Name: Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Öğrenin çoklanmış immuno-histokimyasal boyama ve multispektral görüntüleme yöntemiyle protein ekspresyonu ve ko-lokalizasyon kantifikasyonu. Bu teknik operatör özneliğini ortadan kaldırarak nöroloji ve patoloji araştırmalarında tekrarlanabilirliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar kendi imkanları ve hizmetlerin kullanımı için, Patoloji ve Laboratuar Tıp UW Bakanlığı tarafından desteklenen bir parçası ve UWCCC hibe P30 CA014520 olarak, Patoloji laboratuvarında Wisconsin çeviriyle ilgili araştırma Girişimleri Üniversitesi teşekkür ederim.

<ol><li>Valdman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+redox+pathway+enzymes+in+human+prostatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Quant+Cytol+Histol%22%5BJournal%5D)">Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue.</a> Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).</li>
<li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+tissue+by+construction+of+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Amplification of tissue by construction of tissue microarrays.</a> Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).</li>
<li>Jonmarker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+PDX-1+in+prostate+cancer%2C+prostatic+intraepithelial+neoplasia+and+benign+prostatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue.</a> APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).</li>
<li>McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCarty%2C+KS+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22">Arch Pathol Lab Med</a>. 109 (8), 716-721 (1985).</li>
<li>Volante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatostatin+receptor+type+2A+immunohistochemistry+in+neuroendocrine+tumors%3A+a+proposal+of+scoring+system+correlated+with+somatostatin+receptor+scintigraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy.</a> Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).</li>
<li>Muris, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+profiling+of+caspase+signaling+pathways+predicts+clinical+response+to+chemotherapy+in+primary+nodal+diffuse+large+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas.</a> Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).</li>
<li>Jaraj, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interobserver+reproducibility+of+interpretation+of+immunohistochemical+stains+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer.</a> Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).</li>
<li>Peters, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+tissue+organelles+by+a+combination+of+analytical+subcellular+fractionation+and+enzymic+microanalysis%3A+a+new+approach+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology.</a> J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
<li>Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorful+future+of+quantitative+pathology%3A+validation+of+Vectra+technology+using+chromogenic+multiplexed+immunohistochemistry+and+prostate+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays.</a> Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).</li>
<li>Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Path%3A+A+Watson-Like+Visit+to+the+Pathology+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab.</a> Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).</li>
<li>Fiore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+multispectral+imaging+in+automated+quantitative+scoring+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry.</a> J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+A+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Rizzardi, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+immunohistochemical+staining+measured+by+digital+image+analysis+versus+pathologist+visual+scoring%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring.</a> Diagn Pathol. 7, 42(2012).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fibrillar+collagens+and+extracellular+matrix+of+glandular+benign+prostatic+hyperplasia+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules.</a> PLoS One. 9 (10), e109102(2014).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+is+elevated+in+human+benign+prostatic+hyperplasia+specimens+compared+to+histologically+normal+prostate+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Exp+Urol%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue.</a> Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).</li>
<li>Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD147+expression+predicts+biochemical+recurrence+after+prostatectomy+independent+of+histologic+and+pathologic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features.</a> BMC Cancer. 15 (1), 549(2015).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finasteride+treatment+alters+tissue+specific+androgen+receptor+expression+in+prostate+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues.</a> Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).</li>
<li>Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+steroid+receptor+expression+and+localization+in+benign+prostatic+hyperplasia+varies+with+tissue+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment.</a> Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).</li>
<li>Taylor, C. R., Levenson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+II%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.</a> Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).</li>
<li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li>
<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).</li>
<li>Ong, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+pathological+immunohistochemistry+scoring+is+more+time-effective+than+conventional+scoring%2C+but+provides+no+analytical+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage.</a> Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Protein ifade değerlendirmek için geleneksel immunohistokimyasal kullanımı analizi 22,23 öznel, yarı nicel yöntemler ile sınırlıdır. Peşin platformları biyobelirtecin ifade ve lokalizasyon yüksek verimlilik analizi için yaratılmıştır. doku ve hücre içi bölmeleri hem Detaylı segmentasyon kullanıcıları diğer ilgi işaretleri ile biyobelirteç ifade, yerelleştirme ve ko-lokalizasyon çalışma sağlar. Daha önceki çalışmalarda, aynı hücresel bölme 18,20,21 lokalize proteinler incelemek için kullanılan, özel...

