Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Bu yöntemin genel amacı, multispektral görüntüleme kullanarak protein ekspresyonunu ve ko-lokalizasyonunu objektif olarak nicelendirmektir. Bu yöntem, temel araştırma ve tanısal patoloji alanındaki, proteinlerin tedavi sonrası veya hastalık ilerlemesinde ekspresyon ve lokalizasyonlarının nasıl değiştiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel nicelendirme yöntemlerinde bulunan operatör subjektifliğini ortadan kaldırmasıdır.

Nicelleme işlemine başlamak için, önceden hazırlanmış, tekil kromojenlerle boyanmış kontrol lamlarından ve hematoksilinle boyanmış lamdan bir spektral kütüphane oluşturmak üzere multispektral görüntüleme yazılımını açın. Ardından, bir kontrol lamından elde edilen bir görüntü küpünü açın ve kromojeni optik olarak tanımlamak için pozitif boyanmış dört ila beş alan seçin. Tüm kromojenleri temsil eden eksiksiz bir spektral kütüphane oluşturulana kadar diğer kontrol lamlarına ait görüntü küpleriyle aynı adımları tekrarlayın ve ardından spektral kütüphaneyi kaydedin.

Görüntü formatı seçeneği için Multispectral veya im3'ü, numune formatı için ise Brightfield'ı seçerek multispektral görüntüleme yazılımı içinde yeni bir proje başlatın. Segment tissue, find features, phenotyping, score ve export seçeneklerini belirleyerek projeyi yapılandırın. Arzu edilirse, analiz süresini hızlandırmak için görüntü çözünürlüğünü değiştirin.

Daha önce oluşturulmuş olan spektral kütüphaneyi içe aktarın ve analizde yer alacak tüm kromojenleri seçin. Eğitim veri setine dahil edilecek görüntü küplerini, Görüntü Küpünü Aç seçeneğini seçerek açın. Eğitim doğruluğunu sağlamak için, analiz edilecek toplam görüntü sayısının en az %18'ini seçin.

Ardından, eğitim için kullanılacak görüntü setini seçin. Segmentasyon doğruluğunu artırmak için tüm hastalık durumlarını temsil eden görüntüler seçilmelidir. Bu adımda yanlılığı önlemek için eğitim setine bol miktarda negatif boyama görüntüsü dahil edin.

Damlalık aracını seçerek ve bir görüntüdeki beyaz olan bir alanı belirleyerek eğitim setindeki görüntülerin beyaz dengesini ayarlayın. Doku segmentasyonuna geçmek için ilerleme düğmesini seçin. Ardından, analiz edilecek doku türlerini seçmek için doku kategorileri panelini kullanın; daha doğru protein doku lokalizasyonu için doku kategorileri seçimi kullanılabilir.

Eğitim görüntülerindeki hücre gruplarının etrafını kalem aracını kullanarak çizip, algoritmayı oluşturmaya ve doku kategorilerini tanımlamaya başlayın. Bir doku kategorisini tamamladığınızda, aynı adımı diğer doku kategorileri için tekrarlayın. Görüntüler içinde, söz konusu doku kategorisi tipi için karakteristik olan hücre gruplarını seçtiğinizden emin olun.

Doku segmentleyici eğitimi için dahil edilecek bileşenleri seçin. Doku segmentleyicisini eğitmek için uygun bir desen ölçeği belirleyin. Ardından, eğitilmiş doku segmentleyici düğmesini seçin.

Doğru sınıflandırılmış eğitim bölgeleri içindeki piksellerin oranının doğruluğunu gösteren bir açılır pencereyi gözlemleyin. Görüntüleri segmente et butonuna tıklayarak tüm eğitim görüntü kümesini segmente edin. İşlem tamamlandığında, mevcut eğitim algoritmasıyla yanlış sınıflandırılmış herhangi bir doku olup olmadığını belirlemek için eğitim kümesini inceleyin.

Doku segmentasyonu algoritma sonuçlarından emin olduğunuzda ilerle butonunu seçin. Sitoplazma ve/veya membranı seçebilmek için çekirdeklerin halihazırda seçili olduğundan emin olun. Çekirdek sekmesini seçin ve nükleer segmentasyon için uygun ayarları belirleyin.

