Modlu Moleküler Görüntüleme Uygulamaları için Biofunctionalized Prusya Mavisi Nanopartikülleri

Bu prosedürün genel amacı, multimodal moleküler görüntüleme ajanlarının kullanımı için biyo-işlevselleştirilmiş Prusya mavisi nanopartiküllerini sentezlemektir. Bu, ilk olarak MRI sinyalini artıran gadolinyum veya manganez iyonları içeren Prusya mavisi nanopartiküllerin sentezlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, floresan görüntüleme yeteneği sağlayan nanopartiküllerin yüzeyine floresan avadon yapıştırmaktır.

Daha sonra, avadon kaplı nanopartiküller, biyotinile antikorları hedefleyen istenen hücre ile biyo işlevselleştirilir. Son bir adım, boyutlarını, zeta potansiyellerini ve zamansal stabilitelerini ölçerek biyo-işlevselleştirilmiş nanopartiküller üzerinde bir kalite kontrol kontrolü yapmaktır. Sonuç olarak, biyo-işlevselleştirilmiş nanopartiküller, floresan görüntüleme ve MRI kullanarak bir karışım içinde belirli bir hedeflenen hücre popülasyonunu görselleştirmek için multimodal moleküler görüntüleme uygulamalarında kullanılır.

Mevcut ticari görüntüleme ajanları tipik olarak tek modludur ve sadece anatomik düzeyde çözünürlük sunar. Prusya mavisi nanopartiküller, iki tamamlayıcı görüntüleme modunu, MRI ve floresanı birleştirir ve moleküler görüntüleme ve hücre altı seviyelere izin verir. Multimodal nanopartiküllerin uygulamaları, tedavi yanıtlarının izlenmesine ek olarak kanser ve enflamatuar hastalıkların teşhisine kadar uzanır.

Bunun nedeni, biyo-işlevselleştirilmiş nanopartiküllerin vücudun belirli bir bölgesindeki bir hücre popülasyonunu hedefleyebilmesi ve bağlanabilmesidir. Bu yöntem, kanser ve inflamatuar hastalık tanısı ve tedaviye yanıt hakkında bilgi verebilse de, moleküler görüntülemenin duyarlılığı ve özgüllüğünden yararlanacak diğer patolojik durumlara da uygulanabilir. Floresan ve MRI kullanarak, bu nanopartikülleri üretme fikrine ilk olarak, insan oral tüketimi için Prusya mavisi ve FDA onaylı ajanın, tek bileşenli bir sentez şeması kullanılarak kararlı bir şekilde sentezlenebileceğini ve standart biyo konjugat teknikler kullanılarak sağlam bir şekilde biyo işlevselleştirilebileceğini belirlediğimizde sahip olduk.

Başlamak için, 2.5 milimolar demir, üç klorür ve 2.5 milimolar manganez içeren bir sonraki onarım solüsyonu B'yi yapmak için beş mililitrede iki deiyonize su olmak üzere 5 milyon molar potasyum hekza, sano ferrate çözeltisi hazırlayın. Manganez Prusya mavisi nanopartiküllerin sentezi için 10 mililitre deiyonize suda iki klorür. Diğer nanopartiküller, metin protokolünde belirtildiği gibi sentezlenebilir, çözelti B'yi A yuvarlak tabanlı şişeye aktarın ve çözeltiyi oda sıcaklığında 1000 RPM'de karıştırın.

Peristaltik bir pompa kullanarak, saatte 10 mililitre hızında kabın içine damla damla bir çözelti ekleyin. Çözelti A'nın eklenmesi tamamlandıktan sonra, karışımı 1000 RPM'de 30 dakika daha karıştırın. Daha sonra karışımın bir mililitrelik alikotunu mikro santrifüj tüplerine aktarın ve her tüpe 0.2 mililitre beş mili sodyum klorür ekleyin.

Tüpleri en az 10 dakika boyunca 20.000 kez G'de santrifüjleyin ve ardından nanopartiküllerin peletini bırakarak supinatı dikkatlice çıkarın. Ardından, her pelete bir mililitre deiyonize su ekleyin. Nanopartikülleri sonikasyon ile çözelti içinde eşit şekilde askıya almak için bir mikro uç kullanın.

Son dönüşten sonra ilk reaksiyonun bileşenlerini süspansiyondan çıkarmak için nanopartikülleri en az üç kez daha yıkayın, nanopartikülleri metin protokolünde açıklandığı gibi floresan den ile kapladıktan sonra nanopartikülleri bir mililitre deiyonize su içinde yeniden süspanse edin, biyotinile antikor stoklarını buzdolabından çıkarın. Burada. Anti nöron glial antijen iki ve anti-insan eotaksin üç kullanın. Biyotinile antikoru 0.2 mikro naylon mikro füj filtresine aktarın ve ardından tüpü 10 dakika boyunca 14.000 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra, Aden kaplı nanopartiküllerin miligramı başına 0.05 miligram veya daha az antikor ekleyin ve tüpleri ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayın. Tüpleri dört santigrat derecede iki ila dört saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Antikorları taktıktan sonra, tek kullanımlık plastik bir vete içinde 990 mikrolitre deiyonize suya mililitre nanopartikül numunesi başına 10 mikrolitre bir miligram ekleyin, vete'yi kapatın ve karıştırmak için V ekleyin.

