Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

İmmünohistokimya, dokulardaki protein lokalizasyonunu ve ekspresyonunu değerlendirmek için güçlü bir laboratuvar tekniğidir. Kantitasyon için mevcut yarı otomatik yöntemler öznelliği ortaya çıkarır ve çoğu zaman tekrarlanamaz sonuçlar yaratır. Burada, multispektral görüntüleme kullanılarak çoğullanmış immünohistokimya ve protein ekspresyonunun objektif kantitasyonu ve ko-lokalizasyonu için yöntemler tanımlanmıştır.

Bu yöntemin genel amacı, multispektral görüntüleme kullanarak protein ekspresyonunu ve ko-lokalizasyonu objektif olarak ölçmektir. Bu yöntem, proteinlerin tedaviden sonra veya hastalığın ilerlemesinde ekspresyonunu ve lokalizasyonunu nasıl değiştirdiği gibi temel araştırma ve tanısal patoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel niceleme yöntemlerine özgü operatör öznelliğini ortadan kaldırmasıdır.

Kantifikasyon işlemine başlamak için, tek tek kromojenlerle boyanmış önceden hazırlanmış kontrol slaytlarından ve hematoksilen lekeli slayttan bir spektral kitaplık oluşturmak için multispektral görüntüleme yazılımını açın. Ardından, bir kontrol slaytından elde edilen bir görüntü küpünü açın ve kromojeni optik olarak tanımlamak için dört ila beş pozitif lekeli alan seçin. Tüm kromojenleri temsil eden tam bir spektral kitaplık oluşturulana kadar diğer kontrol slaytlarındaki görüntü küpleriyle adımları tekrarlayın ve ardından spektral kitaplığı kaydedin.

Görüntü formatı seçeneği için Multispectral veya im3'ü ve örnek format için Brightfield'ı seçerek multispektral görüntüleme yazılımı içinde yeni bir projeye başlayın. Segment dokusunu seçerek projeyi yapılandırın, özellikleri bulun, fenotipleme, puanlama, ve dışa aktarma. İsterseniz analiz süresini hızlandırmak için görüntü çözünürlüğünü değiştirin.

Önceden oluşturulan spektral kitaplığı içe aktarın ve analize dahil edilecek tüm kromojenleri seçin. Eğitim veri setine dahil edilecek görüntü küplerini Görüntü Küpünü Aç seçeneğini seçerek açın. Eğitim doğruluğunu sağlamak için analiz edilecek toplam görüntü sayısının en az %18'ini seçin.

Ardından, eğitim görüntü kümesini seçin. Segmentasyon doğruluğunu artırmak için tüm hastalık durumlarını temsil eden görüntüler. Bu adımda yanlılığı önlemek için eğitim setine bol miktarda negatif boyama görüntüsü ekleyin.

Damlalık aracını seçerek ve bir görüntüde beyaz olan bir alanı seçerek eğitim setindeki görüntüleri beyaz olarak dengeleyin. Doku segmentasyonunu taşımak için ilerletme düğmesini seçin. Ardından, daha doğru protein dokusu lokalizasyonu için analiz edilecek doku tiplerini seçmek için doku kategorileri panelini kullanın, seçili doku kategorileri kullanılabilir.

Kalem aracını kullanarak ve eğitim görüntülerindeki hücre gruplarının etrafını çizerek algoritmayı oluşturmaya ve doku kategorilerini tanımlamaya başlayın. Bir doku kategorisi ile işiniz bittiğinde, diğer doku kategorileri için adımı tekrarlayın. Doku kategorisi türüne özgü görüntülerdeki hücre gruplarını seçtiğinizden emin olun.

Doku segmentörü için eğitime dahil edilecek bileşenleri seçin. Doku segmenterini eğitmek için uygun bir desen ölçeği seçin. Ardından eğitilen doku segmenter düğmesini seçin.

Uygun şekilde sınıflandırılmış eğitim bölgelerindeki piksel oranının doğruluğunu gösteren bir açılır kutuyu gözlemleyin. Segment görüntüleri'ne tıklayarak tüm eğitim görüntü kümesini bölümlere ayırın. Bittiğinde, geçerli bir eğitim algoritmasına sahip yanlış sınıflandırılmış dokuları bulmak için eğitim kümesini gözden geçirin.

Doku segmentasyon algoritması sonuçlarından emin olduğunuzda, ilerletme düğmesini seçin. Sitoplazma ve/veya zarı seçmek için çekirdeklerin zaten seçilmiş olduğundan emin olun. Çekirdek sekmesini seçin ve nükleer segmentasyon için uygun ayarları seçin.

