabil nanolipozomlar oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. nesil katyonik Nanoliposomes (Şekil 1)
<ol><li>DC-kolesterol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] kolesterol hidroklorid) ve 25 mg/mL nihai bir konsantrasyon ulaşmak için kloroform içinde bir toz olarak teslim uyuşturucu (dioleoyl phosphatidylethanolamine), lipitler geçiyoruz. Not:-20 ° C'de çözünmüş lipidler depolamak</li>
	<li>25 mg/mL stok çözüm her iki lipidler ile çalışır. Mix 40 µL çözünmüş DC-kolesterol ve bir cam şişe içinde çözünmüş uyuşturucu 80 µL. Not: 3 mg toplam lipid tutardır. Kloroform hızlı buharlaşma önlemek için pipetting sırasında lipidler buza koyun.</li>
	<li>Kloroform bir argon gaz akışı altında 15 dakika buharlaştırmak. Daha sonra bir desiccator silika jel ile doldurmak, içinde açık cam şişeye koyun ve kalan kloroform buharlaşmış ve lipid film cam şişe içinde oluşturulur emin olmak için bir vakum gecede uygulamak. Not: hızlı çalışması ve gereksiz O2 temasından kaçının.</li>
	<li>1 mL su nükleaz-alerjik ve girdap süspansiyon için 15 dk (Şekil 2A) ile kurulan lipid film rehydrate. Daha sonra süspansiyon için 1 h (Şekil 2B) sonication banyo içine koyun. Not: Süspansiyon biraz bulutlu olacak.</li>
	<li>Üreticinin yönergelerine göre mini ekstruder montajı, lipid süspansiyon ile bir şırıngaya doldur ve dolgulu şırınga ve boş bir şırınga ekstruder her iki tarafında yer. Lipid süspansiyon aracılığıyla bir şırıngadan membran diğer 20 x-süspansiyon (Şekil 2C) yükseltme için 25 x tuşuna basın. Not: NLps boyutu kullanılan membran gözenek boyutu tarafından belirlenir.</li>
	<li>NLps kadar daha fazla kullanılmasını bir cam şişeye 4 ° C'de depolayın. Not: uzun süreli saklama süresi sonra NLps 15dk için tekrar sonication banyoda 35 kHz tarafından karmaşık oluşumu engelleyecek şekilde yerleştirilmelidir.</li>
</ol>2. sentetik mRNA Vitro transkripsiyon
<ol><li>EGFP kodlama hazırlamak mRNA protokol sonrası yayınlanan önceki34.</li>
	<li>Plazmid ileri 0.7 µM ile eGFP serisinden yükseltmek (5'-TTG GAC SKK CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') ve ters (5'-T120 CTT CTT Yasası CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') astar ve polimeraz kit PCR ile.<ol>
<li>DNA (Tablo malzemeler), erime davranışını değiştirir bir ticari tampon çözeltinin 20 µL yanı sıra 20 µL polimeraz Takımı'ndan 5 x karışımı karıştırın. Her (ileri ve geri) astar 7 µL ekleyin.</li>
		<li>25 ekleyin karışımı ve polimeraz 2 µL eGFP plazmid polimeraz kitinden ng. Not: çözüm pipetting önce polimeraz buz üzerinde tutun.</li>
		<li>H nükleaz ücretsiz eklemek2O karışıma 100 µL hacmi kadar.</li>
		<li>Tablo 1' deki protokol sonrası thermocycler içinde PCR döngüleri çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EGFP kodlama DNA dizisi PCR arıtma kiti ile arındırmak.<ol>
<li>Bu nedenle, bağlama arabellek Takımı'ndan 500 µL PCR çözüm karıştırın ve arıtma sütunlar doldurmak için kullanabilirsiniz.</li>
		<li>1 dk. için maksimum hızda sütunları santrifüj kapasitesi ve filtrate atın.</li>
		<li>Ben sütuna, santrifüj maksimumda tekrar 1 dakika hız ve filtrate atın yıkama arabelleği 750 µL ekleyin.</li>
		<li>Arabellek sütun filtresini kaldırmak için 1 x santrifüj adımı yineleyin.</li>
		<li>Sütun için taze bir 1.5 mL tüp aktarın.</li>
		<li>Nükleaz ücretsiz h 20 µL Ekle2O sütun için kuluçkaya 1 dk ve maksimum hızda 1 dk santrifüj için. Bu adımı yineleyin.</li>
		<li>DNA'ın konsantrasyon fotometre ile ölçmek ve -20 ° C'de saklayın</li>
		<li>Jel Elektroforez kullanarak DNA kalite analizleri gerçekleştirmek. Özel 0.5 g Tris-bor-EDTA (TBE) arabellekte ekleyin ve özel tamamen eriyene kadar mikrodalga yüksek ısı ısı.</li>
		<li>Sıvı özel jel boyama çözüm 5 µL eklemek, çözüm jel odanın içine doldurun ve jel polimerli kadar bekleyin.</li>
		<li>Mix 200 ng 2 µL boya ve buna bir son hacmi 12 µL. hazır bir DNA merdiven yanı sıra DNA örneği jel kuyu Pipette ve Elektroforez için 1 h 100 V çalıştırmak dolgu yükleme x 6 ile DNA'ın.</li>
		<li>UV ışık altında bir jel analiz istasyonu kullanarak jel analiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vitro transkripsiyon mRNA DNA dizisinden T7-polimeraz içeren bir vitro transkripsiyon kiti ile oluşturmak için çalıştırmak ve Ψ-UTP ve metil-CTP ile UTP ve CTP nükleotit değiştirilen yedek.<ol>