Daha sonra, 173 derecelik bir ölçüm açısına sahip dinamik bir ışık saçılma sistemi kullanarak nanopartiküllerin ortalama boyutunu belirleyin. Karışık kültürler için mililitrede yaklaşık 100.000 hücre konsantrasyonunda PBS'de 10 mililitrelik hücre süspansiyonları hazırlayarak başlayın, her hücre hattının değişen oranlarını içeren tüpler, metin protokolünde açıklandığı gibi% 5 BS, A hücreleri bloke etmek ve spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için her tüpe. Daha sonra mililitre başına bir mililitre bir miligram ekleyin, nanopartikülleri her tüpe biyo olarak işlevsel hale getirin ve karışımı bir saat boyunca inkübe edin.

Daha sonra, tüpleri beş dakika boyunca 1000 kez G'de döndürerek hücreleri bağlanmamış nanopartiküllerden arındırın ve peletleri bir mililitre PBS'de yeniden bükün. Bu işlemi en az iki kez daha tekrarlayın. Hücreleri PBS'de% 10 formaldehit kullanarak sabitleyin ve daha sonra hücreleri lekelemek için PBS'ye mililitre başına 10 mikrogram, yedi amino aktin ve misin D ekleyin, tüpü 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve ardından hücreleri PBS ile durulayın.

Ardından, numuneyi akış sitometresine yükleyin ve her numuneden 10.000 kapılı hücreyi analiz edin. Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak floresan nanopartiküllere bağlanan görüntü hücrelerine benzer bir prosedür metin protokolünde açıklanmaktadır. Başlamak için, T 75 şişelerindeki hücreleri yaklaşık% 80 birleşim noktasına kadar giyin ve ardından hücreleri beş mililitre PBS ile ortamdan arındırın.

PBS'ye beş mililitre %1 BSA ekleyin ve hücreleri bir saat boyunca bloke edin. Daha sonra, şişeye mililitre antikor kaplı nanopartiküller başına beş mililitre 0.5 miligram ekleyin ve nanopartiküllerin bağlanmasına izin vermek için hücreleri bir saat inkübe edin. Daha sonra, bağlanmamış nanopartikülleri çıkarmak için hücreleri beş mililitre PBS ile üç kez durulayın.

Daha sonra iki mililitre% 0.25 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreleri şişeden ayırmak için hücreleri beş dakika inkübe edin. Tryin'i söndürmek için sekiz mililitre DMEM ekleyin ve ardından hücre süspansiyonunu santrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri peletlemek için beş dakika boyunca 1000 kez G'de döndürün.

Daha sonra, supinatı aspire edin ve hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri sabitlemek için PBS'ye bir mililitre% 10 formaldehit ekleyin ve ardından her numunenin 100 mikrolitresini 96 kuyulu düz tabanlı bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Her kuyucuğa 100 mikrolitre erimiş %1'lik aros deiyonize su ilave edilerek yukarı ve aşağı pipetlenerek karıştırılır.

Bir fantom elde etmek için jelin 12 saat boyunca dört santigrat derecede katılaşmasına izin verin. Jel katılaştıktan sonra, fantomu 150 santimetrelik katı bir küp %2 agar bloğunun yanına yatay üç T klinik mıknatısa yerleştirin. Daha sonra, gevşeme sürelerini ölçmek için fantomu ve agar bloğunu sekiz kanallı bir HD beyin bobininin merkezine sabitleyin, 96 kuyulu plakanın orta yüksekliğinde alınan 0,5 milimetre kalınlığında koronal dilimler kullanın, oluşturulan nanopartiküllerin hidrodinamik çapını belirlemek için dinamik ışık saçılma testleri kullanıldı, stabilite Çalışmalar, nanopartiküllerin uzun vadeli stabilitesini doğruladı, hem su bazlı hem de hücre ortamı bazlı deneylerde kullanılıyor.

Lazer konfokal mikroskopi, özellikle EOL bir hücrelerinin yüzeyine bulunan EOT üç için antikorlarla yüklü floresan nanopartikülleri gösterdi. Bir NG iki için antikorlar kullanıldığında, bunlar spesifik olarak BSG nörosferlerinin yüzeyine bağlanır. Biyo-işlevselleştirilmiş nanopartiküller, akış sitometrisi ile ölçüldüğü gibi hedeflenen hücre popülasyonunu başarılı bir şekilde floresan olarak etiketleyebildi.

Ek olarak, nanopartiküller, hücre oranlarını kontrol etmek için düşük hedef hücrede bile bir karışımdaki belirli bir hücre alt popülasyonunu hedefleyebildi. Son olarak, biyo işlevselleştirilmiş nanopartiküller, hedeflenen hücrelerin, bir nng ile yüklenmiş nanopartiküllerle tedavi edilen hücrelerin MRI kontrastını arttırdı. İki antikor, kontrol partikülleri ile tedavi edilen hücrelere kıyasla T bir ağırlıklı sekanslarda hiperintensite gösterdi.

Buna karşılık, A NNG iki nanoparçacığı, kontrol parçacıklarına kıyasla T iki ağırlıklı dizide hipo yoğunluk sağladı. Bir kez ustalar. Biyofonksiyonelleştirilmiş presion blue nanopartiküllerin sentezi, uygun şekilde gerçekleştirilirse iki gün içinde tamamlanabilir.

Bu prosedüre benzer şekilde, nanopartiküller, yeni hastalıkları ve yeni koşulları araştırmak için farklı biyopolimerler ve hedefleme ligandı ile biyo işlevsel hale getirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre popülasyonunu etiketlemek için floresan ve görüntüleme uygulamaları için Prusya mavisi nanopartiküllerin nasıl sentezleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Klinik MRG mıknatısındaki çalışmaları yürütmek için güvenlik yönergelerini ve standart çalışma prosedürlerini titizlikle takip etmeyi unutmayın.