<html> İmmünohistokimya (IHC) doku içinde proteinin tespit edilmesi için standart bir laboratuar tekniğidir ve IHC hala yaygın olarak araştırma ve teşhis patoloji hem de kullanılır. İHK boyama değerlendirme sonuçlarının yorumlanması içine potansiyel önyargı tanıtan genellikle yarı-kantitatif olduğunu. Birçok yarı nicel yaklaşımlar son tanıya 1-4 içine boyanma yoğunluğu ve boyama ölçüde hem dahil olan geliştirilmiştir. Diğer sistemler daha iyi ifade 5. lokalize etmek için puanlama yoğunluğu ve hücre içi konumunu içerir. Birden fazla izleyiciler ortalama puanları Ortaklığın genellikle tek izleyici önyargı 6 etkilerini en aza indirmek için kullanılmaktadır. Bu çabalara rağmen, analiz öznellik hala 7 boyanma ölçüde değerlendirirken, özellikle kalır. İnsan girişten Protokol standardizasyon ve minimize öznellik doğru, tekrarlanabilir İHK sonuçlar yaratmak için her şeyden önemlidir. içerik &quot;&gt; dokular içinde protein ifadesini belirlemek için İHK yanı sıra diğer seçenek vardır. Böyle immunoblotting gibi diğer teknikler, protein ifadesini araştırmak için altın standart olarak görülüyor ise araştırma ayarı içinde, immünhistokimya geleneksel, protein lokalizasyonu 8 incelemek için bir araç olarak görülmüştür . belirlenmesi doku veya hücre bölmesi özgü ifade doku slaytlar üzerinde floresan antikor kullanımı makul bir uzlaşma vardır. hücre parçalanması veya lazer yakalama mikrodiseksiyon 9,10 olarak gelişmiş teknikler içeren olmadan zordur, ama nedeniyle NADPH arka plan otofloresansı, lipofuscins, retiküler lifler, kollajen, elastin ve 11 doğru niceleme zorlaştırabilir. Otomatik hesaplama patoloji platformları patoloji boyaması 12-15 daha objektif kantitatif için umut verici yönü vardır. Doku mikrodizinlerinde ile çok bantlı görüntüleme birleştirenbüyük örnek boyutlarda protein ekspresyonu yüksek verimli analizini kolaylaştırır. Kategorik biçimi 16 yerine, sürekli bir veri dönerken esas içsel hatalar ve analizi için gerekli zamanı hem de azaltarak, bu teknikler ile, protein, eş-lokalizasyonu, boyama heterojenliği ve doku ve hücre içi lokalizasyonu analizi mümkündür. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, çok bantlı görüntüleme yazılımı kullanılarak analiz ile çoklanmış immünohistokimyasal gerçekleştirmek için yararını ve metodolojisini göstermekti. Bu protokol, dört optimize monoklonal antikorlar ile tek bir doku bölüm slayt kılavuzu, multipleks immünohistokimyasal için yazılmıştır. bir temsili olarak, çekirdek anti-tavşan östrojen reseptörü alfa (ÖRa) ve androjen reseptörü (AR) zara-bağlı anti-fare CD147 ve membrana bağlı anti-fare E-kaderin ile çoklanır. tercih edilen herhangi bir antikorun substitut edilebilirBurada listelenen antikorlar için ed, ancak antikorların her kombinasyonu ayrı optimizasyon gerektirir. Tüm antikorlar için ön işleme tabi tutulması aynı olmalıdır. AR ve CD147 antikorlar, bir kokteyl olarak ayrı ayrı ve optimize edilmelidir. Her antikor, biyotin-bir polimer sistemi ve 4 benzersiz kromojenler biri kullanılarak tespit edilir.