<li>Vitro transkripsiyon için Tablo 2takip malzemeyi karıştırın. Not: 1.5 yerine metil-CTP ile 1:10 µL Cy3-CTP seyreltilmiş nükleaz ücretsiz H2O eGFP in vitro Transkripsiyon sırasında mRNA Cy3 etiketleme mRNA elde etmek için.</li>
		<li>IVT tepki karıştırmak 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya</li>
		<li>DNaz 1 µL eklemek T7 polimeraz dan kit ve 37 ° C tarafından DNA şablon sindirimi 15dk için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MRNA arındırmak için RNA temizlik seti kullanın.<ol>
<li>Nükleaz ücretsiz h 100 µL hacmi IVT karışıma doldurmak2O.</li>
		<li>Yukarı ve aşağı pipetting tarafından 350 µL lizis arabellek ve karışımı ekleyin.</li>
		<li>250 µL % 100 etanol ekleyip tekrar karıştırın. Karışımı içine Temizleme sütunları pipette.</li>
		<li>Santrifüj 15 x g ve atma filtrate 8.000 s.</li>
		<li>Bir sütununa, santrifüj 15 için tekrar çamaşır arabelleği 500 µL eklemek 8.000 x gve Kaldır filtrate s.</li>
		<li>1 sütun yıkama x 500 µL yıkama arabellek ve 8.000 x gde 2 dk santrifüj ile.</li>
		<li>Sütun bir taze 1.5 mL tepki tüp içine taşıyın. MRNA 2 elute 1-dak kuluçka nükleaz ücretsiz h 20 µL olan x2O sütun membran üzerinde maksimum hızda 1 dk aralıklarla izledi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fosfat grupları bir dephosphorylation kit kullanarak mRNA kaldırın. 10 x fosfataz arabelleği 4,5 µL ve fosfataz 1 µL mRNA için ekleyin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
	<li>MRNA tekrar, aşağıdaki adımları 2.5.1 - 2.5.7 arındırmak.</li>
	<li>MRNA concertation bir fotometre ile ölçmek.</li>
	<li>Jel Elektroforez saflık ve mRNA boyutunu çözümlemek için kullanın. Bu nedenle, bir özel jel adımları 2.3.9 - 2.3.10 açıklandığı şekilde hazırlayın.<ol>
<li>Formamide, 1 µL % 37 formaldehit, 10 x MEN 1 µL ve boya 200 ile yükleme x 6 1.7 µL Mix 3.3 µL ng mRNA ve ilâ 10 µL nükleaz ücretsiz H ile doldurun2O her örnek ve RNA işaretçisi için.</li>
		<li>Karıştırmak için mRNA denatürasyon 65 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya. Jel mRNA ve RNA marker ile kuyu yük ve 1 h için jel 100 V çalıştırın.</li>
		<li>Bir jel Doktor İstasyonu ile UV ışık kullanarak jel analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. complexation sentetik mRNA
<ol><li>Buz, sentetik mRNA çözülme girdap ve santrifüj tüpü açmadan önce kısa bir süre.</li>
	<li>Mix 10 µL sentetik mRNA (mRNA konsantrasyonu ise 100 ng/µL) 1 µL, 2.5 µL, 5 µL, 10 µL veya 20 µL NLp süspansiyon (NLp konsantrasyonu ise 3 mg/mL). Kısaca santrifüj kapasitesi ve nanolipoplex oluşumu için (RT) Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Not: pipetting tarafından birlikte kullanmayın. Bu hacim kaybına yol açabilir. Kısa bir süre için kapsamlı bir karıştırma girdap.</li>
	<li>1 mL normal hücre orta nanolipoplexes için ve onları yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.</li>
</ol>4. Nanoliposomes kapsülleme Verimlilik Analizi
<ol><li>Kapsülleme deneyler yapmak için RNA miktar seti kullanın.</li>
	<li>Çalışma çözümü için yüksek menzilli floresan boya 1: 200 ve 1:2,000 yüksek menzilli tahlil için sulandrarak hazırlayın. Not: floresan boya buz çözme. Kullanmadan önce doğrudan çalışma çözüm hazırlamak.</li>
	<li>1 mL eGFP 2 µg/mL stok çözeltisi kullanarak yüksek menzilli ve yüksek menzilli standart eğrileri hazırlamak mRNA nükleaz ücretsiz h2O. Not: Standart eğriler için kapsülleme deneylerde kullanılacak olan mRNA kullanın.</li>
	<li>Tablo 3 yüksek menzilli standart (20 ng/mL - 1 µg/mL) hazırlanması için kullanın.</li>
	<li>Yüksek menzilli standart için mRNA hisse senedi çözüm 1:20 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon ulaşmak için 2 µg/mL eGFP sulandırmak. Bir yüksek menzilli standart (1 ng/mL - 50 ng/mL) Tablo 4' te açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>EGFP 1 µg birleştirmek mRNA (10 µL) ve NLps 7.5 µg (2.5 µL) ve 20 dk RT. az için kuluçkaya Not: yıkımı önlemek için mRNA buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Nükleaz ücretsiz H 1 mL ekleyin2O formu nanolipoplexes ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix.</li>
