Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

Bu prosedürün genel amacı, rekombinant proteinleri ER ve GOGI mediad salgı yoluna yönlendirerek, uygun memeli glikozilasyonuna sahip memeli glikoproteinlerini eksprese etmektir. Bu yöntem; antikorların ve antikor fragmanlarının yapısındaki kalıpların rolü ve immün aktivasyon potansiyeli gibi immünolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hedef proteinleri uygun şekilde katlamak ve modifiye etmek için gerekli hücresel ortamı sağlayan insan hücrelerini kullanarak insan proteinlerini eksprese etmesidir.

Hücre kurulumu için kullanılacak inkübatör çalkalayıcı; kültür inokülasyonundan en az bir saat önce 135 RPM, %80 nem, %8 karbondioksit ve 37 °C değerlerinde çalıştırılmalıdır. Biyogüvenlik kabininin UV lambasını açın, mühürlü ortam A ve ortam B şişelerini 37 °C'lik bir su banyosunda ön ısıtmaya tabi tutun. UV ışıklarını kapatın ve biyogüvenlik kabinini %70 etanol ve su çözeltisi ile sterilize edin.

Vantili kapaklı 125 mililitrelik bir erlenmeyer büyüme flaskını, pipetleri, pipetleyicileri ve önceden ısıtılmış besiyeri şişelerini %70'lik etanol su çözeltisi püskürterek sterilize edin. Bu işlem boyunca söz konusu malzemeleri biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Tüm malzemeler, biyogüvenlik kabinine getirilmeden önce bu şekilde sterilize edilmelidir.

26 mililitre ortam A ve üç mililitre ortam B çekerek ve 125 mililitrelik erlenmeyer flaskına aktararak 30 mililitrelik bir kültür için taze kültür ortamı hazırlayın. Nazikçe çalkalayarak karıştırın; daha önce -80 °C'de dondurulmuş bir HEK 2 93 F hücresi vialini, hücreleri kısmen çözdürmek için 37 °C'deki bir su banyosunda ısıtın. Bu işlem yaklaşık bir dakika sürer ve hücreler tamamen çözülmemelidir.

Ardından, flakonun dış kısmını %70'lik etanol çözeltisi ile sterilize edin ve biyogüvenlik kabinine taşıyın. Bir mililitrelik bir pipet kullanarak hücre süspansiyonunu çekin ve 29 mL taze kültür ortamı içeren 125 mL'lik erlenmeyer flaskına aktarın. Kültür flaskının kapağını kapatın ve flaskı 24 saat boyunca inkübatör çalkalayıcıya yerleştirin.

Kültür ekilemesinden 24 saat sonra. Hücre yoğunluğunu kontrol edin, kültür flaskını %70 etanol ve su solüsyonu ile sterilize edin ve biyogüvenlik kabinine taşıyın. Bir mililitrelik pipet ve pipet pompası kullanarak kültürden yavaşça 100 µL çekin ve steril bir 0,5 mL einor tüpüne aktarın.

Kültür flaskının kapağını kapatın ve kültüre flaskını mümkün olan en kısa sürede inkübatör çalkalayıcıya geri yerleştirin. 7.5 µL tripan mavisi çözeltisini 7.5 µL hücre ile karıştırın. Şiddetle karıştırın ve ardından karışımın 7.5 µL'sini bir sayım lamına aktarın.

Otomatik hücre sayıcısını açın ve sayım lamini yükleme haznesine yerleştirin. Otomatik okuyucu etkinleştirilir ve hücreler mililitredeki hücre sayısı ve canlılık yüzdesi birimlerinde otomatik olarak sayılır. Mililitrede 300.000 canlı hücre yoğunluğu elde etmek için taze kültür ortamına aktarılması gereken donör kültür hacmini belirleyin.

Daha önce gösterildiği gibi, 23 mililitre ortam A ve üç mililitre ortam B'yi yeni bir 125 mililitrelik kültür balonuna aktararak taze kültür ortamı hazırlayın. Ardından, kontaminasyon riskini azaltmak için ortam A ve ortam B stok şişelerini biyogüvenlik kabininden çıkarın. HEK 2 93 F hücre kültür balonunu inkübatörden alın.

%70 etanol ve su çözeltisi ile püskürtün ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Yeni bir pipet kullanarak kültürden doğru hücre alikotunu çekin ve taze kültür ortamı içeren flaska aktarın. Her iki kültürü de biyogüvenlik kabininden inkübatör çalkalayıcıya aktarın.

Transfeksiyondan önce hücreleri mililitre başına yaklaşık 2 ila 3 milyon canlı hücre yoğunluğuna ulaşana kadar büyütün. Hücre yoğunluğunu daha önce gösterildiği şekilde kontrol edin ve transfeksiyon için gereken hücre miktarını belirleyin. Bunun için steril bir serolojik pipet kullanın.

Uygun hacimdeki hücre süspansiyonunu 250 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 100 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüj ederek toplayın. Sterilizasyondan sonra, çökelmiş hücreleri içeren tüpü biyogüvenlik kabinine aktarın.

Kullanılmış kültür ortamından oluşan süpernatanı boşaltmak için steril bir pipet kullanın. Peletlenmiş hücreleri, 10 milliliters taze kültür ortamı kullanarak pipetleme yoluyla güçlü bir şekilde resüspande edin ve taze transfeksiyon kültür ortamı içeren hazırlanmış bir flaska aktarın. Havalandırmalı hücre kültürü flaskının kapağını sıkın ve hücreler inkübe olurken flaskı inkübatör çalkalayıcıda 15 dakika ile bir saat arasında inkübe edin.

