Name: Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Öğrenin, mikrotoroid optik rezonatörler ve frekans kilitleme kullanarak etiketsiz tek molekül algılama yöntemini. Bu teknik, protein katlanması ve bağlanma kinetiği gibi biyokimyasal araştırmalarda kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, kısmen Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden Ulusal Araştırma Hizmeti Ödülü (T32GM07616) tarafından desteklenmiştir.

1. Deneysel Kurulum ve Numune Hazırlama <ol><li> , Litografi kullanarak gravür ve daha önce 6 açıklanan prosedür erime microtoroids Üretiyor. Tipik olarak 80-100 um büyük bir çapa ve 2 um küçük bir çapa sahip olan, bir silikon göbek (çip) üzerinde microtoroids üretmektedirler. </li><li> Kabaca kendi fiber makaradan tek modlu fiber optik (125 mikron kaplama, 4.3 mikron mod alan çapı) bir metre gevşeyin. </li><li> Fiber optiğin çözülür bölümünün ortasında, tel şeritler kullanılarak optik elyafın yaklaşık polimer kaplama gibi küçük bir bölümünü (2.5 cm) şerit. Not: Bu microtoroid içine evanescently birkaç ışığa kullanılacak fiber optiğin kısmıdır. </li><li> Izopropanol alkol ve ücretsiz silin bir tüy bırakmayan soyulmuş lif temizleyin. </li><li> Tutucu mıknatıs yapılan bir lif tutucu kullanılarak yerinde lif bu bölümünü tutun. </li><li> Meltin tarafından ~ 500 nm İnce elimden lifg ve hidrojen meşale ve 60 mm / dak zıt yönlerde hareket eden iki step motorlar kullanılarak çekme. ~ 10 mm boyunda olmalıdır alev üst kısmı, iç fiber optik yerleştirin. Fiber boyunca transmisyon (kapalı fiber yanıp yanal olarak dağılmış ve ışık izleme) veya bir osiloskop bağlanmış bir foto diyot için elyafın bağlanması yoluyla görsel olarak izlenebilir olan dalgalı durduğunda lif çekme durdurma . </li><li> Fiber optik bir ucunu yarmak ve çıplak fiber adaptöre takın. Foto alıcı girişine içine lif bu ucunu yerleştirin. </li><li> Fiber çift fiber optik bağlayıcı kullanılarak lazer fiber makaranın diğer ucu. </li><li> Epoksi veya çift taraflı bant kullanarak bir numune tutucu üstüne microtoroid çip (paslanmaz çelik, 37.8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) yerleştirin. </li><li> (3 eksenli nano konumlandırma içeren bir konumlandırma kademesinin üzerine numune tutucuyu monte n3 eksenli mikrometre üstünde anocube) aşama (ekipman listesine bakınız). Titreşimleri en aza indirmek için bir pnömatik izole optik masa üzerindeki tüm deneyler. </li><li> Kaba pozisyon 3 eksenli mikrometre kullanarak örnek çip. </li><li> Nano-pozisyoner kullanarak optik fiber microtoroid içeren çip paralel hizaya getirin. Not: Giriş ışığı (~ 633 nm) bir dalga boyunun bir mesafede microtoroid hizalayın. Bu sürecin görselleştirme için iki görüntüleme sütunları kullanın üstünde ve çip tarafında konumlandırılmış (objektif lens ve kamera ile boru, ekipman listesine bakınız). </li><li> Bir in-line polarizasyon kontrolörü kullanarak optik fiber üzerinden yönlendirilen lazer ışığının polarizasyonu Optimize kutuplaşmayı ayarlamak için bir düğme ile (ekipman listesine bakınız). Not: fiber optik iletimi ölçülen dip dar göründüğünde Optimum polarizasyon elde edilir. Bir osiloskop (Daha fazla bilgi için adım 2.2) Bu dalış gözlemleyin. </li><li> Inşa etmekbir aralama olarak cam mikroskop lamı kullanılarak örnek sahne üzerinde bir cam lamel epoxying bir örnek odası. Not: Tüm kurulum kapsayan pleksiglas muhafaza hava akımları en aza indirmek için yararlı olabilir. Küçük bir açıklık boru kullanılarak pompalanan edilecek çözelti sağlamak için bırakılmalıdır. </li><li> Isı, bir RT su banyosunda (~ 500 mi) içinde ≥ 1 saat boyunca tanecik süspansiyonlar