İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Bu prosedürün genel amacı, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen peral nöronlardan dendritik dikenleri görüntülemek ve bunları üç boyutta ölçmektir. Bu, ilk olarak nöral kök hücrelerin kültürlenmesi için altı oyuklu plakadaki kapak kaymalarının poliüretan ve laminin ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra kültürde seyreltilmiş nöral kök hücreler.

Ortam, hafif bir döner pipet hareketi kullanılarak kaplanır ve kültürde 70 güne kadar farklılaşmasına izin verilir. Besiyerini düzenli olarak yenileyerek, hücreler anti GFP antikorları ile boyanmış GFP lentivirüsü ile transdüksiyona tabi tutulur ve görselleştirilir. Son olarak, kültürler sabitlenir ve dendritik dikenler konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir.

Sonuç olarak, insan dendritik dikenlerinin görüntü verileri, sınıflandırılmaları ve niceliklerinin belirlenmesi için 3D olarak yeniden yapılandırılır. Bu protokol, insan beyin korteksinin iki ila dördüncü katmanının glutamaterjik nöronlarını elde etmek için aşamalı bir prosedür sağlar. Daha önce yayınlanmış yönteme dayalı olarak insan fibroblastından köken alan insan kaynaklı pre potent kök hücrelerden türetilen nöral kök hücrelerin kullanımını içerir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlerimizden en büyük avantajı, DON sağının ve PY'nin 3D olarak otomatik segmentasyonuna izin vermesidir. Bu, tipik olarak yalnızca 2D analizden hazırlanan mevcut yazılımlara göre kayda değer bir zaman kazancı sağlar. Sınıflandırmalardaki döner ve casus da çok kullanışlı ve kullanımı kolaydır.

Nöronal kültürleri hazırlamak için, cam kapak fişlerini altı kuyucuklu kültür kabına yerleştirin ve ertesi gün bir akış başlığı altında gece boyunca poli ornitin inkübe edin. Kapak fişlerini üç kez yıkamak için DPBS'yi kullanın ve laminin ekleyin, en az 10 saat boyunca bir akış başlığı altında inkübe edin. Aşağıdaki bileşenleri içeren kültür ortamını hazırlayın.

Daha sonra, insan IPSC'den türetilmiş nöronları dönüştürmek için hücre kümelenmesini azaltmak için yavaş dönen hareketlerle pipetleme, santimetre kare başına 50.000 hücre yoğunluğunda nöral kök hücreleri veya NSCS'yi plakalamak ve göndermek için ortamı kullanın. Olgunlaşmanın herhangi bir aşamasında, taze kültür ortamı içeren kültür kuyusu başına 40 nanogram GFP lentiviral vektörü içeren bir stok çözeltisinden bir mikrolitre ekleyin ve 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri immünofloresan için hazırlamak için, kültür ortamını çıkarın ve dönüştürülen hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika sabitlemek için% 4 formaldehit kullanın.

Ardından, hücreleri her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkamak için bir XPBS kullanın. Daha sonra, kapak fişlerini %0,05 Triton X %110 at serumu ile desteklenmiş PBS'ye batırın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından kapak fişlerini üç kez yıkamak için PBS'yi kullanın.

Her kapak fişine 100 mikrolitre PBS% 4 at serumunda bir 1000. GFP birincil antikoru ekleyin. Gece boyunca dört santigrat derecede karanlık bir kutuda inkübe edin. Şimdi Alexa Fluor 4 88 konjuge antikoru bir'i PBS'de %0.5 ile 20 arasında 200'e seyreltin ve slaytları üç kez yıkamak için PBS'yi kullandıktan sonra hücreleri antikor solüsyonu ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Floresan mikroskobu için slaytları monte etmek için montaj ortamını kullanın. Konfokal bir mikroskop altında, dendrit başına 60 ila 100 mikrometreyi ölçmek için bir parametal morfolojisi ve bir kıvrım dendritik arborizasyon ile durum başına en az 10 sağlıklı nöron seçin. 40 x na, 1.3 yağ objektifi ve 488 nanometre lazerle yaklaşık 20 mikro watt örnekleme düzeyinde tipik bir tepe gücüne sahip görüntüler elde edin, piksel boyutunu 80 nanometre civarında uygun şekilde örneklenmiş dendritik dikenlere ayarlayın.

