Modlu Moleküler Görüntüleme Uygulamaları için Biofunctionalized Prusya Mavisi Nanopartikülleri

Bu prosedürün genel amacı, multimodal moleküler görüntüleme ajanları olarak kullanılmak üzere biyofonksiyonelleştirilmiş Prusya mavisi nanopartikülleri sentezlemektir. Bu işlem, öncelikle MRI sinyalini artıran gadolinyum veya manganez iyonları içeren Prusya mavisi nanopartiküllerinin sentezlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, nanopartiküllerin yüzeyine floresan avadon ekleyerek floresan görüntüleme kabiliyeti kazandırmaktır.

Ardından, avadon kaplı nanoparçacıklar, istenen hücre hedefleme özelliğine sahip biyotinillenmiş antikorlarla biyofonksiyonelleştirilir. Son adım, biyofonksiyonelleştirilmiş nanoparçacıkların boyutları, zeta potansiyelleri ve zamansal stabiliteleri ölçülerek bir kalite kontrol kontrolü gerçekleştirmektir. Nihayetinde, biyofonksiyonelleştirilmiş nanoparçacıklar; floresan görüntüleme ve MRI kullanılarak, bir karışım içerisindeki belirli bir hedef hücre popülasyonunu görselleştirmek amacıyla multimodal moleküler görüntüleme uygulamalarında kullanılır.

Güncel ticari görüntüleme ajanları tipik olarak tek modludur ve yalnızca anatomik düzeyde çözünürlük sunarlar. Prusya mavisi nanopartikülleri, MRI ve floresan gibi iki tamamlayıcı görüntüleme modunu birleştirerek moleküler görüntülemeye ve hücre altı düzeylere olanak tanır. Multimodal nanopartiküllerin uygulamaları, tedavi yanıtlarının izlenmesinin yanı sıra kanser ve inflamatuar hastalıkların teşhisine kadar uzanmaktadır.

Bunun nedeni, biyofonksiyonelleştirilmiş nanoparçacıkların, vücudun belirli bir bölgesindeki bir hücre popülasyonunu hedefleyebilmesi ve onlara bağlanabilmesidir. Bu yöntem, kanser ve inflamatuar hastalıkların teşhisi ile tedaviye verilen yanıt hakkında bilgi sağlayabilmenin yanı sıra, moleküler görüntülemenin hassasiyet ve özgüllüğünden fayda sağlayacak diğer patolojik durumlara da uygulanabilir. Floresan ve MRI kullanarak, Prusya mavisi ve insan oral tüketimi için FDA onaylı bir ajanın tek aşamalı bir sentez şemasıyla stabil bir şekilde sentezlenebileceğini ve standart biyokonjugasyon teknikleriyle güçlü bir şekilde biyofonksiyonelleştirilebileceğini belirlediğimizde bu nanoparçacıkları üretme fikrini ilk kez geliştirdik.

Başlamak için, Çözelti A'yı hazırlamak amacıyla 5 ml deiyonize su içerisinde 5 molar potasyum heksasianoferrat(II) çözeltisi hazırlayın; ardından mangan Prusya mavisi nanopartiküllerinin sentezi için 10 ml deiyonize su içerisinde 2,5 milimolar demir(III) klorür ve 2,5 milimolar mangan(II) klorür içeren Çözelti B'yi hazırlayın. Diğer nanopartiküller metin protokolünde belirtildiği şekilde sentezlenebilir. Çözelti B'yi balon jojeye aktarın ve çözeltiyi oda sıcaklığında 1000 RPM hızında karıştırın.

Peristaltik bir pompa kullanarak, A çözeltisini kaba saatte 10 mililitre hızla damla damla ekleyin. A çözeltisinin eklenmesi tamamlandıktan sonra, karışımı 1000 RPM'de 30 dakika daha karıştırın. Ardından, karışımdan bir mililitrelik alikotları mikro santrifüj tüplerine aktarın ve her tüpe 0,2 mililitre beş milli sodyum klorür ekleyin.