Ardından, tek tek veya tüm doku kategorilerinin segmentasyona dahil edilip edilmeyeceğini seçin. İyi sonuçlar elde etmek için basitleştirilmiş bir yöntem için karşı leke nesnesi tabanlı eşik yaklaşımını seçin. Ardından, güvenilir bir nükleer karşı leke üzerinde nesne tabanlı eşik yaklaşımını seçin.

Sitoplazma sekmesini seçerek sitoplazma şeklindeki parametreleri seçin. Ardından, çekirdeğe olan dış mesafeyi seçin. Ardından minimum boyutu seçin.

Birincil, ikincil olan bir sonraki seçenek bileşenini seçin ve ikincil seçenekler olarak üçüncül seçin. Membran sekmesine gidin. Kullanılan membrana özel işaretleyici için önce seçim yapın.

Hücre zarlarındaki her işaretleyici için minimum bir eşik veya pozitif bulmak için tam ölçekli optik yoğunluğu veya OD'yi ayarlayın. Zar sekmesi altında devam ederek maksimum hücre boyutunu seçin. Tüm seçenekleri belirledikten sonra tümünü segmentlere ayır'ı seçin.

Ayarları görüntülere uygulayın ve gözlemleyin. Puan IHC adımına geçmek için ilerlemeyi seçin ve puanlanacak bir doku kategorisi seçin. İstediğiniz bir puanlama türünü seçin ve puanlama analizinde kullanılacak hücre bölmesini seçin.

Ardından, bileşen verilerini görüntüle'yi seçin ve ilgilenilen bileşenler için pozitif hücreler için uygun optik yoğunluk minimum boyama eşiğini bulmak için imleci eğitim görüntülerinin üzerine getirin. Doku segmentasyonu, hücre segmentasyonu ve puanlama değerleri aracılığıyla oluşturulan algoritmayı test etmek için eğitim setinin verilerini dışa aktarın, dışa aktarma dizini için yeni bir klasör oluşturmak üzere istemleri izleyin. Oluşturulacak ve analize dahil edilecek görüntüleri ve tabloları seçin.

Ardından, tümü için dışa aktar'ı seçerek analizi gerçekleştirin. Analiz tamamlandığında, ayarların doğruluğunu değerlendirmek için hem yüksek hem de düşük boyamaya sahip görüntüler için hücre segmentasyonu ve puanlama verilerini görüntüleyin. Ayarlardan memnun kaldığınızda, algoritmayı aktif projeye kopyalamak için toplu analiz sekmesine tıklayın.

Ardından yeni bir dışa aktarma dizini seçin ve analize dahil edilecek görüntüleri ve tabloları seçin. Giriş dosyaları seçeneğinin altında, toplu analize dahil edilecek tüm görüntüleri seçin. Analizi gerçekleştirmek için çalıştır seçeneğini belirleyin.

Tamamlandığında, gözden geçirme birleştirme sekmesine ilerleyin. Tümünü dahil et'i seçin ve analiz için özet veriler içeren veri sayfaları oluşturmak için birleştir'i seçin. Görüntüleri epitelyal ve stromal bölümlere ayırmak için prostat dokuları üzerinde eğitim yapıldı.

Doku olmayan bir bölme ile birlikte. Bir dizi eğitim görüntüsü, tüm görüntü setinin doku tiplerini ve hastalık durumlarını temsil eden multispektral görüntüleme yazılımına aktarıldı. Stromma, epitel ve doku dışı olmak üzere doku kategorileri oluşturuldu ve eğitim görüntülerinin üzerine manuel olarak çizim yapılarak kategoriler tanımlandı.

Doku segmentasyonu için bir algoritma oluşturuldu ve eğitim görüntü setine uygulandı. Dokuları doğru bir şekilde bölümlere ayırmak. Multipleks immünohistokimya tekniği kullanılarak, örtüşen renk ve metrik sinyallere rağmen, kırmızı olarak görülen ER-alfa ve kahverengi olarak görülen AR'nin nükleer ekspresyonu için pozitif hücreler tanımlandı; CD-147'nin hücre zarına özgü ekspresyonu, bir belirteç protein olarak siyah olarak görülen E-katherin kullanılarak ölçüldü.

Bu videoyu izledikten sonra, protein ekspresyonunun ve kolokalizasyonun nasıl ölçüleceğini, parafine gömülü dokuları nasıl bilgilendireceğinizi ve düzelteceğinizi iyi anlamış olmalısınız.