İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme
10 Ekim 2015
Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.
Bu prosedürün genel amacı, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen peral nöronlardan dendritik dikenleri görüntülemek ve bunları üç boyutta ölçmektir. Bu, ilk olarak nöral kök hücrelerin kültürlenmesi için altı oyuklu plakadaki kapak kaymalarının poliüretan ve laminin ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra kültürde seyreltilmiş nöral kök hücreler.
Ortam, hafif bir döner pipet hareketi kullanılarak kaplanır ve kültürde 70 güne kadar farklılaşmasına izin verilir. Besiyerini düzenli olarak yenileyerek, hücreler anti GFP antikorları ile boyanmış GFP lentivirüsü ile transdüksiyona tabi tutulur ve görselleştirilir. Son olarak, kültürler sabitlenir ve dendritik dikenler konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir.
Sonuç olarak, insan dendritik dikenlerinin görüntü verileri, sınıflandırılmaları ve niceliklerinin belirlenmesi için 3D olarak yeniden yapılandırılır. Bu protokol, insan beyin korteksinin iki ila dördüncü katmanının glutamaterjik nöronlarını elde etmek için aşamalı bir prosedür sağlar. Daha önce yayınlanmış yönteme dayalı olarak insan fibroblastından köken alan insan kaynaklı pre potent kök hücrelerden türetilen nöral kök hücrelerin kullanımını içerir.
Bu tekniğin mevcut yöntemlerimizden en büyük avantajı, DON sağının ve PY'nin 3D olarak otomatik segmentasyonuna izin vermesidir. Bu, tipik olarak yalnızca 2D analizden hazırlanan mevcut yazılımlara göre kayda değer bir zaman kazancı sağlar. Sınıflandırmalardaki döner ve casus da çok kullanışlı ve kullanımı kolaydır.
Nöronal kültürleri hazırlamak için, cam kapak fişlerini altı kuyucuklu kültür kabına yerleştirin ve ertesi gün bir akış başlığı altında gece boyunca poli ornitin inkübe edin. Kapak fişlerini üç kez yıkamak için DPBS'yi kullanın ve laminin ekleyin, en az 10 saat boyunca bir akış başlığı altında inkübe edin. Aşağıdaki bileşenleri içeren kültür ortamını hazırlayın.
Daha sonra, insan IPSC'den türetilmiş nöronları dönüştürmek için hücre kümelenmesini azaltmak için yavaş dönen hareketlerle pipetleme, santimetre kare başına 50.000 hücre yoğunluğunda nöral kök hücreleri veya NSCS'yi plakalamak ve göndermek için ortamı kullanın. Olgunlaşmanın herhangi bir aşamasında, taze kültür ortamı içeren kültür kuyusu başına 40 nanogram GFP lentiviral vektörü içeren bir stok çözeltisinden bir mikrolitre ekleyin ve 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri immünofloresan için hazırlamak için, kültür ortamını çıkarın ve dönüştürülen hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika sabitlemek için% 4 formaldehit kullanın.
Ardından, hücreleri her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkamak için bir XPBS kullanın. Daha sonra, kapak fişlerini %0,05 Triton X %110 at serumu ile desteklenmiş PBS'ye batırın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından kapak fişlerini üç kez yıkamak için PBS'yi kullanın.
Her kapak fişine 100 mikrolitre PBS% 4 at serumunda bir 1000. GFP birincil antikoru ekleyin. Gece boyunca dört santigrat derecede karanlık bir kutuda inkübe edin. Şimdi Alexa Fluor 4 88 konjuge antikoru bir'i PBS'de %0.5 ile 20 arasında 200'e seyreltin ve slaytları üç kez yıkamak için PBS'yi kullandıktan sonra hücreleri antikor solüsyonu ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
Floresan mikroskobu için slaytları monte etmek için montaj ortamını kullanın. Konfokal bir mikroskop altında, dendrit başına 60 ila 100 mikrometreyi ölçmek için bir parametal morfolojisi ve bir kıvrım dendritik arborizasyon ile durum başına en az 10 sağlıklı nöron seçin. 40 x na, 1.3 yağ objektifi ve 488 nanometre lazerle yaklaşık 20 mikro watt örnekleme düzeyinde tipik bir tepe gücüne sahip görüntüler elde edin, piksel boyutunu 80 nanometre civarında uygun şekilde örneklenmiş dendritik dikenlere ayarlayın.
