Name: İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Keşfedin, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerden türetilmiş piramidal nöronlarda dendritik spine'lerin üç boyutlu nicelenmesi yöntemini. Konfokal mikroskopi ile sinaptik yapıları inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Institut Pasteur, Bettencourt-Schueller vakfı, Centre National de la Recherche Scientifique, Paris Diderot Üniversitesi, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), Conny-Maeva Yardım Vakfı, Cognacq Jay Vakfı, Orange Vakfı ve Fondamental Vakfı. LG, Sağlık Bakanlığı'ndan bir lisans bursu ile desteklenmektedir. Bu çalışmanın ilk aşamasında BitPlane'in, özellikle de Georgia Golfis'in yardımına teşekkür ederiz.

1. Nöronal Kültür Not: pluripotent kök hücreleri yeniden programlama Fibroblast geç kortikal atalarıdır dorsal telencephalon soy, türetme, büyütme ve bankacılık bağlılık (LCP) Boissart ark 4 tarif edildi. LCP benzeri hücrelerin nöronal farklılaşma, aynı zamanda hafif değişiklikler Boissart et al 4&#39;e göre gerçekleştirilmiştir. Diğer prosedürler nöronlar içine farklılaşma ardından uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine doğrudan fibroblastların yeniden programlama için geliştirilmiştir. O piramidal Glutamaterjik nöronların seçici üretimine izin verir, çünkü bu protokol muhafaza edildi. <ol><li> Poli-ornitin (DPBS 1/6 seyreltildi, stok konsantrasyonu% 0.01) DPBS içinde üç kez yıkanması izler O / N, cam lamelleri ile 6 oyuklu kültür plakaları tedavi edin. Daha sonra bir akış hunisi altına, en az 10 saat süre ile laminin (1 mg / ml, DPBS içinde 500 defa seyreltilmiş stok konsantrasyonu) ekleyin<html> . </li><li> Plaka ve düşük yoğunlukta NSC sevk N2 ekinin (50.000 hücre / cm2), cam DMEM / F12 oluşan kültür ortamının 3 ml lamelleri (500 mi), 2 şişeler 6 oyuklu kültür plakaları içinde (her biri 5 mi), B27 ekinin 2 şişeler (10 mL) ekstrakte edildi, Pen-Streptomisin (10 ml Penisilin = ml Streptomisin = 10.000 birim / ml 10.000 ünite /), 2-merkaptoetanol, 1 ml (stok çözeltisi: 50 mM) ve laminin (1 / 500), büyüme faktörleri olmadan. KRİTİK ADIM: Hücre kümeleme azaltmak için yavaş dönen hareketlerle hücreler ekleyerek dikkatle bu adımı uygulayın. </li><li> Kültür ortamı çıkarın. Cam lameller üzerine eklenmiş nöron tutmak topaklaşmayı önlemek için taze laminin çözeltisi 2 ug / ml ihtiva eden taze ortam N2B27 ekleyin. Her 3 günde orta değiştirin. Kurutma hücre önlemek için taze ortam ilave edilmeden önce kalan ortamı (200 ul) bir kısmını muhafaza edin. Alternatif olarak, daha hızlı ilerler ve toplam hacmin (3 mi) değiştirin. </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. lentiviral İletimi Not: GFP lentiviral vektörler nazik Institut Pasteur Uwe Maskos Laboratory (Paris) tarafından sağlanan ve yayınlanan bir protokolün 5&#39;e göre hazırlandı. GFP ekspresyonu fare fosfogliserat kinaz (PGK) promoteri tarafından tahrik edilir. Bu çalışma için, bir viral titresi 400 ng / ul (PBS 1x stok çözelti) oldu. <ol><li> Kültür başına GFP lentiviral vektör de (6-yuvalı plakalar), 40 ng ihtiva eden stok çözeltisi 1 ul ekleyerek viral partiküllerin yolu ile olgunlaştırma herhangi bir aşamasında, insan iPSC türetilmiş nöronlar transdüksiyonu ve taze kültür ortamı içinde 48 saat süreyle inkübe edilir. Not: Bu protokol için inkübasyon süresi omurga yapılarının iyi bir etiketleme verir. </li></ol> 3. İmmünofloresan Not: Bütün omurga morfolojisinin etiketleme geliştirmek için, immüno-floresan etiketlemesini permeabilize koşullarında bir anti-GFP antikor kullanılarak gerçekleştirilmiştir. </p&gt; <ol><li> Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle% 4 paraformaldehid içinde lamelleri transduse hücreleri kültür ortamı çıkarın ve gidermek ve ardından 1 x PBS içinde (10 dk) 3 kez yıkayın. </li><li> PBS içinde Immerge mistery lamelleri% 0.05 Triton (100x) ve oda sıcaklığında 1 saat süre ile,% 10 at serumu ile desteklenmiş, daha sonra 1 x PBS içinde 3 kez yıkayın. </li><li> 1x PBS 100 ul% 4 at serumu ve primer antikor (1/1000), GFP karşı ortaya her lamel 1000 kat seyreltildi ile takviye ekleyin. Bir karanlık kutu O inkübe / N 4 ° C&#39;de, daha sonra 1 x 3 defa PBS ile yıkayın. </li><li> PBS Tween 20% 0.5 ile takviye edilmiş olarak ve Alexa Fluor 488-konjuge antikor (1/200) seyreltin ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. Sonra 1x PBS içinde 3 kere yıkayın ve floresan mikroskobu için montaj orta ile cam slaytlar lamelleri monte edin. </li></ol> 4. Dendritik Omurga Görüntüleme <ol><li> Konfokal lazer tarama mikroskobu ile konfokal Görüntüleme gerçekleştirin. </li><li> Piramidal morfoloji a ile sağlıklı nöronlar seçinnd tam dendritik arborization ve ayrı deneylerden elde edilen durumda en az 10 nöronlar ölçmek. Dendritin başına 100 mikron - 60 ölçmek. </li><li> 20 uW etrafında örnek düzeyinde tipik bir zirve gücü ile NA objektif 1.3 = 40X yağ ve GFP uyarma için 488 nm lazer hattı kullanarak görüntüleri edinin. 