Plazma DNA ve POLİETERAMİN veya PEI stoklarını, taze kültür ortamı kullanarak mikrolitre başına 0.5 mikrogram nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Dağılmış hücrelerin bulunduğu kültür balonunu inkübatör çalkalayıcıdan çıkarıp biyogüvenlik kabinine alın; bir mikro pipet kullanarak kültüre 300 mikrolitre plazma DNA ekleyin ve nazikçe manuel çalkalayarak karıştırın, ardından kültüre 900 mikrolitre PEI ekleyip tekrar karıştırın. Son olarak 3,8 mililitre taze kültür ortamı ekleyin.

Balonu 24 saat boyunca inkübasyon çalkalayıcıya aktarın. Transfeksiyondan 24 saat sonra hücre kültürü seyreltilmelidir. Seyreltme ortamını hazırlamak için öncelikle, 1 mL önceden ısıtılmış 220 mM valproik asit veya VPA çekmek için steril bir bir mililitrelik serolojik pipet kullanın ve bunu steril bir 50 mL'lik tüpe aktarın.

Ardından, VPA çözeltisine beş mililitre önceden ısıtılmış medium B ve 44 mililitre önceden ısıtılmış medium A eklemek için steril bir serolojik pipet kullanın. Bu işlem sonucunda, 4,4 milimolar nihai VPA konsantrasyonuna sahip 50 mililitre taze kültür ortamı elde edilir. Transfekte edilmiş kültürü inkübatörden çıkarın.

Erlenmeyenin dış kısmını sterilize edin ve erlenmeyeni biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Hazırlanan dilüsyon besiyerini kültüre ekleyin. Transfeksiyondan sonra erlenmeyeni dört ila beş gün daha inkübatör çalkalayıcıya geri aktarın.

Daha önce gösterilen prosedürü uygulayarak hücre canlılığını günlük olarak izleyin. Transfeksiyondan beş ila altı gün sonra veya hücre canlılığı %50'nin altına düştüğünde, protein ekspresyon analizi için her gün alikotlar da saklanmalıdır. Hücreleri ve medyumu 1000 ×g'de beş dakika santrifüj ederek hücreleri hasat edin. Salgılanmış protein içeren süpernatantı toplayın; HEK hücre peletine 5 mL %10'luk çamaşır suyu çözeltisi ekleyin ve biyotehlike olarak atın.

Ardından, toplanan süpernatandan protein saflaştırılır. Bu ekspresyon sistemi, HK 2 93 F hücrelerinin geçici transfeksiyonundan sonra IgG one fc'nin bu tipik ekspresyon paterni ile gösterildiği üzere yüksek miktarda glikozillenmiş protein üretmiştir. IgG one FC için bir protein kolonu veya FC gama reseptör üç A ile histidin etiketli GFP için nikel kolon kullanılarak yapılan afinite saflaştırması, yüksek saflıkta proteinlerle sonuçlanmıştır.

Bu sistem, hidrojen çekirdeklerinin rezonans frekansı ile doğrudan bağlı amid azotunu ilişkilendiren bu iki boyutli NMR spektrumunda, izotopik olarak zenginleştirilmiş IgG one FC'yi verimli bir şekilde eksprese etmiştir. 15 atomun iyi dağılmış sinyalleri görülmüştür. Matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon kütle spektrometrisi analizlerinde gösterildiği üzere, farklı kültür koşulları altında HEK 2 93 F ve HEK 2 93 s hücreleri ile farklı gliko formlar üretilmiştir.

HEK 293 S hücrelerinde eksprese edilen IgG1 FC, beş adet manoz artı iki N-asetilglukozamin kalıntısından oluşan ve fukoz içermeyen glikanlara sahipti; HEK 293 F ekspresyon materyallerinden elde edilen glikanlar ise çekirdek fukoz içeren, çoğunlukla terminal N-asetilglukozamin içeren veya küçük bir oranda mono veya dilat formlarda olan kompleks tip biantennary formlardaydı. HEK 293 F hücreleri kullanılarak gerçekleştirilen bir ekspresyona glikanasyon inhibitörünün eklenmesi, fukoz inklüzyonunda %90'tan fazla azalma sağladı. Geçici transfeksiyon kurulumu bir kez öğrenildikten sonra, birinci günde 1,5 saatte ve ikinci günde 15 dakikada tamamlanabilir. Dört ila altı günlük bir ekspresyon süresinden sonra, proteini içeren çözelti 15 dakika içinde hasat edilebilir.

Son olarak, proteinin saflaştırılması yaklaşık 1,5 saat sürecektir; bu prosedürü uygularken, transfeksiyondan önce stabil bir kültür sürdürmeyi, aktif olarak büyüyen hücreleri transfekt etmeyi ve PEI eklemeden önce DNA eklemeyi hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, eksprese edilen glikoproteinin gelişimi sonrası yapısını ve fonksiyonunu incelemek amacıyla, bir dizi biyofiziksel teknik kullanılarak protein fonksiyonel karakterizasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların IgG'nin yapı-aktivite ilişkisini ve glikozilasyonu in vitro ve in vivo olarak incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, K 2 93 F hücreleri ve PZ N iki vektörü kombinasyonunu kullanarak glikoproteinlerin nasıl hazırlanacağı ve saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.