Tüpleri 20,000 ×g'de en az 10 dakika santrifüjleyin ve ardından nanoparçacık peletini bırakacak şekilde süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Daha sonra, her pelete bir mililitre deiyonize su ekleyin. Nanoparçacıkları çözelti içinde sonikasyon ile eşit şekilde süspande etmek için bir mikro pipet ucu kullanın.

Son santrifüjden sonra süspansiyondaki başlangıç reaksiyon bileşenlerini uzaklaştırmak için nanoparçacıkları en az üç kez daha yıkayın, metin protokolünde açıklandığı gibi nanoparçacıkları floresan boya ile kapladıktan sonra nanoparçacıkları bir mililitre deiyonize su içerisinde yeniden süspande edin, biyotinize antikor stoklarını buzdolabından çıkarın. Burada anti-nöron glial antijen 2 ve anti-human eotaxin 3 kullanın. Biyotinize antikoru 0.2 µm naylon mikrosantrifüj filtresine aktarın ve ardından tüpü 14.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, Aden kaplı nanoparçacıkların her miligramı başına 0,05 mg veya daha az antikor ekleyin ve tüpleri ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kapatın. Tüpleri hafifçe çalkalayarak 4 °C'de iki ila dört saat inkübe edin. Antikorlar bağlandıktan sonra, tek kullanımlık plastik bir tüpe 990 µL deiyonize suyun içine 1 mg/mL konsantrasyonunda 10 µL nanoparçacık örneği ekleyin, tüpün kapağını kapatın ve karıştırmak için vorteksleyin.

Ardından, 173 derecelik bir ölçüm açısına sahip dinamik ışık saçılım sistemi kullanarak nanopartiküllerin ortalama boyutunu belirleyin. Öncelikle, karışık kültür tüpleri için mililitre başına yaklaşık 100.000 hücre konsantrasyonunda, PBS içerisinde 10 mililitrelik hücre süspansiyonları hazırlayarak başlayın; her bir hücre hattının farklı oranlarda bulunduğu tüpler, metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlanmalıdır. Hücreleri bloklamak ve spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için her tüpe 2 mililitre %5BSA ekleyin. Daha sonra her tüpe 1 mg/mL konsantrasyonunda 1 mililitre biyofonksiyonelleştirilmiş nanopartikül ekleyin ve karışımı bir saat boyunca inkübe edin.

Ardından, tüpleri 1000 ×g hızda beş dakika santrifüjleyerek ve peletleri 1 mL PBS içinde yeniden süspanse ederek hücreleri bağlanmamış nanopartiküllerden arındırmak için yıkayın. Bu işlemi en az iki kez daha tekrarlayın. Hücreleri PBS içinde %10 formaldehit kullanarak sabitleyin ve ardından hücreleri boyamak için PBS içinde 10 µg/mL seven amino actin ve mycin D ekleyin, tüpü 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve ardından hücreleri PBS ile yıkayın.

Ardından, örneği akış sitometresine yükleyin ve her örnekten 10, 000 kapılı hücreyi analiz edin. Floresan nanoparçacıklara bağlı hücrelerin lazer konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenmesine yönelik benzer bir prosedür metin protokolünde açıklanmıştır. Başlamak için, hücreleri T 75 flasklarda yaklaşık %80 konfluense ulaşana kadar büyütün ve ardından beş mililitre PBS ile hücreleri besiyerinden arındırmak için yıkayın.

Beş mililitre PBS içinde %1 BSA ekleyin ve hücreleri bir saat boyunca bloke edin. Ardından, nanopartiküllerin bağlanmasını sağlamak için balona beş mililitre mililitre başına 0,5 miligram antikor kaplı nanopartikül ekleyin ve hücreleri bir saat inkübe edin. Sonrasında, bağlanmamış nanopartikülleri uzaklaştırmak için hücreleri beş mililitre PBS ile üç kez durulayın.