80 nm çapında belirle piksel boyutu düzgün dendritik dikenler örnek. Not: Gürültü dendritler ve dikenler doğru segmentasyon taviz vermeyen hangi bir görüntü için daha sonra analiz çağrısı. Yukarıda belirtilen mekansal örnekleme ve güç ayarları ile, 3.15 ms&#39;den piksel bekleme zamanı böyle bir görüntü oluşturmak için yeterli fotonları toplamak için yeterli olduğu görülmektedir. Loş numuneler için, görüntü kalitesi 2 ila 4 tarama ortalama geliştirilebilir. Birkaç XY çini satın alma daha sonra birlikte işlemeden önce dikişli gereken ilgi bölgeyi kapsayacak şekilde gerekli olabilir. </li><li> Ile, Z-yığını elde, tüm nöron hacmi örnekZ 20 30 Z dilimleri, sonuçta 150 nm ila 300 nm arasında değişen aralığı. Not: Bu ayarlarla elde yanal uzaysal çözünürlüğü 234 nm ve eksenel çözünürlük 591 nm. Burada seçilen örnekleme yeterli olduğunu, ancak eksenel çözünürlük yansıması için dikenler küçük boyutundan büyük olduğu için, analiz dendritler yana doğru uzanan dikenleri yanadır. </li></ol> Dendritik Spine 5. 3D Niceleme Not: Aşağıdaki bölümlerde özel analiz için Imaris yazılım kullanımını tarif eder. Alternatif uygulamalar benzer sonuçlar sağlayabilir NeuronStudio 15 veya Metamorph 8 de dahil olmak üzere, mevcuttur. Aşağıdaki anahtar ayarları kullanın: <ol><li> Bir ön işleme aşaması olarak, yazılım tarafından sunulan görüntü işleme tesisleri ile Gauss filtreleme kullanmak. Görüntü İşleme&gt; smoo yoluyla Gauss filtreleme gerçekleştirinşey&gt; Gauss Filtre. XY piksel boyutuna eşit olması için filtre genişliğini ayarlayın. </li><li> Yazılımın Filament Tracer modülü kullanılarak, dendritler bir yarı otomatik izleme yapın. <ol><li> İlk olarak, yazılım Dilim sekmesinde mesafe aracını kullanarak, dendrit çapını tahmin ediyoruz. </li><li> Aşan sekmesinde, Filament aracı tıklayın. Daha iyi bir sağlamlık için bu protokol yarı otomatik izleme dayanır; Atla otomatik oluşturulması tıklayın. Modül arayüzü artık Çizim sekmesini gösteriyor. Burada, bir yöntem, bir tür olarak dendrit ve giriş tahmini dendrit çapı olarak autopath seçin. </li><li> Bir kutunun içine imleç dönüm işaretçi Seç modunu kullanın. Dendrit başlangıç ​​noktasında Shift-sağ tıklayın. Not: Yazılımın ilk hesaplamalar gerçekleştirir. </li><li> Dendritin boyunca hareket ettirin. Başlangıç ​​noktasından (temsilmavi küre olarak ed), büyük olasılıkla dendrit yolu temsil eden bir sarı çizgi gösterilir. Dendrit uç noktası üzerinde Shift-sol tıklayın. </li></ol></li><li> Otomatik dikenleri segmentasyon gerçekleştirin. Not: takip dendrit üzerindeki dikenler modül arabirimi tarafından otomatik olarak rastlanmaktadır. <ol><li> Modül arayüzünde, Yaratılış sekmesine tıklayın. Yeniden açılan listesinde, Dendrit Çap yeniden almak ve Tut veri kutusunu işaretleyin. Ardından yeniden tıklatın. </li><li> Parçalara hacmi gerçek dendrit hacmine tekabül böylece Eşik ayarlayın. Bir Algoritma olarak. Mesafe Map Kısa Mesafe seçin İleri düğmesini tıklatın. </li><li> En küçük omurga baş çapı ve maksimal uzunluğunu tespit, yine yazılımın Dilim sekmesinde mesafe aracını kullanarak, sonra tekrar Aşmak sekmesine gelip parametreleri girin. Fveya bu protokol, 200 civarında değerleri - minimal çapı 300 nm ve maksimal uzunluğu 4 mikron iyi bir başlangıç ​​noktalarıdır. İzin Şube Dikenler kutusunu kontrol etmeyin. İleri düğmesini tıklatın. </li><li> Dikenler temsil mavi noktalar gerçek omurga kafaları lokalize böylece Tohum Noktaları Eşik ayarlayın. İleri düğmesini tıklatın. Not: Çekirdek hesaplaması şu anda yapılıyor ve uzun olabilir. </li></ol></li><li> Modül arayüzü Araçlar sekmesine giderek dikenleri sınıflandırır. Sınıflandırır Spine tıklayın. İstendiğinde kullanıcı arayüzü, aşağıdaki gibi kendi morfolojisi ile tanımlanan dört sınıfları vardır emin olun: Topaç: uzunluk &lt;1 um; Mantar: Uzunluk (omurga)&gt; 3 ve Max genişliği (baş)&gt; genişliği (boyun) 2 x anlamına gelir; Uzun ince: Ortalama genişlik (kafa) ≥ ortalama genişliği (boyun); Filopodia gibi: Uzunluk ≤ 4 mikron (hiç kafa). Not: module arayüz sınıflandırma sonuçlarını içeren dört yeni Filament nesneleri oluşturur. </li><li> İhracat Istatistiksel veriler: Bu dört nesne arayüzleri herhangi İstatistikler sekmesine gidin. Düğmesine Dosyaya Aktar Tüm İstatistikleri tıklayın. Not: Diğer istatistiksel değerler dendritler için ihraç edilebilir (.. Örneğin uzunluk, alan, vb çapı, şube derinliği, dallanma açısı, hacim, ortalama), ve dikenler (örneğin, doğruluk, bağlılık, uzunluk ve farklı hacminin alan omurga parçaları, omurga çapı, yoğunluğu vb.) </li></ol>

