Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Bu prosedürün genel amacı, rekombinant proteinleri ER ve GOGI aracılı salgı yoluna hedefleyerek memeli glikoproteinlerini uygun memeli glikozilasyonu ile eksprese etmektir. Bu yöntem, bir spesifikasyonun rolü nedir, antikorların ve antikor fragmanlarının yapısındaki modeller ve immün aktivasyon potansiyeli gibi immünolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, insan proteinlerini ifade etmek için insan hücrelerini kullanmasıdır, bu da hedef proteinleri düzgün bir şekilde katlamak ve değiştirmek için uygun hücresel misyoneri sağlar.

Hücre oluşumu için inkübatör çalkalayıcı, kültür aşılamasından en az bir saat önce 135 RPM, %80 nem, %8 karbondioksit ve 37 santigrat derecede çalıştırılmalıdır. Biyogüvenlik kabininin UV lambasını açın, kapalı orta boy A ve orta B şişelerini 37 santigrat derece su banyosunda önceden ısıtın. UV ışıklarını kapatın ve biyogüvenlik kabinini %70 etanol ve su solüsyonu ile sterilize edin.

125 mililitrelik bir erlenmeyer büyüme şişesini havalandırmalı kapaklı pipetler, pipetleyiciler ve önceden ısıtılmış medya şişeleri ile su çözeltisinde %70 etanol püskürterek sterilize edin. Bu prosedür boyunca bu öğeleri biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Tüm ürünler biyogüvenlik kabinine getirilmeden önce bu şekilde sterilize edilmelidir.

26 mililitre ortam A ve üç mililitre ortam B'yi çekerek ve 125 mililitrelik erlenmeyer şişesine aktararak 30 mililitrelik bir kültür için taze kültür ortamı hazırlayın. Hücreleri kısmen çözmek için daha önce eksi 80 derecede donmuş bir HEK 2 93 F hücresi şişesini 37 santigrat derecede bir su banyosunda hafifçe çalkalayarak, ılık olarak karıştırın. Bu yaklaşık bir dakika sürer ve hücreler tamamen çözülmemelidir.

Daha sonra, şişenin dışını su çözeltisinde% 70 etanol ile sterilize edin ve biyogüvenlik kabinine taşıyın. Bir mililitrelik bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu geri çekin ve 29 mililitre taze kültür ortamı içeren 125 mililitrelik erlenmeyer şişesine aktarın. Kültür şişesinin kapağını kapatın ve şişeyi 24 saat boyunca inkübatör çalkalayıcıya yerleştirin.

Kültür aşılamasından 24 saat sonra. Hücre yoğunluğunu kontrol edin, kültür şişesini %70 etanol ve su çözeltisi ile sterilize edin ve biyogüvenlik kabinine taşıyın. Bir mililitrelik bir pipet ve pipetleyici kullanarak, kültürden 100 mikrolitreyi yavaşça çekin ve steril bir 0.5 mililitrelik einor tüpüne aktarın.

Kültür şişesinin kapağını kapatın ve kültür şişesini mümkün olan en kısa sürede inkübatör çalkalayıcıya geri koyun. 7.5 mikrolitre trian mavisi çözeltiyi 7.5 mikrolitre hücre ile karıştırın. Kuvvetlice karıştırın ve ardından karışımın 7,5 mikrolitresini bir sayma slaytına aktarın.

Otomatik hücre sayacını açın ve sayma sürgüsünü yükleme haznesine yerleştirin. Otomatik okuyucu etkinleştirilir ve hücreler otomatik olarak mililitre başına hücre sayısı ve canlılık yüzdesi birimlerinde sayılır. Mililitre başına 300.000 canlı hücre hücre yoğunluğu elde etmek için taze bir kültür ortamına transfer için gereken donör kültürünün hacmini belirleyin.

23 mililitre orta A ve üç mililitre orta B'yi 125 mililitrelik taze bir kültür şişesine aktararak daha önce gösterildiği gibi taze kültür ortamı hazırlayın. Bundan sonra, kontaminasyon riskini azaltmak için orta A ve orta B stok şişelerini biyogüvenlik kabininden çıkarın. HEK 2 93 F hücre kültürü şişesini inkübatörden alın.

Üzerine %70 etanol ve su solüsyonu püskürtün ve yeni bir pipet kullanarak biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Hücrelerin doğru alikotunu kültürden çekin ve taze kültür içeren şişeye aktarın. Orta. Her iki kültürü de biyogüvenlik kabininden inkübatör çalkalayıcıya aktarın.

Transfeksiyondan önce hücreleri mililitre başına yaklaşık iki ila 3 milyon canlı hücre yoğunluğuna kadar büyütün. Hücre yoğunluğunu daha önce gösterildiği gibi kontrol edin ve transfeksiyon için hücre miktarını belirleyin. Steril bir serolojik pipet kullanarak.

Uygun hacimde hücre süspansiyonunu 250 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri beş dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleme ile toplayın. Sterilizasyondan sonra, peletlenmiş hücreleri içeren tüpü biyogüvenlik kabinine aktarın.