Ardından, iki mililitre %0,25 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve hücrelerin flasktan ayrılması için hücreleri beş dakika inkübe edin. Tripsini nötralize etmek için sekiz mililitre DMEM ekleyin ve ardından hücre süspansiyonunu santrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri çöktürmek için onları 1000 ×g'de beş dakika santrifüjleyin.

Ardından, süpernatantı aspire edin ve hücreleri bir mililitre PBS içinde yeniden süspande edin. Hücreleri sabitlemek için bir mililitre PBS içerisinde %10 formaldehit ekleyin ve ardından her örnekten 100 mikrolitre ile 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Her kuyucuğa, deiyonize su içerisinde eritilmiş %1 agarozdan 100 mikrolitre ekleyin ve pipetleme yaparak karıştırın.

Bir fantom elde etmek için jelin 4 °C'de 12 saat boyunca katılaşmasını bekleyin. Jel katılaştıktan sonra, fantomu yatay bir 3 T klinik mıknatıs içerisinde, 2% agar'dan yapılmış 150 cm'lik küp bir blok yanına yerleştirin. Ardından, relaksasyon sürelerini ölçmek için fantomu ve agar bloğunu sekiz kanallı bir HD beyin bobininin merkezine sabitleyin; 96 kuyucuklu plakanın orta yüksekliğinden alınan 0,5 mm kalınlığındaki koronal kesitleri kullanın. Üretilen nanoparçacıkların hidrodinamik çapını belirlemek için dinamik ışık saçılım analizleri kullanılmıştır. Stabilite çalışmaları, nanoparçacıkların hem su bazlı hem de hücre besiyeri bazlı deneylerdeki uzun süreli stabilitesini doğrulamıştır.

Lazer konfokal mikroskopi, EOT three antikorları ile yüklenmiş floresan nanopartiküllerin spesifik olarak EOL one hücrelerinin yüzeyine bağlandığını göstermiştir. NG two antikorları kullanıldığında ise, bunlar spesifik olarak BSG nörosferlerin yüzeyine bağlanmıştır. Biyo-fonksiyonalize nanopartiküllerin, akış sitometrisi ile ölçüldüğü üzere, hedeflenen hücre popülasyonunu floresanla başarılı bir şekilde işaretleyebildiği görülmüştür.

Ek olarak, nanopartiküller, düşük hedef hücre/kontrol hücresi oranlarında bile bir karışım içerisindeki spesifik bir hücre alt popülasyonunu hedefleyebilmiştir. Son olarak, biyofonksiyonelleştirilmiş nanopartiküller, hedef hücrelerin MRI kontrastını artırmıştır; nng yüklü nanopartiküllerle işlem gören hücreler, kontrol partikülleriyle işlem gören hücrelere kıyasla T1 ağırlıklı sekanslarda hiperintensite göstermiştir.

Buna karşılık, A NNG iki nanoparçacık, kontrol parçacıklarına kıyasla T iki ağırlıklı sekanslarda hipointensite sağlamıştır. Bir kez ustalaşıldığında, biyofonksiyonelleştirilmiş prusya mavisi nanoparçacıkların sentezi, doğru şekilde gerçekleştirilirse iki gün içinde tamamlanabilir.

Bu prosedüre benzer şekilde, yeni hastalıkları ve yeni durumları araştırmak için nanopartiküller farklı biyopolimerler ve hedefleme ligandları ile biyofonksiyonelleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre popülasyonlarını işaretlemek amacıyla floresan ve görüntüleme uygulamaları için Prusya mavisi nanopartiküllerinin nasıl sentezleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Klinik MRI mıknatısında çalışmalar yürütürken güvenlik yönergelerine ve standart çalışma prosedürlerine titizlikle uymayı unutmayın.