<ol><li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHANK3+mutations+identified+in+autism+led+to+modification+of+dendritic+spine+morphology+via+an+actin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism.</a> Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).</li>
<li>Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-synaptic+dendritic+spines+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Non-synaptic dendritic spines in neocortex.</a> Neuroscience. 145, 464-469 (2007).</li>
<li>Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-based+comparison+of+human+dendritic+spine+structure+using+complete+three-dimensional+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions.</a> Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).</li>
<li>Boissart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+of+cortical+neurons+of+the+superficial+layers+amenable+to+psychiatric+disease+modeling+and+high-throughput+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening.</a> Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).</li>
<li>Avale, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+beta+2%2A+nicotinic+receptors+and+dopamine+pathways+in+the+control+of+spontaneous+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion.</a> Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+synaptic+adhesion+with+dendritic+spine+remodeling+by+AF6+and+kalirin-7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7.</a> Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).</li>
<li>Srivastava, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afadin+is+required+for+maintenance+of+dendritic+structure+and+excitatory+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dendritic+spine+morphology+in+cultured+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2794(2011).</li>
<li>Brennand, K. J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+psychiatric+disorders+through+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling psychiatric disorders through reprogramming.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).</li>
<li>Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).</li>
<li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+a+game+changer+for+future+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li>
<li>Stein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquantitative+framework+to+evaluate+modeling+of+cortical+development+by+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells.</a> Neuron. 83, 69-86 (2014).</li>
<li>Sivapatham, R., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li>
<li>Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+dysgenesis+in+Rett+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).</li>
<li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997(2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Piramidal nöronlar morfolojik özelliklerinin ölçümü yazılımı dayanıyordu. Filament Tracer arayüzü nöronların ve dikenler segmentasyonu için kullanıldı ve XT modülü kendi analiz için kullanıldı. Bizim teknik doğruluğunu analiz etmek, öncelikle kültür 6, 7 ve insan beyin dokularında 3 sıçan olgun piramidal nöronlar kullanarak yayınlanan olanlar ölçülen morfolojik parametreleri (uzunluk, alan ve toplam omurga hacmi uygulanabilir), karşılaştırıldı. Yoğunlukları tüm vakalard...