<table><tbody><tr><td>Ksilen</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3F1GAL</td><td>NFPA derecesi: Sağlık &ndash; 2, Yangın &ndash; 3, Reaktivite &ndash; 0</td></tr><tr><td>Etil Alkol-200 kanıtı</td><td>Fisher Scientific</td><td>4355223</td><td>NFPA derecesi: Sağlık &ndash; 0, Ateş &ndash; 3, Reaktivite &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>NFPA derecesi: Sağlık &ndash; 2, Ateş &ndash; 0 , Reaktivite &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Hidroksimetil aminometan HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td>NFPA derecesi: Sağlık &ndash; 2, Ateş &ndash; 0 , Reaktivite &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Chem-Impex</td><td>1512</td><td>NFPA derecesi: Sağlık &ndash; 0, Ateş &ndash; 1 , Reaktivite &ndash; 0</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td>NFPA değerlendirmesi: Sağlık &ndash; 1, Ateş &ndash; 0 , Tepkime &ndash; 0</td></tr><tr><td>Peroksidalı</td><td>Biocare Medical</td><td>PX968</td><td>Cilt ve gözlerle temasından kaçının. Ciltte tahrişe ve göz hasarına neden olabilir.</td></tr><tr><td>Östrojen Reseptörü alfa</td><td>Thermo Fisher Scientific-Labvision</td><td>RM9101</td><td>Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış</td></tr><tr><td>Androjen Reseptörü</td><td>SCBT</td><td>sc-816</td><td>Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış</td></tr><tr><td>CD147</td><td>Biyotasarım</td><td>P87535M</td><td>Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış</td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>Dako</td><td>M3612</td><td>Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış</td></tr><tr><td>Renoir Red Andibody Seyreltici</td><td>Biocare Tıbbi</td><td>PD904</td><td>Tris bazlı antikorlarla çalışmak üzere özel olarak tasarlanmıştır</td></tr><tr><td>DeCloaking Chamber&nbsp;</td><td>Biocare Medical</td><td>Model DC2002</td><td>Düdüklü tencere kullanmak için normal önlemleri alın</td></tr><tr><td>Bariyer kalemi-Immuno Edge&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Denatüre Etme Kiti-Elüsyon adımı</td><td>Biocare Medical</td><td>DNS001H</td><td>Tehlikeli olarak sınıflandırılmamıştır</td></tr><tr><td>Mach 2 Keçi anti-Tavşan HRP Polimer</td><td>Biocare Medical</td><td>RHRP520</td><td>Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış</td></tr><tr><td>Mach 2 Keçi anti-Tavşan AP Polimer</td><td>Biocare Medical</td><td>RALP525</td><td>Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış</td></tr><tr><td>Mach 2 Keçi anti-Fare HRP Polimer</td><td>Biocare Medical</td><td>M3M530</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Betazoid DAB Kromojen Kiti</td> olarak sınıflandırılmamıştır <td>Biocare Medical</td><td>BDB2004</td><td>1. DAB'ın şüpheli bir kanserojen olduğu bilinmektedir. 2. DAB bileşenlerini güçlü ışığa veya doğrudan güneş ışığına maruz bırakmayın. 3. Uygun kişisel koruyucu ekipman ve giysi giyin. 4. DAB ciltte hassaslaşmaya neden olabilir. Cilt ve gözlerle temasından kaçının. 5. İmha ile ilgili tüm federal, eyalet ve yerel çevreyi gözlemleyin</td></tr><tr><td>Çözgü Kırmızı Kromojen Kiti</td><td>Biocare Medical</td><td>WR806</td><td>Aşındırıcı. Ciltte tahrişe veya göz hasarına neden olabilecek asit.</td></tr><tr><td>Vina Green Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>BRR807</td><td>Yutulması halinde zararlı</td></tr><tr><td>Bajoran Purple Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>BJP807</td><td>Yanıcı sıvı. Isıdan, alevden ve kıvılcımlardan uzak tutun. Yutulması veya emilmesi yoluyla zararlıdır. Cilt veya gözlerle temasından kaçının ve solumaktan kaçının.</td></tr><tr><td>Kedi Hematoksilen</td><td>Biyobakım Medikal</td><td>CATHE</td><td>Mor &nbsp; çözüm &nbsp; &nbsp; ile; bir &nbsp; hafif & nbsp; asetik & nbsp; asit & nbsp; (sirke) &nbşk; koku. &nbsp; Mayıs &nbsp; be &nbsp; tahriş edici & nbsp; ile &nbsp; cilt & nbsp; veya &nbsp; Göz. &nbsp; Kaçının &nbsp; İLETİŞİM & nbsp; &nbsp; ile; cilt & nbsp; ve &nbsp; Göz. &nbsp; Kaçının &nbsp; Yenmesi.</td></tr><tr><td>XYL Montaj Ortamı</td><td>Richard Allen</td><td>8312-4</td><td>NFPA derecesi: Sağlık &ndash; 2, Yangın &ndash; 3 , Reaktivite &ndash; 0</td></tr><tr><td>1.5 Lameller</td><td>Fisher Marka</td><td>22266858</td><td>Keskin kenarlar</td></tr><tr><td>Kuluçka (Nem)Hazne</td><td>eski</td><td></td> Eski <td>Birden fazla satıcı mevcut</td></tr><tr><td>Konveksiyonlu Fırın</td><td>Stabil- Therm</td><td>C-4008-Q</td><td></td></tr><tr><td>Arka Plan Punisher Engelleme Reaktifi</td><td>Biocare Medical</td><td>BP974</td><td>Bu ürün tehlikeli olarak sınıflandırılmamıştır.</td></tr><tr><td>inForm yazılımı</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS135781</td><td>El yazmalarında kullanılan birincil multispektral görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>Nuance yazılımı</td><td>PerkinElmer</td><td>Nuance EX</td><td>El yazması içinde spektral kütüphaneler yapmak için kullanılan yazılım</td></tr><tr><td>Vectra mikroskobu ve slayt tarayıcı</td><td>PerkinElmer</td><td>VECTRA</td><td>IM3 görüntü küplerini elde etmek için otomatik slayt tarayıcı ve mikroskop</td></tr></tbody></table>