ya da tek-molekül sulu çözeltileri dengeye getirin. Not: Örnekler üreticiler, örneğin PBS veya HEPES belirtilen ilgili tamponlar kullanılarak mikrosantrifüj tüpleri içinde istenen konsantrasyona seyreltilir. Hiçbir bağlayıcı olay tespit edilirse, tampon tuz konsantrasyonu artırır. </li><li> ~ 2 sn çözümler (1 ml) kısaca içeren Vortex parçacık. </li><li> 1 ml numune bölmesine partikül içeren çözeltiler enjekte / 1 ml şırınga pompası kullanılarak Min. </li><li> Numune odası doldurdu sonra, şırınga pompası kapatın. </li><li> Kayıt verileri en aza indirmek için önce 30 saniye bekleyinölçümünü etkileyebilecek sıvı akışı kaynaklanan mekanik titreşimler etkileri. </li></ol> 2. Frekans Kilitleme <ol><li> Bağlama sıvısının enjeksiyonu nedeniyle rahatsız olacak çünkü, nanopositioner numune tutucu hareket ettirerek fiber optik için toroid-çift Re. </li><li> Dalga boyu çeşitli yoluyla bilgisayar kontrollü giriş lazer tarama microtoroid rezonans dalga boyu bulun. Lazerin dalga boyunu düzenleyen lazer denetleyicisi içinde piezoelektrik eleman bir üçgen dalga gerilim sinyali göndererek bu adımı gerçekleştirin. Bu dalga boyunda suyun ışık düşük emme olarak orada görünür ışığı (2.5 nm ± 635 nm) kullanarak deneyler yapın. </li><li> Oto-dengeli foto alıcı içine fiber optik çıkışını takarak fiber optik aracılığıyla ışık geçirgenliği ölçün. BNC kablosu kullanarak bir osiloskop içine foto alıcı çıkışını takın. O gözlemleyinn osiloskop microtoroid rezonans dalga boyunda optik fiber üzerinden iletim düşer. </li><li> Bir kablo ile geribildirim denetleyicisi (ekipman listesine bakınız) kilitleme frekansı ana girişine foto alıcı çıkışını takın. </li><li> 2 kHz titreşim frekansı ve 19 fm dalga boyu titreşim genliği ile kilitleme üstü tepe kullanarak kilitlenme modunda frekans kilitleme geribildirim denetleyicisi çalıştırın. Ampirik Ziegler-Nichols ayar kurallarını 14 kullanarak yazılım penceresindeki oransal-integral-türev ayarlarını. Not: Bu değerler tüm deneyler başında bir kez ayarlanması yeterlidir. </li><li> Microtoroid rezonans dalga boyuna lazerin dalga boyu otomatik kilitleyin. Numune odasını doldurduktan sonra bu adımı gerçekleştirin. Not: dalgaboyu kayması çok büyükse, o zaman geri denetleyici kilidi kaybedecek ve otomatik rezonans dalgaboyu yerini bulmak için tarama moduna. Bu ocDalga boyu Curs yaklaşık bir çizgi genişliği (araştırılan tüm sistemler için en az 600 fm) daha büyük kaydırır. </li><li> 24 bit veri toplama kartı kullanarak 20 kHz geribildirim denetleyicisi çıkışını kaydedin. Veri toplama yazılımı ile bir metin dosyası olarak veri verir. </li></ol> 3. Veri İşleme ve Analiz <ol><li> Fourier MATLAB&#39;da verileri dönüştürmek. </li><li> Düşük 2 kHz dayatılan taklidinin frekansını çıkarmak için 1 kHz bir kesim ile bir &quot;tuğla duvar&quot; filtre kullanarak veri geçmek (Yan Kod Screenshot 1 Dosya bakınız). </li><li> Hesaplama çentik 16 Hz pencere boyutunu kullanarak verileri süzmek. Not: Bu, bu durumda, gürültü bilinen kaynaklarını ortadan kaldırmak için yapılır, 60 Hz, elektronik hat gürültüsü ve harmonikleri, (lazer sürücüsünden gelen) yanı sıra, 100 Hz ve harmonik (Yan Kod Screenshot 1 Dosya bakınız). </li><li> Ters Fourier zaman alanına geri verileri dönüştürmek. </li><li> Medyan filtre penceresini kullanarak veri1001 örneklerin boyutu (Yan Kodu Screenshot 2 Dosya bakınız). </li><li> Kerssemakers ve ark., 15 adım bulma algoritması kullanılarak rezonans dalga adım değişiklikleri bulun. </li><li> Her bağlama aşamasında genliği histogramları oluşturun. </li><li> Denklem kullanarak parçacık boyutunu hesaplayın. (1) (Tartışma). </li></ol>