Tüm nöron hacmini örneklemek için, 150 ila 300 nanometre arasında bir Z aralığına sahip bir Z yığını elde edin ve dendritik dikenlerin 3D nicelleştirmesini gerçekleştirmek için 20 ila 30 Z dilimi elde edin. Analiz yazılımının ön işleme için aşağıdaki ayarları kullanın. Görüntü işleme yumuşatma Gauss filtresini seçerek Gauss filtrelemesini kullanın.
Filament izleyici modülünden dendritlerin yarı otomatik izlemesini gerçekleştirmek için filtre genişliğini XY düzlemindeki piksel boyutuna eşit olarak ayarlayın. Dilim sekmesinde, dendrit çapını tahmin etmek için uzaklık aracını kullanın. Sonraki aşılan sekmede, filamentler aracına tıklayın ve daha iyi sağlamlık için otomatik oluşturmayı atla'yı seçin Çizim sekmesinde.
Şimdi sunulan bir yöntem olarak otomatik yolu, bir tür olarak dendriti seçin ve tahmini dendrit çapını girin. İşaretçinin seçim modunu kullanarak, imleci bir kutuya çevirin ve shift tuşunu seçin ve dendrit başlangıç noktasına sağ tıklayın. Yazılım ilk hesaplamaları yapacaktır.
Şimdi işaretçiyi başlangıç noktasından dendrit boyunca hareket ettirin. En olası dendrit yolunu temsil eden sarı bir çizgi gösterilir. Shift tuşuna basın ve sola basın.
Modül arayüzünde otomatik omurga segmentasyonu gerçekleştirmek için dendrit uç noktasına tıklayın. Yeniden oluşturma açılır listesindeki oluşturma sekmesine tıklayın. Dendrit çapını yeniden oluştur'u seçin ve verileri sakla kutusunu işaretleyin.
Ardından yeniden oluştur'u tıklayın. Eşiği, segmentli hacim gerçek dendrit hacmine karşılık gelecek şekilde ayarlayın. Bir algoritma olarak, mesafe haritasından en kısa mesafeyi seçin.
Ardından dilim sekmesinin altındaki sonraki düğmesine tıklayın, en küçük omurgayı, kafa çapını ve maksimum uzunluğu belirleyin. Ardından aşma sekmesinin altında, minimum çap için 200 ila 300 nanometre ve maksimum uzunluk için dört mikrometre civarında parametre değerlerini girin, dikenlere izin ver kutusunu işaretlemeden başlangıç noktalarıdır, sonraki düğmeye tıklayın. Ardından, tohum noktaları eşiğini, dikenleri temsil eden mavi noktalar gerçek omurga başlarına lokalize olacak şekilde ayarlayın.
Ardından ileri'ye tıklayın. Çekirdek hesaplama şimdi gerçekleştirilecek ve modül arayüzünün araçlar sekmesi altında dikenleri sınıflandırmak zaman alabilir, omurgayı sınıflandır'a tıklayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi dört sınıf olduğunu doğruladıktan sonra, modül arayüzü, sınıflandırmanın sonuçlarıyla birlikte dört yeni filament nesnesi oluşturacaktır.
Son olarak, tüm istatistikleri dosyaya aktar'a tıklayarak istatistikler sekmesi altındaki istatistiksel verileri dışa aktarın. Bu şekil, bir anti beta üç tübülin antikoru olarak etiketlenmiş insan nöronlarının kültürünü göstermektedir. Hücre kümelenme eğilimi burada da belirgindir.
Burada, geç kortikal progenitörden farklılaşmadan 40 gün sonra GFP etiketli bir parametal nöron gösterilmektedir. Yüzeysel kortikal tabakalardan. İç kısım, görünen hücre gövdesi ile daha düşük bir büyütme gösterir.