	<li>Kapsüllenmiş örnekleri ve standartları için 1 mL 1: 200 veya 1:2,000 RNA floresan boya çalışma çözeltisi ekleyin ve karanlıkta RT, 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Standartlar ve çoğaltmaları örneklerinde siyah bir 96-şey plaka pipette ve 530, floresans ölçmek nm Mikroplaka Okuyucu (Şekil 3).</li>
</ol>5. Transfection için hücreleri hazırlanması
<ol><li>Plaka 1.5 x 105 A549 hücreler/iyi bir 12-şey plaka 1 d transfection önce.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 normal hücre Orta (DMEM/yüksek glikoz ile % 10 fetal Sığır serum [FBS], 2 mM L-glutamin, % 1 penisilin/streptomisin)'de transfection önce 24 h için kuluçkaya.</li>
</ol>6. transfection hücre
<ol><li>Hazırlanan yıkayın 1 x 1 mL/iyi PBS ile hücreleri (Ca olmadan2 + /Mg2 +).</li>
	<li>1 mL 1 µL, 2.5-µL, 5-µL, 10 µL veya 20 µL NLps, bir de A549 hücreleri ile hazırlanan plaka mRNA kapsüllü eGFP 1 µg içeren hazır nanolipoplex karışımı ekleyin.</li>
	<li>Nanolipoplex süspansiyon hücrelere ekleme ve normal koşullar transfection etkinliğini analiz etmek 24 saat veya 24 saat ve 72 h hücre canlılığı transfection sonra analiz etmek için kuluçkaya. Not: Transfection NLps ile orta bir değişiklik gerektirmez.</li>
</ol>7. Akış Sitometresi ve floresan mikroskopi kullanarak hücre Transfection Etkinlik Analizi
<ol><li>Süpernatant kaldırmak ve 1 mL hücrelerle yıkama/PBS (Ca2 +/Mg2 +) kalan NLps kaldırmak için iyi.</li>
	<li>Hücreleri akış sitometresi için hazırlayın.<ol>
<li>500 µL/iyi tripsin/EDTA (% 0.05) 3 dk. durdurmak için 37 ° C'de hücrelerle işlemi trypsinize ve tripsin düzenli FBS içeren orta aynı miktarda (500 µL/de) ekleyerek devre dışı bırakın.</li>
		<li>Hücreler için 400 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve dikkatli bir şekilde süpernatant hücre Pelet dokunmadan çıkarın.</li>
		<li>PBS 1 mL hücrelerle yıkayın (Ca olmadan2 + /Mg2 +).</li>
		<li>1 x fiksasyon çözüm 300 µL hücrelerde resuspend ve hücreleri akış sitometresi tüpler içine aktarın.</li>
		<li>Senaryo Özeti 488 analiz nm bir akış sitometresi (Şekil 4A) içinde. Not: Girdap ölçme önce hücreleri 1 x doğrudan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri Floresan Mikroskobu hazırlayın.<ol>
<li>Daha önce-20 ° C'de depolanmış 1 mL/iyi % 100 metanol ile hücreleri tamir</li>
		<li>Eklemek 500 µL/iyi 300 nM DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) PBS (Ca2 +/Mg2 +) çözünmüş ve karanlıkta 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>DAPI çözümü kaldırmak ve hücrelerin tekrar-20 ° C'de depolanan % 100 metanol ile yıkayın.</li>
		<li>Hücreleri floresan mikroskop (Şekil 4B) kullanarak analiz. Not: aşağıdaki uyarma/emisyon dalga boylarında kullanın: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461 nm ve Cy3 550/570 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. hücre canlılığı tahlil
<ol><li>RPMI 1 ml (olmadan fenol red) MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür) 5 mg geçiyoruz. Not: Çözünmüş MTT daha fazla sulandırılmış 1:10 olması gerekir (son konsantrasyonu: 0,5 mg/mL) kullanmadan önce RPMI içinde.</li>
	<li>Transfected hücreleri 3 yıkama x 1 mL/iyi PBS (olmadan Ca2 +/Mg2) ile. Not: Kalıntıları normal hücre orta tamamen kaldırılması gerekir.</li>
	<li>1:10 500 µL/iyi MTT çözüm hücrelere seyreltilmiş ve 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya ekleyin</li>
	<li>MTT çözüm hücrelerden kuluçka sonra kaldırın ve 500 µL/iyi DMSO (dimetil sülfoksit) ekleyin. Yine 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya</li>
	<li>Üçüz DMSO çözümde bir açık-alt 96-şey plaka pipette ve 540, adsorpsiyon ölçmek Mikroplaka Okuyucu kullanarak nm.</li>
	<li>Tedavi edilmemiş hücre canlılığı % 100 olarak ayarlayın ve diğer gruplar ile karşılaştırıldığında tedavi edilmemiş kontrol hücreleri (Şekil 5) hücre canlılığı hesaplayın.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sunulan Protokolü NLps nesil sentetik değiştirilmiş mRNA için yüksek kapsülleme etkinliği ile hem de hücreleri vitrogüvenilir transfection açıklar. Ayrıca, buna karşılık, hücre içinde işlevsel bir protein çevrilmiş mRNA sürümü NLps garanti. Ayrıca, NLps kullanarak transfections normal hücre ortamda gerçekleştirilebilir, yüksek çıkan viabilities transfection sırasında hücre ve üç gün sonra transfection son.
MRNA bir tedavi kullanmak için sistemi teslimat için kendi kendine montaj terci...