<ol><li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li>
<li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li>
<li>Knight, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnight%2C+A+%22Single+molecule+biology%22">Single molecule biology</a>. , Elsevier/Academic. (2009).</li>
<li>Jonsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+biospecific+interaction+analysis+using+surface+plasmon+resonance+and+a+sensor+chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology.</a> BioTechniques. 11, 620-627 (1991).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispering-gallery-mode+biosensing%3A+label-free+detection+down+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li>
<li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li>
<li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li>
<li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
<li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li>
<li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li>
<li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li>
<li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li>
<li>Åström, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%85str%C3%B6m%2C+KJ+%22Feedback+systems+%3A+an+introduction+for+scientists+and+engineers%22">Feedback systems : an introduction for scientists and engineers</a>. , Princeton University Press. (2008).</li>
<li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li>
<li>Su, T. -T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Label-free+detection+of+single+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%22">Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators</a>. , California Institute of Technology. (2014).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bir parçacık bağlanan olarak, toroid artar rezonans dalgaboyu (λ). Bir parçacık keser ise, rezonans dalga boyu buna (a step-down olayı) azalır. Parçacık çapı (d), her dalga boyunda adım amplitüdü histogramları yoluyla belirlenebilir. Her dalga boyu basamağın yüksekliği bağlı parçacık büyüklüğü varyasyonları nedeniyle partikül bağlayan microtoroid üzerinde konumu nedeniyle değişir. Parçacıklar elektrik alan (E 0, max) maksimum olduğu microtoroid ve ekvatorda bağladığınızda r...