Ardından, segmentasyona bireysel doku kategorilerinin mi yoksa tüm doku kategorilerinin mi dahil edileceğini seçin. İyi sonuçlar elde etmek için basitleştirilmiş bir yöntem olan karşı boyama nesne tabanlı eşik yaklaşımını seçin. Daha sonra, güvenilir bir nükleer karşı boyama üzerinde nesne tabanlı eşik yaklaşımını seçin.

Sitoplazma sekmesini seçerek sitoplazma şekilli parametreleri belirleyin. Ardından, çekirdeğe olan dış mesafeyi seçin. Sonra minimum boyutu seçin.

Birincil, ikincil ve seçmeli üçüncül seçenekler olacak şekilde bir sonraki opsiyon bileşenini seçin. Membran sekmesine geçin. Kullanılan membrana özgü belirteç için ilk olanı seçin.

Hücre membranlarındaki her bir belirteç için minimum bir eşik veya pozitif değer belirlemek amacıyla tam ölçek optik yoğunluğu veya OD'yi ayarlayın. Membran sekmesi altında devam ederek maksimum hücre boyutunu seçin. Tüm seçenekleri belirledikten sonra hepsini segmente et (segment all) seçeneğini seçin.

Ayarları görüntülere uygulayın ve görüntüleri inceleyin. IHC skorlama adımına geçmek için "advance" seçeneğini belirleyin ve skorlanacak doku kategorisini seçin. İstenen skorlama türünü ve skorlama analizinde kullanılacak hücre kompartmanını seçin.

Ardından, bileşen verilerini görüntüle seçeneğini seçin ve ilgili bileşenler için pozitif hücrelerin boyanmasında uygun minimum optik yoğunluk eşiğini belirlemek amacıyla imleci eğitim görüntüleri üzerinde gezdirin. Doku segmentasyonu, hücre segmentasyonu ve skorlama değerleri aracılığıyla oluşturulan algoritmayı test etmek için eğitim setine ait verileri dışa aktarın; dışa aktarma dizini için yeni bir klasör oluşturmak üzere istemleri takip edin. Analizde oluşturulacak ve dahil edilecek görüntüleri ve tabloları seçin.

Ardından, "export for all" (tümü için dışa aktar) seçeneğini belirleyerek analizi gerçekleştirin. Analiz tamamlandığında, ayarların doğruluğunu değerlendirmek için hem yüksek hem de düşük boyanmaya sahip görüntülere ait hücre segmentasyonu ve skorlama verilerini inceleyin. Ayarlardan memnun kaldığınızda, algoritmayı aktif projeye kopyalamak için toplu analiz (batch analysis) sekmesine tıklayın.

Ardından yeni bir dışa aktarma dizini seçin ve analize dahil edilecek görüntüleri ve tabloları belirleyin. Giriş dosyaları seçeneği altından, toplu analize dahil edilecek tüm görüntüleri seçin. Analizi gerçekleştirmek için çalıştırma seçeneğini seçin.

İşlem tamamlandığında gözden geçirme birleştirme (review merge) sekmesine ilerleyin. Tümünü dahil et (include all) seçeneğini ve ardından analiz için özet veriler içeren veri sayfaları oluşturmak üzere birleştir (merge) seçeneğini seçin. Görüntülerin epitel ve stromal kısımlara ayrılması için eğitim prostat dokuları üzerinde gerçekleştirilmiştir.

Doku dışı bir bölme ile birlikte. Tüm görüntü setindeki doku tiplerini ve hastalık durumlarını temsil eden bir dizi eğitim görüntüsü, multispektral görüntüleme yazılımına aktarıldı. Stroma, epitel ve doku dışı olmak üzere doku kategorileri oluşturuldu ve kategoriler, eğitim görüntüleri üzerinde manuel çizimler yapılarak tanımlandı.

Doku segmentasyonu için bir algoritma oluşturulmuş ve görüntülerin eğitim setine uygulanmıştır. Dokular doğru şekilde segmente edilmiştir. Multiplex immünohistokimya tekniği kullanılarak, renk ve metrik sinyallerin örtüşmesine rağmen, ER-alfa nükleer ekspresyonu için pozitif olan hücreler kırmızı, AR için pozitif olanlar ise kahverengi olarak tanımlanmıştır. CD-147'nin hücre membranına özgü ekspresyonu, marker protein olarak siyah renkli E-cadherin kullanılarak kantifiye edilmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, parafinle gömülmüş dokularda protein ekspresyonunun ve ko-lokalizasyonun nasıl kantite edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.