İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Bu prosedürün genel amacı, insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücrelerden türetilen periferal nöronlardaki dendritik dikenleri görüntülemek ve bunları üç boyutlu olarak nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle altı kuyucuklu plakalardaki lamellerin, nöral kök hücrelerin kültüre edilmesi için poliüretan ve laminin ile işlem görmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, nöral kök hücreler kültür ortamında seyreltilir.

Besiyeri, hafif dairesel bir pipet hareketi kullanılarak plaklara aktarılır ve kültürde 70 güne kadar farklılaşmeye bırakılır. Besiyerinin düzenli olarak yenilenmesinin ardından hücreler, anti-GFP antikorları ile boyanmış GFP lentiviriüsü ile transdükse edilir ve görüntülenir. Son olarak, kültürler fikse edilir ve dendritik dikenler konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir.

Nihayetinde, insan dendritik dikenlerinin görüntü verileri, sınıflandırılmaları ve nicelleştirilmeleri için 3 boyutlu olarak yeniden yapılandırılır. Bu protokol, insan beyin korteksinin ikinci ila dördüncü tabakalarındaki glutamaterjik nöronların elde edilmesi için adım adım bir prosedür sunmaktadır. Bu işlem, daha önce yayınlanmış yönteme dayanarak, insan fibroblastlarından türetilen insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinden elde edilen nöral kök hücrelerin kullanımını içerir.

Mevcut yöntemlerimize kıyasla bu tekniğin temel avantajı, DON sağ ve PY'nin 3D olarak otomatik segmentasyonuna olanak sağlamasıdır. Bu durum, genellikle yalnızca 2D analizler yapan mevcut yazılımlara göre belirgin bir zaman kazancı sağlar. donr ve spy sınıflandırmaları aynı zamanda oldukça kullanışlı ve kolaydır.

Nöronal kültürler hazırlamak için, cam lamelleri altı kuyucuklu kültür kaplarına yerleştirin ve poli-ornitin ekleyip bir laminar akışlı kabinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, lamelleri üç kez yıkamak için DPBS kullanın ve laminin ekleyip bir laminar akışlı kabinde en az 10 saat inkübe edin. Aşağıdaki bileşenleri içeren kültür ortamını hazırlayın.

Ardından, insan iPSC kaynaklı nöronları transdüse etmek için, hücre kümelenmesini azaltmak amacıyla yavaş döndürme hareketleriyle pipetleme yaparak, nöral kök hücreleri (NSC'leri) santimetrekare başına 50.000 hücre yoğunluğunda plakalara ekmek ve dağıtmak için medyumu kullanın. Olgunlaşmanın herhangi bir aşamasında, taze kültür medyumu içeren her bir kültür kuyucuğuna, 40 ng GFP lentiviral vektör içeren stok çözeltiden 1 µL ekleyin ve 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. Hücreleri immünofloresans için hazırlamak amacıyla, kültür medyumunu uzaklaştırın ve transdüse edilmiş hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %4 formaldehit kullanarak sabitleyin.

Ardından, hücreleri her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez XPBS ile yıkayın. Daha sonra, lamelleri %0,05 Triton X 110 ve %10 at serumu eklenmiş PBS içine daldırın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Son olarak, lamelleri üç kez PBS ile yıkayın.

Her bir lam örtü camına, 100 µL PBS %4 at serumu içinde 1/1000 oranında GFP primer antikoru ekleyin. Bir karanlık kutuda 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ardından, Alexa Fluor 488 konjuge antikoru PBS %0,5 tween 20 içinde 1/200 oranında seyreltin; lamları PBS ile üç kez yıkadıktan sonra hücreleri antikoru çözeltisi ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Floresan mikroskobu ile incelemek üzere lamları bağlama ortamı kullanarak kapatın. Konfokal mikroskop altında, her koşul için perimetal morfolojiye ve katlanmış dendritik arborizasyona sahip en iyisi 10 sağlıklı nöron seçerek dendrit başına 60 ile 100 mikrometre arasını nicelendirin. Görüntüleri 40 x na, 1.3 yağ daldırma objektif ve örnek düzeyindeki tipik tepe gücü yaklaşık 20 mikro watt olan 488 nanometrelik bir lazer ile elde edin; dendritik dikenlerin uygun şekilde örneklenmesi için piksel boyutunu yaklaşık 80 nanometre olarak ayarlayın.