Tek moleküllü saptama deneyleri Hastalığın erken teşhisi için biyosensörler kullanılan analit miktarının azaltılması için faydalıdır, ve moleküllerin 3 temel özelliklerini incelemek için. Bu tür deneyler, tipik olarak etiketler, bununla birlikte, etiketler her olay üzerinde çalışılan yapabilirliğini bozmakta ve bu, maliyet artışı, belirli bir protein için elde etmek mümkün değildir, ve özellikle de bünyesinde deneyleri veya nokta-of, gerçek süre, rahatsız edici olabilir kullanılarak gerçekleştirilir bakım teşhis. Etiket içermeyen biosensörleme şu anki altın standart Ancak, ticari yüzey plazmon rezonans sistemi tipik haliyle nM mertebesinde tespit tipik bir alt sınırı, yüzey plazmon rezonans 4&#39;tür. Son zamanlarda, optik rezonatörler etiket içermeyen tek bir molekül biodetection 5 için umut verici bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Uzun vadeli (ns) dayalı optik rezonatörler çalışma ışığı 6,7 hapsi. Işık evanescently olduğunutipik bir fiber optik aracılığıyla bu cihazların içine birleştiğinde. Fiber geçiyor ışığın dalga boyu rezonatör rezonans dalga boyu eşleştiği zaman, verimli rezonatör çiftler yanar. Bu birleştirilmiş ışık tamamen dahili rezonatörün çevresinin yakınında genliği azalan bir alan üreten rezonatörün en boşluk içinde yansıtır. Parçacıklar rezonatör, parçacığın 8 hacmi ile orantılı olarak rezonatör değişiklikleri rezonans dalgaboyu kaybolan alan ve bağlayıcılığı girerken. Algılama yeteneği açısından mikrosfer rezonatörler daha önce tek bir influenza A virüs partiküllerini (100 nm), 9,10 tespit etmek için kullanılmıştır. Son zamanlarda, plasmonically geliştirilmiş mikroküre optik rezonatörler Ancak bu yaklaşım de yüzde 0.3 um ila 2 tane çekim alanı sınırlar molekülleri 11 ve 8-mer oligonükleotitlerin 12 albumin, tek sığır serumu tespit etmek için kullanılmaktadıryardımcısı. Büyük çekim alanı biyosensörler parçacık algılama şansını maksimize etmek için idealdir. Büyük (&gt; 100 mikron 2) yakalama alanları ile Güncel çözüm tabanlı etiket içermeyen biyoalgı teknolojileri polistiren tanecikleri ≥ 25 nm tespit sınırlı kalmıştır. Bu çözelti içinde tek moleküllerin zamana bağımlı algılama kapasitesine sahip optik Whispering Evanescent Resonator (çiçek) 13 (Şekil 1) kilitleme Frekans olarak bilinen optik rezonatör teknolojisine dayalı bir etiket içermeyen biyo-algılayıcı sistemi geliştirmiştir. ÇİÇEK frekans kilitleme geri besleme kontrolü, dengeli algılama ve tek bir protein molekülleri aşağı küçük partikülleri tespit etmek için hesaplamalı filtreleme ile birlikte microtoroid optik rezonatörlerin uzun foton ömrünü kullanır. Frekans kilitleme kullanımı süpürüp veya lazer dalga boyu üzerinden tarama gerek kalmadan, parçacıklar bağlamak gibi sistem daima microtoroid kayması rezonans izlemenize olanak sağlarBüyük aralığındadır. Çiçeğin ilkeleri plasmonik geliştirilmesi de dahil olmak üzere diğer tekniklerin algılama yeteneklerini geliştirmek için kullanılabilir. Aşağıda, ÇİÇEK gerçekleştirmek için prosedürler açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Ayarlanabilir diyot lazer</td><td>Newport</td><td>TLB-6300</td><td></td></tr><tr><td>Lazer denetleyici</td><td>Newport</td><td>TLB-6300-LN</td><td></td></tr><tr><td>Frekans kilitleme geri besleme denetleyicisi</td><td>Toptica Photonics</td><td>Digilock 110</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik dengeli fotoğraf alıcısı</td><td>Newport</td><td>Model 2007</td><td></td></tr><tr><td>Hat içi polarizasyon kontrolörü</td><td>Genel Fotonik</td><td>PLC-003-S-90</td><td></td></tr><tr><td>24 bit veri toplama kartı</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-4461</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan interlökin-2</td><td>Pierce Biyoteknoloji</td><td>R201520</td><td></td></tr><tr><td>20 nm polistiren boncuklar</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td></td></tr><tr><td>NanoCube XYZ Piezo Sahne</td><td>Fiziği Enstrümant</td><td>P-611.3</td><td></td></tr><tr><td>Optik tablo</td><td>Newport</td><td>VH3660W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme sütunu için objektif lens</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme sütunu (adaptör tüpü)</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme sütunu için Yüksek Çözünürlüklü CCD kamera</td><td>Edmund Endüstriyel Optik</td><td>NT39244</td><td></td></tr></tbody></table>