Çoklanmış immuno-histokimyasal boyanması ve multispektral görüntüleme kullanma protein ekspresyonu ve co-lokalizasyon kantifikasyonu

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

İmmünohistokimya, dokulardaki protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir klinik ve araştırma laboratuvarı tespit tekniğidir. İmmünohistokimya kullanılarak ekspresyon skorlaması için birçok yarı kantitatif sistem geliştirilmiştir, ancak doğal öznellik sonuçların tekrarlanabilirliğini ve doğruluğunu sınırlar. Ayrıca, nükleer transkripsiyon faktörleri gibi uzamsal olarak örtüşen biyobelirteçlerin araştırılması mevcut immünohistokimya teknikleri ile zordur. Çoğullanmış immünohistokimya ve multispektral görüntülemenin yüksek verimli yöntemlerini kullanarak çoklu proteinlerin eşzamanlı olarak araştırılması için bir sistem geliştirdik ve optimize ettik. Çoğullanmış immünohistokimya, primer antikorların yaban turpu peroksidaz veya alkalen fosfataza konjuge edilmiş sekonder antikorlarla ardışık olarak uygulanmasıyla gerçekleştirilir. İlgilenilen her bir proteini tespit etmek için farklı kromojenler kullanılır. Lekeli slaytlar otomatik bir slayt tarayıcıya yüklenir ve otomatik görüntü alımı için bir protokol oluşturulur. Bir spektral kitaplık, her birinde tek bir kromojen bulunan bir dizi slaytın boyanmasıyla oluşturulur. Temsili lekeli görüntülerin bir alt kümesi multispektral görüntüleme yazılımına aktarılır ve görüntülerdeki doku bölmeleri tanımlanarak doku tipini ayırt etmek için bir algoritma oluşturulur. Hücre altı bölmeler, hematoksilen karşı boyası kullanılarak ve içsel algoritma ayarlanarak bölümlere ayrılır. Pozitifliği ve protein kolokalizasyonunu belirlemek için eşikleme uygulanır. Son algoritma daha sonra tüm doku setine uygulanır. Elde edilen veriler, kullanıcının doku tipine (örn. epitel ve stroma) ve hücre altı bölmeye (çekirdeğe karşı sitoplazmaya karşı plazma zarı) dayalı olarak protein ekspresyonunu değerlendirmesine olanak tanır. Ko-lokalizasyon analizi, çift pozitif, çift negatif ve tek pozitif hücre tiplerinin araştırılmasına izin verir. Multispektral görüntülemeyi çoğullanmış immünohistokimya ve otomatik görüntü elde etme ile birleştirmek, dokulardaki biyobelirteçlerin araştırılması için objektif, yüksek verimli bir yöntemdir.

Şekil 1 &#39;de, bir eğitim olmayan doku bölümünde birlikte, stromal ve epitelyal kısımlarına kademeli görüntüleri prostat dokuları üzerinde gerçekleştirilir. Epitelyal membran markör E-kadherin kullanarak, hücre parçalara ayırma, Şekil 2&#39;de gösterilen çekirdek, sitoplazma ve membran kısımları, ayrı yapıldı. Bir deneyde, Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, AR ve ÖRa, E-kadhe...

İmmünohistokimya, dokulardaki protein lokalizasyonunu ve ekspresyonunu değerlendirmek için güçlü bir laboratuvar tekniğidir. Kantitasyon için mevcut yarı otomatik yöntemler öznelliği ortaya çıkarır ve çoğu zaman tekrarlanamaz sonuçlar yaratır. Burada, multispektral görüntüleme kullanılarak çoğullanmış immünohistokimya ve protein ekspresyonunun objektif kantitasyonu ve ko-lokalizasyonu için yöntemler tanımlanmıştır.