Değiştirilmiş mRNA kullanımı tedavi uygulamaları için son birkaç yıldır büyük bir potansiyel göstermiştir. Kalp, enflamatuar ve monogenetic hastalıkları, olduğu gibi aşı geliştirme, mRNA bir umut verici terapötik ajan1' dir.
Protein replasman tedavisi ile mRNA DNA transfection2hedef hücreleri içine dayalı klasik gen terapisi birkaç avantaj sunar. MRNA işlevi sitozol doğrudan başlatır. Her ne kadar plazmid DNA (pDNA), bir çift iplikçikli yapı, daire organizatörü bölge ve terapötik protein3, ayrıca eylemlere sitozol, kodlama bir gen dizisini içeren DNA bu sadece mitoz gidiyorsun hücrelere dahil edilebilir transfection anda. Bu doku1,4transfected hücrelerin sayısını azaltır. Özellikle, kalp hücreleri gibi zayıf mitoz faaliyeti ile dokuların transfection zor5' tir. PDNA aksine, transfection ve çeviri mRNA doku1,6mitotik ve mitotik olmayan hücrelerde ortaya çikmaktadir. Ana bilgisayar genom viral entegrasyon DNA'ın mutajenik etkileri veya bağışıklık tepkileri7,8, ama hücrelerin protein kodlama mRNA, istenen protein de novo sentezi ile transfection sonra gelebilir özerk olarak9,10da başlıyor. Ayrıca, protein sentezi tam için hastanın ihtiyacı aracılığıyla bireysel dozlarda, genom ile müdahale ve mutajenik etkileri11riske olmadan ayarlanabilir. Sentetik oluşturulan mRNA bağışıklık aktive potansiyelini önemli ölçüde sahte üridin ve 5'-methylcytidine ve sitidin Üridin12yerine kullanarak indirdi. Sözde Üridin değiştirilmiş mRNA da artan bir biyolojik istikrar ve anlamlı olarak daha yüksek bir translasyonel kapasitesi13var olduğu gösterilmiştir.
MRNA tabanlı terapi klinik uygulamaları umut verici özelliklerinden yararlanmak için mRNA taşıma hücre içine için uygun bir araç oluşturmak için önemlidir. Bu araç toksik olmayan özellikleri vitro ve in vivoayı, mRNA nükleaz düşmesine karşı korumak ve bir uzun süreli kullanılabilirlik ve mRNA14olan için yeterli hücresel alımını sağlamak.
Karbon nanotüpler, kuantum noktaları ve lipozomlar, gibi vivo içinde ilaç dağıtım için tüm olası taşıyıcı türleri arasında ikinci olmuştur en15,16okudu. Lipozomlar veziküller bir lipid bilayer10/ oluşan vardır. Onlar amfifilik bir hidrofobik ve hidrofilik bir bölüm ile ve bu moleküller öz düzenleme ile küresel bir çift katmanlı kurulan17yaşında. Lipozomlar içinde terapötik ajanlar veya uyuşturucu olabilir kapsüllü ve, böylece, enzimatik Bozulması18korumalı. N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium klorür (DOTMA)19, içeren lipozomlar [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propan] (DOTAP)20ve dioctadecylamidoglycylspermine (köpek)21, ya da DC-kolesterol22, iyi karakterize ve DNA veya RNA ile hücresel transfection için sık kullanılan.
Katyonik lipozomlar pozitif yüklü bir lipid ve bir doldurulmamış fosfolipid23oluştururlar. Nükleik asitler hücre24,25içine taşınması için en yaygın yöntemlerden birini transfection yolu ile katyonik lipozomlar var. Katyonik lipit parçacıklar kompleksleri olumsuz şarj edilmiş fosfat grupları ile nükleik asit molekülleri26omurgası oluşturmak. Bu sözde lipoplexes hücre membran yüzeyine takın ve endositoz veya endositoz-gibi-mekanizmaları27aracılığıyla hücre girin.
1989 yılında, Malone ve ark. başarıyla katyonik lipit-aracılı mRNA transfection28nitelendirdi. Ancak, bir karışım DOTMA ve 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (uyuşturucu) kullanarak, Grup DOTMA sitotoksik efekt28tecelli bulundu. Ayrıca, Zohra vd. DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-propan klorür) bir mRNA transfection reaktif29kullanılabileceğini gösterdi. Ancak, için verimli transfection hücre DOTAP fibronektin29 veya uyuşturucu30gibi diğer kimyasalları ile birlikte kullanılmalıdır. Şimdiye kadar DOTMA ilk katyonik lipit gen teslim31için kullanılan piyasada oldu. Diğer lipidler tedavi taşıyıcı olarak kullanılan ya da klinik çalışmalarda, farklı aşamalarında test edilen (örneğin, EndoTAG-ı DOTAP lipid taşıyıcı olarak içeren), şu anda bir aşama II klinik deneme32araştırılmaktadır.
Bu eser DC-kolesterol ve uyuşturucu içeren NLps üretimi için bir protokolünü açıklar. Bu yöntemi gerçekleştirmek kolay ve farklı boyutlarda NLps nesil sağlar. Kuru film yöntemi kullanarak NLp üretimi genel amacı lipozomlar mRNA complexation, böylece verimli ve biyouyumlu hücre transfection vitro14,33izin için oluşturmaktır.