microtoroid optik rezonatörler kullanarak etiket serbest tek molekül algılama

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Aşağı tek bir molekül sınırına moleküllerinin küçük konsantrasyonlarını algılama gibi Hastalığın erken teşhisi ve moleküllerin davranışına temel çalışmaları gibi alanlarda bir etkiye sahiptir. Tek molekül algılama teknikleri yaygın, ancak etiket maliyeti ve karmaşıklığı artırmak, her zaman mevcut değildir ve olaylar çalışılan perturb böyle floresan etiket veya kuantum noktaları gibi etiketler kullanır. Optik rezonatörler ve etiket kullanılmaksızın tek moleküllerin tespit için umut verici bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Şu anda çözelti içinde olmayan plasmonically geliştirilmiş çıplak optik rezonatör sistemi tarafından tespit edilen en küçük parçacık 25 nm polistiren küre 1&#39;dir. Biz Optik Whispering Evanescent Resonator sulu çözelti 2 etiket içermeyen tek bir molekül algılama bu sınırı aşmak ve elde edebilirsiniz (ÇİÇEK) Kilitleme Frekans olarak bilinen bir teknik geliştirdiler. Sinyal gücü partikül hacmi ile ölçekler gibi, bizim çalışma&gt; 100x improveme temsilnt sanatın mevcut durumu üzerinde gürültü oranı (SNR) sinyalde. İşte ÇİÇEK arkasında prosedürleri alanındaki kullanımını artırmak amacıyla sunulmuştur.

Olayları bağlayıcı Parçacık açıkça zaman (Şekil 2A) üzerinde microtoroid rezonans dalga adım gibi değişiklikler olarak görülmektedir. Bu adımların yükseklikleri. Şekil 2B&#39;de, bir histogram olarak gösterilen 2-4, sırasıyla Örnek eksozom bağlanma izleri (nanovesicles), 5 mil silika boncuklar ve tek bir insan interlökin-2 moleküllerinin Şekil edilir. Adım gibi olaylar parçacık boyutu ile ölçek gerçeği tekniği doğru yapılmış olduğunu gösterir. Aşağıda t...

Çözeltideki tek molekülleri tespit edebilen Frekans Kilitlemeli Optik Fısıldayan Evanescent Rezonator (FLOWER) olarak bilinen optik rezonatör teknolojisine dayalı, etiketsiz bir biyoalgılama sistemi geliştirdik. Burada bu çalışmanın arkasındaki prosedürler açıklanmakta ve sunulmaktadır.