Kortikal piramidal nöronların Dendritik dikenleri kemirgen, primat, insan beyninin, bu nöron alt tiplerinin bazal ve apikal dendritler boyunca dağıtılmıştır küçük ve ince çıkıntılar bulunmaktadır. Bunlar en uyarıcı sinaps siteleri ve öğrenme ve bilişsel süreçlerde önemli fonksiyonları görüntülemek. İnsan dendritik dikenler detaylı yapıları teknik elektron mikroskobu 2 tarafından incelenmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, zaman alıcıdır ve ağır iş yükünü temsil eder. Daha yakın zamanda, dendritik dikenler morfoloji üç boyutlu (3D) yeniden büyük el omurga analizi 3 kombine özel bir yazılım kullanılarak insan beyin korteksinde bildirilmiştir. Immünofloresan bağlanmış yeşil floresan protein (GFP) teknolojisi floresan mikroskop ile omurga tespiti ve şekil ölçümü için doğru bir aracı temsil eder. Bu yaklaşım kolayca kültür nöronları için uygulanabilir. However, veriler uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC) elde edilen insan nöronlar üzerinde omurga olgunlaşması ve morfoloji analizi bildirilmiştir. Bu çalışmanın amacı, in vitro kültürlenmiş insan nöronlardan dendritik omurga görüntüleme sağlayan bir protokol, tanımlamaktır. Imaris yazılımının Filament Tracer modülü ile GFP etiketleme, konfokal mikroskopi ve 3D analiz, mevcut protokolü kullanılmıştır. II nöral kök hücrelerden IV (NSC) için katmanları kortikal nöronlar glutamaterjik elde etmek için gerekli olan kültür adımlar da burada açıklanan kısaca. İnsan MGK üretimi için tüm protokol zaten başka bir yerde 4 yayımlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>D-PBS (1x), sans Kalsiyum, Magnezyum ve Fenol Kırmızı</td><td>Gibco/ Yaşam Teknolojileri</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitin Çözeltisi Biyoreaktif</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Fare laminin</td><td>Dutscher Dominique</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>N2 Takviyesi</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>A Vitamini Olmadan B-27 Takviyesi (50 kat)</td><td>Gibco / Yaşam Teknolojileri</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / NUT. KARIŞIM F-12 W/GLUT-I</td><td>Gibco/ Yaşam Teknolojileri</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal Med SFM</td><td>Gibco/ Yaşam Teknolojileri</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco/ Yaşam Teknolojileri</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Steptomisin</td><td>Gibco/ Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tavşan Serumu Poliklonal Antikoru</td><td>Gibco/ Yaşam Teknolojileri</td><td>A-6455</td><td></td></tr><tr><td>At serumu</td><td>Gibco/ Yaşam Teknolojileri</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Tavşan&nbsp;</td><td>Gibco/ Yaşam Teknolojileri</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonal Anti-betaIII tübülin Antikor</td><td>Kırlangıç</td><td>AB9354</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı 13 mm</td><td>VWR</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Gibco/ Life Technologies</td><td>ile Uzatılmış Altın Antifade Reaktifi</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Tween(R) 20 Bioextra, Viskoz Sıvı</td><td>Sigma Aldrich Chimie</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich Chimie</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Fibroblastları</td><td>Coriell Hücre Hattı Biyodeposu</td><td>GM 4603 ve GM 1869</td><td>Coriell Tıbbi Araştırma Enstitüsü, Camden, NJ, ABD</td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Zeiss (Almanya)</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane AG, Zürih</td><td>6.4.0 versiyonu</td><td>Filament Tracer ve Imaris XT modülleri gereklidir</td></tr><tr><td>Huygens Yazılımı</td><td>Huygens yazılımı, SVI, Hollanda</td><td>Pro sürümü</td><td>İsteğe bağlı (evrişim giderme testi için)</td></tr></tbody></table>