Harcanan süpernatanı boşaltmak için steril bir pipet kullanın. Kültür ortamı, 10 mililitre taze kültür ortamı kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek peletlenmiş hücreleri kuvvetlice yeniden gönderir ve taze transfeksiyon kültürü içeren hazırlanmış bir şişeye aktarır. Orta. Havalandırmalı hücre kültürü şişesinin kapağını vidalayın ve hücreler inkübe edilirken şişeyi inkübatör çalkalayıcıda 15 dakika ila bir saat boyunca inkübe edin.

Plazma DNA'sını ve POLİETERAMİN veya PEI stoklarını taze kültür ortamı kullanarak mikrolitre başına 0.5 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin. Dağılmış hücrelerin bulunduğu kültür şişesini inkübatör çalkalayıcıdan çıkarın ve bir mikro pipet ve 300 mikrolitre plazma DNA'sı kullanarak kültüre biyogüvenlik kabinine alın ve 900 mikrolitre PEI'de nazikçe manuel çalkalayarak kültüre karıştırın ve tekrar karıştırın. Daha sonra 3.8 mililitre taze kültür ortamında.

Şişeyi 24 saat boyunca inkübatör çalkalayıcıya aktarın. Transfeksiyondan 24 saat sonra, hücre kültürü seyreltilmelidir. Önce seyreltme ortamını hazırlamak için, bir mililitre PREWARM 220 milimolar valproik asit veya VPA'yı çekmek için steril bir mililitre serolojik pipet kullanın ve steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Daha sonra, VPA çözeltisine beş mililitre ön ısıtma ortamı B ve 44 mililitre ön ısıtma ortamı A eklemek için steril bir serolojik pipet kullanın. Bu, 4.4 milimolar VPA'lık bir nihai konsantrasyona sahip 50 mililitre taze kültür ortamı ile sonuçlanır. Transfekte edilmiş kültürü inkübatörden alın.

Şişenin dışını sterilize edin ve şişeyi biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Hazırlanan seyreltme ortamını kültüre ekleyin. Şişeyi, transfeksiyonu takiben dört ila beş gün daha inkübatör çalkalayıcıya geri aktarın.

Daha önce gösterilen prosedürle hücre canlılığını günlük olarak izleyin. Alikotlar ayrıca protein ekspresyon analizi için her gün, transfeksiyondan beş ila altı gün sonra veya hücre canlılığı %50'nin altına düşerse, hücreleri artı ortamı beş dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyerek hücreleri hasat edin. Salgılanan proteini içerecek süpernatanı, HEK hücre peletine beş mililitrelik %10'luk bir ağartma solüsyonunda toplayın ve biyolojik tehlike olarak atın.

Daha sonra, protein toplanan süpernatanttan saflaştırılır. Bu ekspresyon sistemi, HK 2 93 F hücrelerinin geçici transfeksiyonundan sonra IgG bir fc'nin bu tipik ekspresyon modeli ile gösterilen yüksek bir glikosile protein verimi üretti. IgG için bir protein sütunu, bir FC veya histamin için nikel sütunu, FC gama reseptörü üç A ile etiketli GFP kullanılarak afinite saflaştırması, yüksek saflıkta proteinlerle sonuçlandı.

Bu sistem, hidrojen çekirdeklerinin rezonans frekansını ve doğrudan bağlı amid nitrojenini ilişkilendiren bu iki boyutlu NMR spektrumunda izotopik olarak zenginleştirilmiş IgG bir FC'yi verimli bir şekilde ifade etti. 15 atomun iyi dağılmış sinyalleri görüldü. Matris destekli lazer DESORPSIYON iyonizasyon kütle spektrometresi analizleri ile gösterildiği gibi, farklı kültür koşulları altında HEK 2 93 F ve HEK 2 93 s hücreleri ile farklı gliko formları üretildi.

HEK 2 93 s hücrelerinden eksprese edilen IgG bir FC, beş anos artı iki N asetil glukozamin kalıntısı içeren ve HEK 2 93 F eksprese materyalinden FU glukozan içermeyen bir formda olan ve çoğunlukla terminal N asetil glukozamin veya küçük bir oranda mono veya dilate formlara sahip olan kompleks tip bi güzergah formlarıdır. HEK 2 93 F hücreleri kullanılarak gerçekleştirilen bir ekspresyona bir glikan inhibitörünün eklenmesi, fuco dahil edilmesinde %90'dan fazla azalma gösterdi Bir kez ustalaştıktan sonra, geçici transfeksiyonun kurulması birinci gün 1.5 saat ve ikinci gün 15 dakika içinde tamamlanabilir. Dört ila altı günlük bir ekspresyon periyodundan sonra, proteini içeren çözelti 15 dakika içinde hasat edilebilir.

Son olarak, bu prosedürü denerken proteinin saflaştırılması yaklaşık 1.5 saat sürecektir, transfeksiyon transfektinden önce aktif olarak büyüyen hücrelerden önce stabil bir kültürü korumayı ve PEI eklemeden önce DNA eklemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben. Eksprese edilen glikoproteinin geliştirilmesinden sonra yapısını ve işlevini araştırmak için bir dizi biyofiziksel teknik kullanılarak protein fonksiyonel karakterizasyonu gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların IgG ve glikosilasyonun yapı, aktivite ilişkisini in vitro ve in vivo olarak keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bir K 2 93 F hücresi ve PZ N iki vektörü kombinasyonumuzu kullanarak glikoproteinlerin nasıl hazırlanacağını ve saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.