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Bu prosedürün genel amacı, optik rezonatör teknolojisi ve frekans kilitlemeye dayalı bir teknik kullanarak, etiketleme yapmadan tekil molekülleri ve ultra küçük nanoparçacıkları tespit etmektir. Bu yöntem; protein katlanması ve bağlanma kinetiği gibi biyokimyasal alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hedef molekülün tespit edilebilmesi için etiketlenmesine gerek duyulmamasıdır.Bu teknik için kurulum, bir mikro OID çipinin bir optik fibere bağlanmasını içerir. İlk olarak, bir mikro OID çipi temin edin. Bu, üzerinde mikro OID üretilmiş, yaklaşık olarak 6,5 milimetre çarpı 5,5 milimetre boyutlarında bir silikon çiptir.Bu görüntüde olduğu gibi, mikro OID 80 ile 100 mikrometre arasında bir majör çap ve iki mikrometre bir minör çapa sahiptir. Şimdilik çipi kenara koyun ve çipi kuplajlamak için fiberi hazırlayın. Bir makara üzerindeki tek modlu fiberle çalışın ve fiberin yaklaşık bir metresini çözün.Kablo soyucuları alın ve çözülmüş fiberin yaklaşık ortasına getirin. Polimer kaplamanın fiberden 2,5 santimetrelik bir segmentini soymak için bunları kullanın. Bu soyulmuş bölge, fiberin kuplaj bölgesidir.Fiber soyulduktan sonra, soyulan bölgeyi temizlemek için tüy bırakmayan bir bez ve izopropanol alkol kullanın. Ardından, temizlenen kısmı sabit tutmak için manyetik kelepçeli bir fiber tutucu kullanın. Bir sonraki adım için, fiberi zıt yönlere doğru çekecek şekilde düzenlenmiş step motorlar hazırlayın.Sıyırma bölgesinin her iki tarafındaki fibere step motorların takılabilmesi için fiber tutucuyu konumlandırın. Ayrıca, ışık kaynağı olarak hizmet etmesi için fiberin bir ucuna bir lazer takın. Fiberi germek için step motorları zıt yönlerde hareket ettirmeye başlayın ve fiberin sıyrılmış kısmını eritmek için bir hidrojen pürmüzü kullanın.Fiberden yanal olarak saçılan ışığı sürekli olarak izleyin. Yanıp sönme, fiber üzerinden gerçekleşen ışık iletiminin dalgalandığını ve daha fazla inceltme gerektiğini gösterir. Yanıp sönme durduğunda, ısıtmayı ve fiberi çekmeyi bırakın; bu aşamada fiber yaklaşık 500 nanometers kalınlığa inmiş olacaktır.Fiber inceltildikten sonra, ışık kaynağını ayırın ve fiberi ve manyetik kıskaç tutucusunu step motorlardan çıkarın. Ardından, fiberi konumlandırma tablası ile donatılmış pnömatik olarak izole edilmiş bir tezgâha taşıyın. Fiberi, manyetik kıskaç tutucusuyla birlikte örnek çipinin önündeki bir destek bloğu üzerine yerleştirin.Konumlama tablası, üç eksenli bir mikrometre üzerinde yer alan üç eksenli bir nano konumlama tablasıdır. Nano konumlama tablasına ek olarak, hizalamaya yardımcı olmak için üst ve yan görünüm görüntüleme kolonları bulunmaktadır. Fiberin sıyrılmış kısmının konumlama tablasına yakın olduğundan emin olarak çalışmaya devam edin.Liflerin boş ucunu ölçüm sistemine yerleştirmeye hazırlanın. Boş ucu kestikten sonra, bir çıplak lif adaptörüne yerleştirin. Lifin, bir osiloskoba bağlı olan otomatik dengeli bir foto alıcının girişine bağlanması için adaptörü kullanın.Şimdi fiberin diğer ucuna odaklanın. İlk olarak, bu ucu bir optik kuplöre bağlayın. Ardından fiberi, 50 50 ışın bölücü ve ATT ayarlanabilir diyot lazerden giriş alan bir hat içi polarizatörün çıkışına bağlayın.Şu ana kadar yapılan bağlantıların şeması burada verilmiştir. Işın ayırıcının ikinci çıkışının hat içi bir polarizörden geçtiğine ve otomatik dengeli foto alıcı için referans olarak kullanıldığına dikkat edin. Bir sonraki adım, paslanmaz çelik bir numune tutucu kullanarak mikro OID çipinin montajına hazırlanmaktır.