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş piramidal nöronlar gelen dendritik spine Üç boyutlu niceleme

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritik dikenler, merkezi sinir sisteminde, uyarıcı sinapsların post-sinaptik bölmelere karşılık küçük çıkıntılar vardır. Onlar dendritler boyunca dağıtılır. Onların morfolojisi nöronal aktivitenin büyük ölçüde bağlıdır ve onlar dinamik. Dendritik dikenler yüzeylerinde ve postsinaptik yoğunluğu seviyelerinde glutamaterjik reseptörleri (AMPA ve NMDA reseptörleri) ifade etmektedir. Her omurga nöron bağımsız olarak devlet ve yerel aktivite kontrol etmenizi sağlar. Omurga morfolojileri yoğun in vivo yaklaşımları ve kemirgen dokularından elde edilen nöronal kültürler her ikisini de kullanarak, beyin korteksinin glutamaterjik piramit şeklindeki hücrelerinde incelenmiştir. Kemirgen kültürlenmiş nöronlar ve tek boyutlu nicel analiz 1 &#39;de gösterildiği gibi nöropatolojik koşulları, değiştirilmiş omurga indüksiyon ve olgunlaşması ile ilişkili olabilir. Bu çalışmada, insan cortic kullanarak omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz için bir protokol tanımlamaktadırnöral kök hücreler (geç kortikal atalarıdır) türetilen al nöronlar. Bu hücreler, ilk uyarılmış pluripotent kök hücreler elde edildi. Bu protokol, farklı kültür dönemlerinde omurga morfolojileri analizi sağlar, ve psikiyatrik hastalığı olan hastalardan elde edilen kontrol bireylerden elde edilen uyarılmış pluripotent kök hücreler arasındaki olası karşılaştırılması.

<html> Bu çalışmada IPSC türetilen piramidal nöronların kültür dendritlerin omurga ölçümü için standart bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, insan omurga nöronlar üzerinde olgunlaşma ve standart kemirgen nöronal kültürlerinde dikenler olgunlaşması ve in vivo hayvan modellerinde ile olası karşılaştırma analizine izin verir. Şekil 1A kortikal piramidal nöronlar üretimine izin veren farklı kültür adımların bir düzeni temsil etmektedir. Böyle şematik temsili daha i...