Bu paneller, olgunlaşmanın farklı aşamalarında dendritik diken segmentlerinin 3D rekonstrüksiyonunu temsil eder. Omurga yoğunluğu ve omurga başı hacminin kantitatif analizi burada gösterilmiştir. Beklendiği gibi, bu iki parametre kültür periyodu boyunca artar.
Kültür prosedürü denenirken, hücre kolinini azaltmak için nöro kök hücrelerin hafif bir dönme hareketi ile yavaş yavaş eklenerek çok dikkatli bir şekilde plakalanması ve dağıtılması önemlidir. Aslında, bu yöntem bireysel nöronların tanımlanmasını gerektirir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu yöntem, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilmiş insan kortikal piramidal glutamajerjik nöronlardaki dendritik dikenlerin 3D nicel analizini açıklar. Prosedür, bu dikenlerin görüntülenip nicelleştirilmesini içerir ve bu sayede morfolojilerini daha iyi anlamak amaçlanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Kök Hücre Araştırması
Arka Plan
- Dendritik dikenler beyindeki sinaptik iletim için kritik öneme sahiptir.
- Piramidal nöronlar korteksteki eksitasyonel nöronların önemli bir türüdür.
- Diken morfolojisini anlamak, nöral bağlantılar hakkında içgörüler sağlayabilir.
- İndüklenmiş pluripotent kök hücreler, insan nöronlarının çalışılması için bir model sunar.
Çalışmanın Amacı
- İnsan nöronlarındaki dendritik dikenlerin morfolojisini analiz etmek.
- Üç boyutta diken özelliklerini nicelleştirmek.
- İnsan beynindeki sinaptik yapıların anlaşılmasına katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- İşlem görmüş kapak camlarında sinir kök hücrelerinin kültürü.
- Kök hücrelerin 70 güne kadar farklılaştırılması.
- Görselleştirme için GFP lentivirus ile transdüksiyon.
- Konfokal mikroskop kullanarak dendritik dikenlerin görüntülenmesi.
Ana Sonuçlar
- Kültürlenmiş nöronlarda dendritik dikenlerin başarılı bir şekilde görüntülenmesi.
- Diken morfolojisinin nicel analizi gerçekleştirildi.
- İnsan kortikal nöronların yapısal özellikleri hakkında içgörüler sağlandı.
- Sinaptik yapılar üzerine gelecekteki çalışmalar için metodoloji kuruldu.
Sonuçlar
- Yöntem, dendritik dikenleri çalışmak için güvenilir bir yaklaşım sunar.
- Bulgular, eksitasyonel sinapsların anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Nörogelişimsel ve nörodejeneratif araştırmalarda potansiyel uygulamalar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Three-dimensional quantification of dendritic spines in human iPSC-derived pyramidal neurons enables high-fidelity morphological analysis critical for early CNS target validation. This workflow supports predictive confidence in synaptic function studies and de-risks translational neuroscience programs by providing human-relevant, quantitative readouts. The approach is positioned to inform portfolio decisions in neuropsychiatric and neurodegenerative disease research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of synaptic structure in human-derived neurons.
- Supports functional target validation by quantifying spine density and morphology.
- Facilitates predictive confidence in disease-relevant neuronal models.
- Provides a platform for comparative studies between control and patient-derived cells.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible 3D imaging and quantification workflows.
- Generates quantitative outputs suitable for downstream compound screening.
- Prepares validated neuronal systems for high-content analysis platforms.
- Enables reliable evaluation of synaptic modulators in human context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant human neuronal phenotypes.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in CNS pipelines.
- Provides quantitative endpoints for translational biomarker development.
- De-risks advancement decisions by anchoring on human neuronal data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust hypothesis testing and quantitative phenotyping in human iPSC-derived neuronal models.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking via 3D spine analysis.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Delivers statistical measurements of spine density, head volume, and maturation state.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant human neuronal systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes 3D imaging and quantification for scalable, reproducible outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in neurobiology portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS assets based on human-relevant data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human iPSC culture and neuronal differentiation.
- Demands access to confocal microscopy and advanced image analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and quantification parameters.
- Adaptation may be needed for different neuronal subtypes or disease models.
- Careful cell handling is critical to ensure single-neuron identification and reduce clustering.