<table><tbody><tr><td>(3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT)</td><td>AppliChem, Darmstadt, Almanya</td><td>A2231</td><td></td></tr><tr><td>(3&beta;-[N-(N&asal;,N&prime;-dimetilaminoetan)-karbamoil]kolesterol hidroklorür (DC-Kolesterol)</td><td>Avanti, Alabama, ABD</td><td>700001</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; &prime;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Almanya</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>BD FACScan sistemi</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Fix (10x)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Almanya</td><td>340181</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksid (DMSO)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Almanya</td><td>20385.02</td><td></td></tr><tr><td>Dioleoil fosfatidiletanolamin (DOPE)</td><td>Avanti, Alabama, ABD</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Zeiss Axio, Oberkochen, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Almanya</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Mini ekstrüder</td><td>Avanti, Alabama, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Qiagen, Hilden, Almanya</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Almanya</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>PBS tamponu (Ca2+/Mg2+ olmadan)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Almanya</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Ribo Green RNA reaktif kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Almanya</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (fenol kırmızısı olmadan)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Almanya</td><td>11835030</td><td></td></tr><tr><td>Silika jel</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>P077</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA (%0,05)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Almanya</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polimeraz Kiti</td><td>Qiagen, Hilden, Almanya</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen, Hilden, Almanya</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td> Psödouridin-5'-Trifosfat (&psi;-UTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, ABD</td><td>N-1019</td><td></td></tr><tr><td>5-Metilsitidin-5'-Trifosfat (Metil-CTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, ABD</td><td>N-1014</td><td></td></tr><tr><td>Siyanin 3-CTP</td><td>PerkinElmer, Baesweiler, Almanya</td><td></td><td></td>NEL580001EA</tr><tr><td>RNeasy Mini Kiti</td><td>Qiagen, Hilden, Almanya</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transkripsiyon Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Almanya</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>3&akut;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Kapak Yapısı Analog</td><td>New England Biolabs, Ipswich, ABD</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>Antarktika Fosfataz</td><td>Yeni İngiltere Biolabs, Ipswich, ABD</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Almanya</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium, Fremont, ABD</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>peqGOLD DNA merdiven karışımı</td><td>VWR, Pensilvanya, ABD</td><td>25-2040</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen 0.5-10kb RNA merdiveni</td><td>Fisher Scientific, G&ouml; teborg, İsveç</td><td>11528766</td><td></td></tr></tbody></table>

vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik nanoliposomes nesil mesajcı rna transkripsiyonu

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Mesajcı RNA (mRNA) gelişimi-çeşitli hastalıkların tedavisinde olumlu nedeniyle daha fazla önemli hale gelir therapeutics temel özelliklerini vitro transkripsiyonu (IVT) mRNA. IVT mRNA sayesinde, istenilen bir protein de novo sentezi hedef hücre fizyolojik durumunu değiştirmeden bağlı olmak. Ayrıca, protein biyosentezi tam IVT mRNA geçici etkisi nedeniyle kontrol edilebilir.
Hücreleri verimli transfection için nanoliposomes (NLps) tedavi mRNA için güvenli ve verimli teslim araç temsil edebilir. Bu çalışmada DC-kolesterol ve 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine oluşan güvenli ve verimli katyonik NLps (uyuşturucu) teslimat vektör olarak IVT mRNA için oluşturmak için bir protokol açıklar. Bir tanımlanmış olan NLps, homojen bir dağılım ve yüksek complexation kapasitesi, boyutu ve kuru-film yöntemi kullanılarak üretilen. Ayrıca, biz onların complexation analiz etmek için farklı test sistemleri mevcut ve transfection efficacies sentetik kullanarak gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) mRNA, hem de hücre canlılığı üzerindeki etkileri. Genel olarak, sunulan Protokolü ilerlemek ve terapötik mRNA yönetimini geliştirmek mRNA complexation için etkili ve güvenli bir yaklaşım sağlar.