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Bu prosedürün genel amacı, insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücrelerden türetilen periferal nöronlardaki dendritik dikenleri görüntülemek ve bunları üç boyutlu olarak nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle altı kuyucuklu plakalardaki lamellerin, nöral kök hücrelerin kültüre edilmesi için poliüretan ve laminin ile işlem görmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, nöral kök hücreler kültür ortamında seyreltilir.Besiyeri, hafif dairesel bir pipet hareketi kullanılarak plaklara aktarılır ve kültürde 70 güne kadar farklılaşmeye bırakılır. Besiyerinin düzenli olarak yenilenmesinin ardından hücreler, anti-GFP antikorları ile boyanmış GFP lentiviriüsü ile transdükse edilir ve görüntülenir. Son olarak, kültürler fikse edilir ve dendritik dikenler konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir.Nihayetinde, insan dendritik dikenlerinin görüntü verileri, sınıflandırılmaları ve nicelleştirilmeleri için 3 boyutlu olarak yeniden yapılandırılır. Bu protokol, insan beyin korteksinin ikinci ila dördüncü tabakalarındaki glutamaterjik nöronların elde edilmesi için adım adım bir prosedür sunmaktadır. Bu işlem, daha önce yayınlanmış yönteme dayanarak, insan fibroblastlarından türetilen insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinden elde edilen nöral kök hücrelerin kullanımını içerir.Mevcut yöntemlerimize kıyasla bu tekniğin temel avantajı, DON sağ ve PY'nin 3D olarak otomatik segmentasyonuna olanak sağlamasıdır. Bu durum, genellikle yalnızca 2D analizler yapan mevcut yazılımlara göre belirgin bir zaman kazancı sağlar. donr ve spy sınıflandırmaları aynı zamanda oldukça kullanışlı ve kolaydır.Nöronal kültürler hazırlamak için, cam lamelleri altı kuyucuklu kültür kaplarına yerleştirin ve poli-ornitin ekleyip bir laminar akışlı kabinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, lamelleri üç kez yıkamak için DPBS kullanın ve laminin ekleyip bir laminar akışlı kabinde en az 10 saat inkübe edin. Aşağıdaki bileşenleri içeren kültür ortamını hazırlayın.Ardından, insan iPSC kaynaklı nöronları transdüse etmek için, hücre kümelenmesini azaltmak amacıyla yavaş döndürme hareketleriyle pipetleme yaparak, nöral kök hücreleri (NSC'leri) santimetrekare başına 50.000 hücre yoğunluğunda plakalara ekmek ve dağıtmak için medyumu kullanın. Olgunlaşmanın herhangi bir aşamasında, taze kültür medyumu içeren her bir kültür kuyucuğuna, 40 ng GFP lentiviral vektör içeren stok çözeltiden 1 µL ekleyin ve 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. Hücreleri immünofloresans için hazırlamak amacıyla, kültür medyumunu uzaklaştırın ve transdüse edilmiş hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %4 formaldehit kullanarak sabitleyin.Ardından, hücreleri her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez XPBS ile yıkayın. Daha sonra, lamelleri %0,05 Triton X 110 ve %10 at serumu eklenmiş PBS içine daldırın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Son olarak, lamelleri üç kez PBS ile yıkayın.Her bir lam örtü camına, 100 µL PBS %4 at serumu içinde 1/1000 oranında GFP primer antikoru ekleyin. Bir karanlık kutuda 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ardından, Alexa Fluor 488 konjuge antikoru PBS %0,5 tween 20 içinde 1/200 oranında seyreltin; lamları PBS ile üç kez yıkadıktan sonra hücreleri antikoru çözeltisi ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Floresan mikroskobu ile incelemek üzere lamları bağlama ortamı kullanarak kapatın. Konfokal mikroskop altında, her koşul için perimetal morfolojiye ve katlanmış dendritik arborizasyona sahip en iyisi 10 sağlıklı nöron seçerek dendrit başına 60 ile 100 mikrometre arasını nicelendirin. Görüntüleri 40 x na, 1.3 yağ daldırma objektif ve örnek düzeyindeki tipik tepe gücü yaklaşık 20 mikro watt olan 488 nanometrelik bir lazer