Çipi numune tutucuya sabitlemek için çift taraflı bant kullanın. Ardından mikro çipi numune tutucunun üzerine yerleştirin. Şimdi, üzerinde çip bulunan numune tutucuyu nano konumlandırma tablasına monte edin.Burada tutucu ve çip, üç eksenli mikrometreli konumlandırma tablası üzerinde yerleştirilmiştir. Numune çipini fiberle ilgili olarak kaba şekilde konumlandırın. Burada, kaba konumlandırma tamamlandıktan sonraki çip ve fiber görülmektedir.Ardından, konumlandırıcıyı daha fazla ayarlayın ve çipi optik fibere paralel hale getirmek için görüntüleme kolonlarını kullanın. Lazer dalga boyuna sahip bir mikro OID ile, bu görüntü bir fiber ve mikro t'ye aittir. Hassas konumlandırma adımından sonra, görüş alanının merkezine yakın olan dairesel çıkartma bir konumlandırma yardımcısıdır. Şimdi mikro yapının rezonans dalga boyunu aramaya geçin.Lazer dalga boyunu yaklaşık 635 nanometre artı veya eksi 2.5 nanometre düzeyinde düzenlemek için üçgen dalga formunda bir voltaj sinyali oluşturun. Şimdi, rezonansı aramak için dalga boylarını tarayın. Fiber üzerinden gerçekleşen iletimi osiloskopta gözlemleyin.Rezonans dalga boyunda geçirgenliğin düştüğüne dikkat edin. Bu noktada lazer ışığının polarizasyonunu ayarlamak için çalışın. Optik fiberdeki lazer ışığının polarizasyonunu optimize etmek için hat içi polarizasyon denetleyicilerini ayarlayın.Foto alıcının çıktısını osiloskopla görüntüleyin ve ölçülen transmisyon çöküntüsü en dar hale gelene kadar polarizasyonu ayarlayın. Polarizasyonu optimize ettikten sonra, numune tablası üzerinde bir numune hücresi oluşturun.Hücre, bir mikroskop lamına epoksi ile sabitlenmiş bir cam lamelden oluşur. Lam, lamelin çip ve fiberin üzerine taşmasını sağlayan bir ara parça görevi görür. Deney örneklerini hücreye dakikada 1 mL hızla aktarmak için bir mililitrelik şırınga pompası ve boru hattı düzenleyin.Ardından, pompaya yüklemek için oda sıcaklığında dengelenmiş bir mililitrelik bir örnek hazırlayın. Bu örnek, beş nanometre silika boncuk içeren bir çözeltidir. Yükleme tamamlandığında, örnek haznesini gözlemleyin ve örnek enjeksiyonunu gerçekleştirin; hazne dolduğunda işlemi durdurun. Beş nanometre silika boncuk içeren çözelti ile dolan bu haznede örnek enjeksiyonu durmuştur.Titreşim etkisini en aza indirmek için 30 saniye bekledikten sonra, mikroya ait rezonans dalga boyunu arayın. Rezonanstaki çökme ve fiber üzerinden iletimi osiloskop kullanarak tekrar gözlemleyin. Bu, oransal integral türev veya PID kontrolörü de içeren, bu aşamadaki deneysel düzeneğin şemasıdır.İntegratör ve dither. Denetleyiciyi, tepe noktasının üst kısmına kilitleme (top of peak locking) ile otomatik kilitleme modunda çalıştırın. Dither frekansını iki kilohertz'e ve dalga boyu salınım genliğini 19 femto meters'a ayarlayın.PID ayarları ampirik olarak belirlendikten sonra, lazerin dalga boyunu mikro oid'in rezonans dalga boyuna otomatik olarak kilitleyin. Geri besleme kontrolörünün çıktısını kaydederek verileri toplayın. Burada, boyut sırasına göre üç farklı bağlanma partikülü kullanılarak bir protokol ile üretilen, saniye cinsinden zamana karşı femtometre cinsinden rezonans kaymasının temsili izleri yer almaktadır.Partiküller ekzozomlar veya nano veziküllerdir. Beş nanometre silika boncuklar ve insan interlökin iki molekülleri. Her veri setindeki hem dikey hem de yatay AE'lerin farklı ölçeklerine dikkat edin.Farklı partikül boyutları için verilerde farklı ölçeklerin gözlemlenmesi, tekniğin doğru şekilde uygulandığının bir göstergesidir. Bir partikül OID'ye bağlandığında, OID'nin rezonans dalga boyu artar ve bu durum izde yukarı yönlü bir basamağa neden olur. Bir partikül ayrıldığında ise rezonans dalga boyu azalır ve bu da aşağı yönlü bir basamağa yol açar.Her bir dalga boyu basamağının yüksekliği, parçacığın boyutu ve mikro oid üzerindeki konumu tarafından belirlenir. Zaman ölçekleri ise parçacık OID dinamikleri ile belirlenir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem doğru şekilde yürütülürse yaklaşık üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, her şeyin mümkün olduğunca temiz ve tozsuz tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