Tüm nöron hacmini örneklemek için, 150 ila 300 nanometre arasında bir Z aralığına sahip bir Z yığını elde edin ve dendritik dikenlerin 3D nicelleştirmesini gerçekleştirmek için 20 ila 30 Z dilimi elde edin. Analiz yazılımının ön işleme için aşağıdaki ayarları kullanın. Görüntü işleme yumuşatma Gauss filtresini seçerek Gauss filtrelemesini kullanın.

Filament izleyici modülünden dendritlerin yarı otomatik izlemesini gerçekleştirmek için filtre genişliğini XY düzlemindeki piksel boyutuna eşit olarak ayarlayın. Dilim sekmesinde, dendrit çapını tahmin etmek için uzaklık aracını kullanın. Sonraki aşılan sekmede, filamentler aracına tıklayın ve daha iyi sağlamlık için otomatik oluşturmayı atla'yı seçin Çizim sekmesinde.

Şimdi sunulan bir yöntem olarak otomatik yolu, bir tür olarak dendriti seçin ve tahmini dendrit çapını girin. İşaretçinin seçim modunu kullanarak, imleci bir kutuya çevirin ve shift tuşunu seçin ve dendrit başlangıç noktasına sağ tıklayın. Yazılım ilk hesaplamaları yapacaktır.

Şimdi işaretçiyi başlangıç noktasından dendrit boyunca hareket ettirin. En olası dendrit yolunu temsil eden sarı bir çizgi gösterilir. Shift tuşuna basın ve sola basın.

Modül arayüzünde otomatik omurga segmentasyonu gerçekleştirmek için dendrit uç noktasına tıklayın. Yeniden oluşturma açılır listesindeki oluşturma sekmesine tıklayın. Dendrit çapını yeniden oluştur'u seçin ve verileri sakla kutusunu işaretleyin.

Ardından yeniden oluştur'u tıklayın. Eşiği, segmentli hacim gerçek dendrit hacmine karşılık gelecek şekilde ayarlayın. Bir algoritma olarak, mesafe haritasından en kısa mesafeyi seçin.

Ardından dilim sekmesinin altındaki sonraki düğmesine tıklayın, en küçük omurgayı, kafa çapını ve maksimum uzunluğu belirleyin. Ardından aşma sekmesinin altında, minimum çap için 200 ila 300 nanometre ve maksimum uzunluk için dört mikrometre civarında parametre değerlerini girin, dikenlere izin ver kutusunu işaretlemeden başlangıç noktalarıdır, sonraki düğmeye tıklayın. Ardından, tohum noktaları eşiğini, dikenleri temsil eden mavi noktalar gerçek omurga başlarına lokalize olacak şekilde ayarlayın.

Ardından ileri'ye tıklayın. Çekirdek hesaplama şimdi gerçekleştirilecek ve modül arayüzünün araçlar sekmesi altında dikenleri sınıflandırmak zaman alabilir, omurgayı sınıflandır'a tıklayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi dört sınıf olduğunu doğruladıktan sonra, modül arayüzü, sınıflandırmanın sonuçlarıyla birlikte dört yeni filament nesnesi oluşturacaktır.

Son olarak, tüm istatistikleri dosyaya aktar'a tıklayarak istatistikler sekmesi altındaki istatistiksel verileri dışa aktarın. Bu şekil, bir anti beta üç tübülin antikoru olarak etiketlenmiş insan nöronlarının kültürünü göstermektedir. Hücre kümelenme eğilimi burada da belirgindir.

Burada, geç kortikal progenitörden farklılaşmadan 40 gün sonra GFP etiketli bir parametal nöron gösterilmektedir. Yüzeysel kortikal tabakalardan. İç kısım, görünen hücre gövdesi ile daha düşük bir büyütme gösterir.

Bu paneller, olgunlaşmanın farklı aşamalarında dendritik diken segmentlerinin 3D rekonstrüksiyonunu temsil eder. Omurga yoğunluğu ve omurga başı hacminin kantitatif analizi burada gösterilmiştir. Beklendiği gibi, bu iki parametre kültür periyodu boyunca artar.

Kültür prosedürü denenirken, hücre kolinini azaltmak için nöro kök hücrelerin hafif bir dönme hareketi ile yavaş yavaş eklenerek çok dikkatli bir şekilde plakalanması ve dağıtılması önemlidir. Aslında, bu yöntem bireysel nöronların tanımlanmasını gerektirir.