ile elde edin; dendritik dikenlerin uygun şekilde örneklenmesi için piksel boyutunu yaklaşık 80 nanometre olarak ayarlayın.Tüm nöron hacminden örnekleme yapmak için, dendritik dikenlerin 3D kantifikasyonunu gerçekleştirmek amacıyla 20 ila 30 Z dilimi sağlayacak şekilde 150 ila 300 nanometre Z aralıklarıyla bir Z stack alın. Ön işleme için analiz yazılımında aşağıdaki ayarları kullanın. Görüntü işleme düzleştirme Gaussian filtresini seçerek Gaussian filtreleme uygulayın.Filament izleyici modülündeki dendritlerin yarı otomatik izlemesini gerçekleştirmek için filtre genişliğini XY düzlemindeki piksel boyutuna eşit olarak ayarlayın. Kesit sekmesinde, dendrit çapını tahmin etmek için mesafe aracını kullanın. Ardından, daha iyi bir sağlamlık için aşılan sekmesinde filamentler aracına tıklayın ve çizim sekmesinde otomatik oluşturmayı atla seçeneğini belirleyin.Şimdi yöntem olarak "auto path", tip olarak "dendrite" seçin ve tahmini dendrit çapını girin. İmlecin seçim modunu kullanarak imleci bir kutucuğa dönüştürün, ardından Shift tuşuna basılı tutarak dendrit başlangıç noktasına sağ tıklayın. Yazılım ilk hesaplamaları gerçekleştirecektir.Şimdi imleci başlangıç noktasından itibaren dendrit boyunca hareket ettirin. En olası dendrit yolunu temsil eden sarı bir çizgi gösterilmektedir. Shift ve sol tuşuna basın.Modül arayüzünde otomatik spinal segmentasyon gerçekleştirmek için dendrit uç noktasına tıklayın. Yeniden oluşturma (rebuild) açılır listesindeki oluşturma (creation) sekmesine tıklayın. Dendrit çapını yeniden oluşturu (rebuild dendrite diameter) seçeneğini belirleyin ve verileri koru (keep data) kutucuğunu işaretleyin.Ardından yeniden oluştur (rebuild) seçeneğine tıklayın. Segmentlere ayrılmış hacim gerçek dendrit hacmine karşılık gelecek şekilde eşiği ayarlayın. Algoritma olarak, mesafe haritasından en kısa mesafeyi (shortest distance from distance map) seçin.Ardından, slice sekmesinin altındaki next butonuna tıklayın; en küçük dikensi çıkıntı (spine), baş çapı ve maksimum uzunluğu belirleyin. Daha sonra surpass sekmesi altında, parametre değerlerini girin; minimum çap için 200 ila 300 nanometre ve maksimum uzunluk için dört mikrometre uygun başlangıç noktalarıdır. "allow spines" kutucuğunu işaretlemeden next butonuna tıklayın. Sonraki adımda, dikensi çıkıntıları temsil eden mavi noktalar gerçek spine başlarında konumlanacak şekilde seed points eşik değerini ayarlayın.Ardından "next"e tıklayın. Temel hesaplama şimdi gerçekleştirilecektir ve zaman alabilir. Modül arayüzündeki araçlar (tools) sekmesi altında, "classify spine" seçeneğine tıklayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi dört sınıf olduğu doğrulandıktan sonra, modül arayüzü sınıflandırma sonuçlarını içeren dört yeni filament nesnesi oluşturacaktır.Son olarak, istatistikler sekmesi altındaki tüm istatistikleri dosyaya aktar seçeneğine tıklayarak istatistiksel verileri dışa aktarın. Bu şekil, anti beta three tubulin antikoru ile işaretlenmiş insan nöron kültürünü göstermektedir. Hücre kümelenme eğilimi burada da belirgindir.Burada, geç dönem kortikal progenitörden farklılaşmasından 40 gün sonra GFP ile işaretlenmiş bir parametal nöron gösterilmektedir. Süperfisyal kortikal tabakalardandır. Küçük resim, hücre gövdesinin belirgin olduğu daha düşük büyütmeli bir görüntüyü göstermektedir.Bu paneller, olgunlaşmanın farklı aşamalarındaki dendritik diken segmentlerinin 3B rekonstrüksiyonlarını temsil etmektedir. Diken yoğunluğunun ve diken başı hacminin kantitatif analizi burada gösterilmiştir. Beklendiği üzere, bu iki parametre kültür süresi boyunca artış göstermektedir.Kültür prosedürü uygulanırken, hücre kümelenmesini azaltmak için hücreler nazik bir döndürme hareketiyle yavaşça eklenerek nöral kök hücrelerin çok dikkatli bir şekilde plaklara yayılması ve dağıtılması önemlidir. Nitekim bu yöntem, bireysel nöronların tanımlanmasını gerektirmektedir.