Tüm nöron hacminden örnekleme yapmak için, dendritik dikenlerin 3D kantifikasyonunu gerçekleştirmek amacıyla 20 ila 30 Z dilimi sağlayacak şekilde 150 ila 300 nanometre Z aralıklarıyla bir Z stack alın. Ön işleme için analiz yazılımında aşağıdaki ayarları kullanın. Görüntü işleme düzleştirme Gaussian filtresini seçerek Gaussian filtreleme uygulayın.

Filament izleyici modülündeki dendritlerin yarı otomatik izlemesini gerçekleştirmek için filtre genişliğini XY düzlemindeki piksel boyutuna eşit olarak ayarlayın. Kesit sekmesinde, dendrit çapını tahmin etmek için mesafe aracını kullanın. Ardından, daha iyi bir sağlamlık için aşılan sekmesinde filamentler aracına tıklayın ve çizim sekmesinde otomatik oluşturmayı atla seçeneğini belirleyin.

Şimdi yöntem olarak "auto path", tip olarak "dendrite" seçin ve tahmini dendrit çapını girin. İmlecin seçim modunu kullanarak imleci bir kutucuğa dönüştürün, ardından Shift tuşuna basılı tutarak dendrit başlangıç noktasına sağ tıklayın. Yazılım ilk hesaplamaları gerçekleştirecektir.

Şimdi imleci başlangıç noktasından itibaren dendrit boyunca hareket ettirin. En olası dendrit yolunu temsil eden sarı bir çizgi gösterilmektedir. Shift ve sol tuşuna basın.

Modül arayüzünde otomatik spinal segmentasyon gerçekleştirmek için dendrit uç noktasına tıklayın. Yeniden oluşturma (rebuild) açılır listesindeki oluşturma (creation) sekmesine tıklayın. Dendrit çapını yeniden oluşturu (rebuild dendrite diameter) seçeneğini belirleyin ve verileri koru (keep data) kutucuğunu işaretleyin.

Ardından yeniden oluştur (rebuild) seçeneğine tıklayın. Segmentlere ayrılmış hacim gerçek dendrit hacmine karşılık gelecek şekilde eşiği ayarlayın. Algoritma olarak, mesafe haritasından en kısa mesafeyi (shortest distance from distance map) seçin.

Ardından, slice sekmesinin altındaki next butonuna tıklayın; en küçük dikensi çıkıntı (spine), baş çapı ve maksimum uzunluğu belirleyin. Daha sonra surpass sekmesi altında, parametre değerlerini girin; minimum çap için 200 ila 300 nanometre ve maksimum uzunluk için dört mikrometre uygun başlangıç noktalarıdır. "allow spines" kutucuğunu işaretlemeden next butonuna tıklayın. Sonraki adımda, dikensi çıkıntıları temsil eden mavi noktalar gerçek spine başlarında konumlanacak şekilde seed points eşik değerini ayarlayın.

Ardından "next"e tıklayın. Temel hesaplama şimdi gerçekleştirilecektir ve zaman alabilir. Modül arayüzündeki araçlar (tools) sekmesi altında, "classify spine" seçeneğine tıklayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi dört sınıf olduğu doğrulandıktan sonra, modül arayüzü sınıflandırma sonuçlarını içeren dört yeni filament nesnesi oluşturacaktır.

Son olarak, istatistikler sekmesi altındaki tüm istatistikleri dosyaya aktar seçeneğine tıklayarak istatistiksel verileri dışa aktarın. Bu şekil, anti beta three tubulin antikoru ile işaretlenmiş insan nöron kültürünü göstermektedir. Hücre kümelenme eğilimi burada da belirgindir.

Burada, geç dönem kortikal progenitörden farklılaşmasından 40 gün sonra GFP ile işaretlenmiş bir parametal nöron gösterilmektedir. Süperfisyal kortikal tabakalardandır. Küçük resim, hücre gövdesinin belirgin olduğu daha düşük büyütmeli bir görüntüyü göstermektedir.

Bu paneller, olgunlaşmanın farklı aşamalarındaki dendritik diken segmentlerinin 3B rekonstrüksiyonlarını temsil etmektedir. Diken yoğunluğunun ve diken başı hacminin kantitatif analizi burada gösterilmiştir. Beklendiği üzere, bu iki parametre kültür süresi boyunca artış göstermektedir.

Kültür prosedürü uygulanırken, hücre kümelenmesini azaltmak için hücreler nazik bir döndürme hareketiyle yavaşça eklenerek nöral kök hücrelerin çok dikkatli bir şekilde plaklara yayılması ve dağıtılması önemlidir. Nitekim bu yöntem, bireysel nöronların tanımlanmasını gerektirmektedir.