label-free-single-molecule-detection-using-microtoroid-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biyosensörler karmaşık, biyolojik ortamlar ile arayüz ve yüzey modifikasyonu ile sensör takılı derece spesifik problar ile çok hassas sensörler birleştirerek hedeflenen algılaması gerçekleştirmek. Burada, sensör ve biyolojik çevre köprü silan ajanlar kullanılarak biotin ile silika optik sensör yüzeyi fonksiyonlandırmalar göstermektedir.

Silan Kaplin Ajanlar kullanarak Silika Optik Biyosensörler için Biyolojik Probları takılması

Biz serbest duran mikroküreler ve on-chip microtoroids dahil silika rezonans kaviteler, imal etmek, bir karbondioksit lazer reflow tekniğinin kullanımı açıklanır. Reflow yöntemi her iki cihaz içinde uzun foton yaşamlar sağlayan, yüzey kusurları kaldırır. Çıkan cihazlar telekomünikasyon gelen biodetection kadar uygulamaları sağlayan, ultra yüksek kalite faktörleri var.

Silika Ultra Yüksek Kalite Faktörü Microresonators Fabrikasyon

Bu video, tek bir hücreden protein salgılarını tespit etmek için lokalize yüzey plazmon rezonans görüntülemeyi gösterir. Mikroakışkan bir kurulum ve peptit bağlı bir plazmonik nanoyapı çipi kullanarak, rezonans açısında yansıyan ışık yoğunluğundaki değişiklikler, tek bir hücreden salgılanan proteinlerle etkileşimleri ortaya çıkarır.

Tek Bir Hücreden Protein Salgılarını Tespit Etmek için Lokalize Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme

Floresan çekirdekli microcavity sensörler silika mikrokapilerler kanal yüksek indeks kuantum nokta kaplama kullanır. Kılcal kanal neden içine pompalanan akışkan kırılma indisi değişiklikler kanal orta analiz etmek için de kullanılabilir microcavity floresan spektrum içinde kayar.

Refraktometrik Algılama Floresan çekirdekli mikro kavitasyonlar sentezi ve İşletilmesi

Nanodetection için istenmeyen lazer seğirme gürültü çıkarmak için tasarlanmış bir referans interferometresi tekniği, ultra-yüksek kalite faktörü microcavity tarama için kullanılır. Montajı, kurulumu ve veri toplama için Talimatları kavite kalite faktörünü belirlemek için ölçüm işlemi yanında, sağlanmaktadır.

Nanodetection için bir referans Interferometer Uygulanması

Parametrik optomekanik uyarımlar, optik radyasyon basıncı ve uyarılmış Brillouin saçılması yoluyla mikroakışkan optomekanik rezonatörlerde yakın zamanda deneysel olarak gösterilmiştir. Bu makale, optomekanik salınımların üretilmesi ve doğrulanması için metodolojilerle birlikte bu mikroakışkan rezonatörlerin imalatını açıklamaktadır.

Fabrikasyon ve mikroakışkan optomechanical Osilatörler Testi

Geleneksel optik manipülasyon tekniklerinin ölçeklenebilirliği ve çözünürlüğü kırınım ile sınırlıdır. Kırınım sınırını aşıyoruz ve yakın aralıklı C-şekilli plazmonik rezonatörlerden oluşan bir yol ile desenlenmiş altın bir yüzey kullanarak nanoparçacıkları bir çip boyunca optik olarak taşıma yöntemini açıklıyoruz.

Bir Nano-Optik Konveyör Bant imalatı ve İşletilmesi

Damlacık mikroakışkanlarında çok renkli floresan algılama, tipik olarak hacimli ve karmaşık epifloresan mikroskobu tabanlı algılama sistemlerini içerir. Burada, tek bir fotodetektör tarafından toplanan çok renkli verileri geçici olarak kodlamak için bir dizi optik fiber kullanan kompakt ve modüler çok renkli bir algılama şemasını açıklıyoruz.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Bu makale, tasarımdan fabrikasyona ve karakterizasyona kadar bir silisyum nitrür membran rezonatörünün yaşam döngüsünü izlemektedir.

High-Q Silisyum Nitrür Membran Rezonatörlerinin İmalatı ve Karakterizasyonu

Öğrenin, mikrotoroid optik rezonatörler ve frekans kilitleme kullanarak etiketsiz tek molekül algılama yöntemini. Bu teknik, protein katlanması ve bağlanma kinetiği gibi biyokimyasal araştırmalarda kullanılabilir.

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Daha fazla video keşfet