three-dimensional-quantification-dendritic-spines-from-pyramidal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Çok sayıda yeni çalışmalar sinaptik proteinlerin beyin patolojileri ile ilişkili mutasyonlar belirledik. Primer kültür kortikal nöronların dendritik omurga morfoloji ve motilite bu hastalıkla ilişkili proteinlerin etkilerini inceleyen büyük esneklik sunar.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Bu videoda, nöral kök hücrelerin yapışmasını ve büyümesini artırmak için poliornitin ve laminin ile kaplanmış cam lamellerin hazırlanmasına yönelik bir yöntem açıklanmaktadır. Teknik, nöronlarda bulunan yapıları taklit ederek nöronal hücre büyümesini ve farklılaşmasını destekleyen destekleyici bir matrisin oluşumunu kolaylaştıran sıralı inkübasyonları ve yıkamaları içerir.

İnsan Nöral Kök Hücrelerinden Kortikal Piramidal Nöronların Üretilmesi

Kaynak: Gouder, et. al. İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Türetilen Piramidal Nöronlardan Dendritik Dikenlerin Üç Boyutlu Miktar Tayini. J. Vis. Uzm. (2015).Bu video, konfokal mikroskopi kullanılarak transdüksiyona uğramış, immün etiketli piramidal nöronlardaki dendritik dikenlerin görüntülenmesini ve analizini göstermektedir. Arka plan gürültüsü azaltılır ve dendritler çapları ve uzunlukları tahmin edilerek izlenir. Otomatik omurga segmentasyonu, dendrit ve omurga boyutları için...

Konfokal Mikroskopi Görüntüleme Kullanılarak Dendritik Dikenlerin Miktar Tayini

Bu makale Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu (SIM) kullanılarak in vitro hipokampalinden görüntü dendritik dikenler bir çalışma protokolünü açıklar. SIM kullanarak süper çözünürlüklü mikroskopi geliştirilmiş detaylar bireysel dendritik dikenler görüntüleme sağlayan, önemli ölçüde her üç boyutta ışık kırınım sınırı aşan görüntü çözünürlüğü sağlar.

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Fare modellerinin hipokampusunda dendritik arborizasyonun görselleştirilmesi ve ölçülmesi için iki yöntem açıklıyoruz: gerçek zamanlı ve genişletilmiş alan derinliği görüntüleme. İlk yöntem, karmaşık topografik izlemeye ve dallanma derecesinin ölçülmesine izin verirken, ikincisi dendritik ağacın hızlı bir şekilde görselleştirilmesine izin verir.

Farelerde Hipokampal Bölgesi Dentate Gyrus dendritik arborization Değerlendirilmesi

Protokol, sinaptik plastisiteyi modellemek için dendritik dikenler içeren dendritik segmentin üç boyutlu (3D) bir modelini geliştirir. Yapılı mesh CellBlender ve MCell ile yazılım programı Blender kullanarak uzun vadeli sinaptik plastisite AMPA reseptör ticareti hesaplamalı modelleme için kullanılabilir.

Sinaptik Plastisite ile Dendritik Dikenlerin 3D Modellemesi

Nörokimyasal ve davranışsal anormalliklerin altında yatan nöronlar ve dendritik dikenlerde potansiyel morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesi için kritik olan piramidal nöronları etiketlemek ve analiz etmek için bir protokol salıyoruz.

Beyin Dilimlerinde ve Birincil Hücre Kültüründe Piramidal Nöronların Balistik Etiketlemesi

Protokol, hipokampustaki nöronları ve sıçanın medial prefrontal korteksi boyamak için sinir sisteminin herhangi bir bölümüne uyarlanabilen hızlı Golgi yönteminin bir modifikasyonunu açıklar.

Hipokampus ve Prefrontal Kortekste Dendritik Omurga Görselleştirme için Hızlı Golgi Lekesi

Dendritik dikenler, çoğu uyarıcı sinapsın post-sinaptik bölmeleridir. Dendritik omurga morfolojisindeki değişiklikler, nörogelişim, yaşlanma, öğrenme ve birçok nörolojik ve psikiyatrik bozukluk sırasında meydana gelir ve güvenilir dendritik omurga analizinin önemini vurgular. Bu protokol, otomatik üç boyutlu nöron rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak dendritik omurga morfolojisinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini açıklar.

Otomatik Üç Boyutlu Nöron Rekonstrüksiyon Yazılımı Kullanılarak Dendritik Omurga Ölçümü

Bu el yazması, koparılmış saçlardan insan keratinositlerinin türetilmesi ve sürdürülmesi ve ardından epizomal vektörler tarafından entegrasyon gerektirmeyen insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) üretilmesi için adım adım bir prosedür sağlar.

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Keşfedin, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerden türetilmiş piramidal nöronlarda dendritik spine'lerin üç boyutlu nicelenmesi yöntemini. Konfokal mikroskopi ile sinaptik yapıları inceleyin.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Daha fazla video keşfet