Açıklandığı gibi iletişim kuralını kullanarak, lipitler DC-kolesterol ve uyuşturucu oluşan NLps Kuru-film (Şekil 1) yöntemiyle hazırlanmıştır. Hazırlık sırasında nanoliposome çözüm farklı aşamaları bulanıklık (Şekil 2) gösterir.
NLps kapsülleme etkinliğinin ardından eGFP kodlama mRNA 1 µg kapsülleme sonra ücretsiz kapsüllü değil, RNA miktar kiti (Şe...

Burada biz bir protokol üzerinde kuru-film yöntemini temel alır ve güvenli için kullanılan katyonik nanoliposomes, nesil için tarif ve in vitro verimli bir şekilde teslim mesajcı RNA transkripsiyonu.

Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Bu protokol terapötik haberci RNA için transfeksiyon aracı olarak kullanılabilecek güvenli ve verimli nanoliposomes üretimine olanak sağlar. Bu nanoliposomes hücre canlılığını etkilemeden artan protein ekspresyonu düzeyleri ile sonuçlanan hücrelerde mRNA alımını kolaylaştırmak. Bu tekniğin en büyük avantajı, tanımlı boyut ve homojen dağılıma sahip hızlı ve kolay nesil kararlı nanoliposomes'tir.Ayrıca kapsüllü mRNA'yı bozulmadan korur lar ve uzun süreli çeviriye yol açarlar. Prosedürü gösteren Antonia Link, bizim laboratuvardan bir doktora öğrencisi olacaktır. Bu prosedürü başlatmak için, lipidler için stok çözümleri hazırlamak, DC-kolesterol ve DOPE mililitre başına 25 miligram son konsantrasyona kloroform her eriterek.40 mikrolitre çözünmüş DC-kolesterolü 80 mikrolitre çözünmüş DOPE ile bir cam şişede karıştırın. 15 dakika boyunca bir argon gaz akışı altında kloroformu buharlaştırın. Sonra, silika jel ile bir kurutucu doldurun.Açık cam şişeyi içine yerleştirin ve kalan kloroformun buharlaşmasını sağlamak için bir gecede vakum uygulayın. Ortaya çıkan lipid film cam şişe içinde oluşacaktır. Ertesi gün, lipid film rehydrate çekirdeksiz su bir mililitre ekleyin.Ve süspansiyonu 15 dakika girdaplayın. Süspansiyonu bir saat boyunca sonication bath'a yerleştirin. Bundan sonra, üreticilerin talimatlarına göre mini ekstrüder monte edin.Bir şırıngayı sıvı süspansiyonla doldurun ve ekstrüzyonun bir tarafına yerleştirin. Diğer tarafa boş bir şırınga yerleştirin. Süspansiyonekstrüzstrüze yaklaşık 20-25 kez, bir şırıngadan diğerine membran üzerinden lipid süspansiyon basın.Daha sonra nanolipoomları kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede cam bir şişede saklayın. İlk olarak, sentetik mRNA'yı buz üzerinde eritin. Vortex dondurulmuş mRNA ve kısa bir süre tüp açmadan önce santrifüj.Daha sonra, nanolipozom süspansiyon çeşitli miktarlarda sentetik mRNA bir mikrogram karıştırın. Nanolipoplex oluşumu için 20 dakika oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj ve kuluçka. Sonra, nanolipoplex düzenli hücre orta mililitre ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme tarafından karıştırın.Hücreleri transfeksiyondan bir gün önce hazırlayın. Bu nedenle, plaka 150, 000 A549 hücreleri transfection bir gün önce bir 12 kuyu plaka her kuyuiçine. Hücreleri %5 karbondioksit ve normal hücre ortamı ile 37 derecede 24 saat kuluçkaya yatırın.Sonra ertesi gün, pbs bir mililitre ile bir kez hazırlanan hücrelerin her iyi yıkayın. A549 hücrelerini içeren kuyulardan birine bir mililitre hazırlanmış nanolipoplex karışımı ekleyin. Transfeksiyon verimliliğini analiz etmek için 24 saat veya transfeksiyon sonrası hücrenin canlılığını analiz etmek için 24-72 saat düzenli koşullarda kuluçkaya yatırın.Supernatant çıkarın ve kalan nanoliposomes kaldırmak için PBS bir mililitre ile her iyi yıkayın. Hücreleri sitometriye hazırlamak için, öncelikle her kuyuya 500 mikrolitre tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri denemek için 37 derecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, işlemi durdurmak ve trypsin inaktive düzenli FBS içeren orta 500 mikrolitre ekleyin.Hücreleri 400 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Ve dikkatlice hücre pelet rahatsız etmeden supernatant çıkarın. Hücreleri bir mililitre PBS ile yıkayın.Daha sonra hücre fiksasyon çözeltisi 300 mikrolitre hücreleri yeniden askıya ve akış sitometri tüpleri içine aktarın. 488 nanometredeki hücreleri analiz etmek için bir akış sitometresi kullanın. Floresan mikroskopisi için hücreleri hazırlamak için, hücreleri düzeltmek için her iyi soğutulmuş metanol bir mililitre ekleyin.Her kuyuya PBS'de çözünmüş 300 nanomular dapi çözeltisinin 500 mikrolitresini ekleyin. Karanlıkta beş dakika kuluçkaya yat. Bundan sonra, DAPI çözeltisi çıkarın ve daha önce eksi 20 santigrat derece depolanan% 100 metanol ile hücreleri tekrar yıkayın.Burada gösterilen uyarma ve emisyon dalga boylarını kullanarak hücreleri analiz etmek için bir floresan mikroskobu kullanın. Bu çalışmada, nanoliposomes sentetik modifiye mRNA için yüksek kapsülleme etkinliği ile oluşturulur. RNA sayısallaştırma kiti kullanılarak, nanoliposomes kapsülleme etkinliği kapsülleme olmayan mRNA serbest miktarı analiz edilerek eGFP kodlama mRNA bir mikrogram kapsülleme sonra analiz edilebilir.EGFP mRNA'nın farklı miktarlarda nanoliposomezomlarda kapsüllenmesinden sonra, oluşan nanolipoplexes in vitro hücrelerle kuluçkaya yatırılabilir ve eGFP ifade eden hücrelerin yüzdesi transfeksiyon sonrası akış sitometrisi kullanılarak analiz edilebilir. Burada görüldüğü gibi, nanoliposomes çözeltisi bile sadece bir mikrolitre hücrelerin invitro yüksek transfeksiyon elde etmek için yeterlidir. Hücreler cy3 etiketli eGFP mRNA içeren nanolipoomlarla geçirildiğinde, sitoplazmada eGFP mRNA'nın varlığı ve halihazırda üretilen eGFP proteini görselleştirilebilir.Nanolipoplexes kullanarak hücrelerin transfeksiyon hücreleri üzerinde olumsuz etkileri olabilir bu yana, hücrelerin canlılığı 24 saat ve 72 saat post-transfection sonra test edildi. Hücreler 2,5 veya 5 mikrolitre nanolipoplexes ile tedavi edildiğinde hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi tespit edilemedi. Bu yordamı denerken, bu nanolipozom istikrara zarar verebilir, çünkü her zaman etanol içermeyen bir ortamda çalışmak için hatırlamak önemlidir.Hazırlarken ve DOPE ile DC-kolesterol karıştırırken, plastik pipet uçları çözünür bileşenleri ile çözünmüş lipidlerin kontaminasyonunu önlemek için bir cam pipet kullanmalısınız. Bu protokolü takiben, oluşturulan nanoliposomes kolayca sırasında veya hazırlık sonrasında manipüle edilebilir. Örneğin, PEG moleküllerinin veya spesifik antikorların birleştirilmesi stabilitenin artmasına veya aktif doku hedeflemesine yol açacaktır.Oluşturulan nanoliposomes gerekli güvenlik yönlerini yerine getirmek ve hedef hücrelere mRNA alımını kolaylaştırmak. Nanoliposomes belirli bir terapötik nRNA ile karmaşık doku mühendisliği veya replasman tedavisi alanında yeni mRNA tabanlı terapötik gelişimine önemli bir katkı yapabilir.

generation-cationic-nanoliposomes-for-efficient-delivery-vitro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Farelerde katyonik liposomes/siRNA/ITSN-1s kompleksleri, 24 gün boyunca her 72 saatte tekrarlanan retroorbital enjeksiyonları, verimli% 75 oranında ITSN-1s mRNA ve protein ekspresyonu azaltarak fare akciğer mikrovasküler için siRNA dubleks teslim. Bu teknik, bir hayvan modelinde yüksek tekrarlanabilir, herhangi bir olumsuz etkisi yoktur ve ölümlerin önler.

Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi

Bu protokolün amacı, siRNA'nın BBB'yi geçmesini sağlamak için bir CNS dağıtım sistemi olarak nöro-hedefleme peptitli katyonik/anyonik lipozomları kullanmaktır.  siRNA gibi tedaviler için bir dağıtım sisteminin optimizasyonu, prion ve diğer nörodejeneratif hastalıklar için daha fazla tedavi seçeneğine izin verecektir.

Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi

Biz polyethyleneimine (PEI) kullanarak bir yöntemi açıklamak-kaplı superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri siRNA ile transfecting makrofajlar için. Bu nano tanecikleri siRNA makrofajlar vitro ve in vivo ve sessizlik hedef gen ekspresyonu için verimli bir şekilde teslim edebilirsiniz.

Polyethyleneimine kaplı demir oksit nano tanecikleri küçük müdahale RNA makrofajlar için teslim için bir araç olarak Vitro ve In Vivo

Fizikokimyasal özellikleri hazırlamak ve karakterize etmek için yöntemler ve nöphalı, pH duyarlı siRNA nanopartiküller biyoaktivite sunulmaktadır. Boyut, morfoloji, yüzey yükü, siRNA yüklemesi ve gen susturulması gibi başarılı siRNA nanometinler için kriterler tartışılmaktadır.

Sitosolik siRNA teslim için Nötrsel olarak şarj edilmiş, pH duyarlı polimerik nanopartiküller hazırlanması

Lipid nanopartikülleri mRNA ve DNA kapsülleme için mikroakışkan karıştırma platformu yaklaşımı kullanılarak geliştirilmiştir.

Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

RNA teslimatı da dahil olmak üzere ilaç dağıtım sistemlerinde (DDS) mikroakışkan bazlı lipid nanopartikül (LNP) üretim yöntemleri dikkat çekmiştir. Bu protokol, iLiNP adlı orijinal mikroakışkan cihazımızı kullanarak imalat, LNP (siRNA yüklü LNP) üretimi ve LNP değerlendirme süreçlerini açıklar.

Mikroakışkan Cihaz Kullanılarak siRNA Yüklü Lipid Nanopartiküllerinin Üretimi

Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) shRNA'ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC'ler) yüksek verimlilikte.

Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi

Kendinden montajlı bir peptid-poloksamin nanopartikülü (PP-sNp), in vitro transkribe edilmiş mesajcı RNA'yı kapsüllemek ve iletmek için mikroakışkan bir karıştırma cihazı kullanılarak geliştirilmiştir. Tanımlanan mRNA / PP-sNp, in vitro kültürlenmiş hücreleri verimli bir şekilde transfekt edebilir.

Peptit-Poloksamin Nanopartikülleri Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde In vitro Transkribe mRNA'nın Verimli Transfeksiyonu

Burada, ateşböceği lusiferazını kodlayan mRNA'yı kapsülleyen lipid nanopartiküllerini (LNP'ler) formüle etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu LNP'ler, HepG2 hücrelerinde in vitro ve C57BL / 6 farelerinde in vivo potansiyelleri açısından test edildi.

Mikroakışkan Karıştırma ile Formüle Edilen mRNA-Lipid Nanopartiküllerin In Vitro ve In Vivo Etkinliğinin Test Edilmesi

İki jetli bir CIJ ve dört jetli çok girişli girdap karıştırıcı (μMIVM) dahil olmak üzere sınırlı çarpma jeti (CIJ) karıştırıcı teknolojileri kullanılarak lipid nanopartiküllerinin (LNP'ler) sentezlenmesi için ayrıntılı bir protokol gösterilmiştir. CIJ mikserleri, tekrarlanabilir, türbülanslı mikro karıştırma ortamları oluşturur ve bu da monodispers LNP'lerin üretilmesiyle sonuçlanır.

Lipid Nanopartiküllerinin Kapalı Çarpmalı Jet Karıştırıcılarda Türbülanslı Akışla Sentezlenmesi

Öğrenin, kuru film yöntemiyle katyonik nanolipozom üretimini ve bunların hücrelerde mRNA alımını artırarak protein ekspresyonunu yükseltme yöntemini. Bu teknik hücre canlılığını etkilemeden stabil nanolipozomlar oluşturur.

Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu

Daha fazla video keşfet