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Bu yöntemin genel amacı, multispektral görüntüleme kullanarak protein ekspresyonunu ve ko-lokalizasyonunu objektif olarak nicelendirmektir. Bu yöntem, temel araştırma ve tanısal patoloji alanındaki, proteinlerin tedavi sonrası veya hastalık ilerlemesinde ekspresyon ve lokalizasyonlarının nasıl değiştiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel nicelendirme yöntemlerinde bulunan operatör subjektifliğini ortadan kaldırmasıdır.Nicelleme işlemine başlamak için, önceden hazırlanmış, tekil kromojenlerle boyanmış kontrol lamlarından ve hematoksilinle boyanmış lamdan bir spektral kütüphane oluşturmak üzere multispektral görüntüleme yazılımını açın. Ardından, bir kontrol lamından elde edilen bir görüntü küpünü açın ve kromojeni optik olarak tanımlamak için pozitif boyanmış dört ila beş alan seçin. Tüm kromojenleri temsil eden eksiksiz bir spektral kütüphane oluşturulana kadar diğer kontrol lamlarına ait görüntü küpleriyle aynı adımları tekrarlayın ve ardından spektral kütüphaneyi kaydedin.Görüntü formatı seçeneği için Multispectral veya im3'ü, numune formatı için ise Brightfield'ı seçerek multispektral görüntüleme yazılımı içinde yeni bir proje başlatın. Segment tissue, find features, phenotyping, score ve export seçeneklerini belirleyerek projeyi yapılandırın. Arzu edilirse, analiz süresini hızlandırmak için görüntü çözünürlüğünü değiştirin.Daha önce oluşturulmuş olan spektral kütüphaneyi içe aktarın ve analizde yer alacak tüm kromojenleri seçin. Eğitim veri setine dahil edilecek görüntü küplerini, Görüntü Küpünü Aç seçeneğini seçerek açın. Eğitim doğruluğunu sağlamak için, analiz edilecek toplam görüntü sayısının en az %18'ini seçin.Ardından, eğitim için kullanılacak görüntü setini seçin. Segmentasyon doğruluğunu artırmak için tüm hastalık durumlarını temsil eden görüntüler seçilmelidir. Bu adımda yanlılığı önlemek için eğitim setine bol miktarda negatif boyama görüntüsü dahil edin.Damlalık aracını seçerek ve bir görüntüdeki beyaz olan bir alanı belirleyerek eğitim setindeki görüntülerin beyaz dengesini ayarlayın. Doku segmentasyonuna geçmek için ilerleme düğmesini seçin. Ardından, analiz edilecek doku türlerini seçmek için doku kategorileri panelini kullanın; daha doğru protein doku lokalizasyonu için doku kategorileri seçimi kullanılabilir.Eğitim görüntülerindeki hücre gruplarının etrafını kalem aracını kullanarak çizip, algoritmayı oluşturmaya ve doku kategorilerini tanımlamaya başlayın. Bir doku kategorisini tamamladığınızda, aynı adımı diğer doku kategorileri için tekrarlayın. Görüntüler içinde, söz konusu doku kategorisi tipi için karakteristik olan hücre gruplarını seçtiğinizden emin olun.Doku segmentleyici eğitimi için dahil edilecek bileşenleri seçin. Doku segmentleyicisini eğitmek için uygun bir desen ölçeği belirleyin. Ardından, eğitilmiş doku segmentleyici düğmesini seçin.Doğru sınıflandırılmış eğitim bölgeleri içindeki piksellerin oranının doğruluğunu gösteren bir açılır pencereyi gözlemleyin. Görüntüleri segmente et butonuna tıklayarak tüm eğitim görüntü kümesini segmente edin. İşlem tamamlandığında, mevcut eğitim algoritmasıyla yanlış sınıflandırılmış herhangi bir doku olup olmadığını belirlemek için eğitim kümesini inceleyin.Doku segmentasyonu algoritma sonuçlarından emin olduğunuzda ilerle butonunu seçin. Sitoplazma ve/veya membranı seçebilmek için çekirdeklerin halihazırda seçili olduğundan emin olun. Çekirdek sekmesini seçin ve nükleer segmentasyon için uygun ayarları belirleyin.Ardından, segmentasyona bireysel doku kategorilerinin mi yoksa tüm doku kategorilerinin mi dahil edileceğini seçin. İyi sonuçlar elde etmek için basitleştirilmiş bir yöntem olan karşı boyama nesne tabanlı eşik yaklaşımını seçin. Daha sonra, güvenilir bir nükleer karşı boyama üzerinde nesne tabanlı eşik yaklaşımını seçin.Sitoplazma sekmesini seçerek sitoplazma şekilli parametreleri belirleyin. Ardından, çekirdeğe olan dış mesafeyi seçin. Sonra minimum boyutu seçin.Birincil, ikincil ve seçmeli üçüncül seçenekler olacak şekilde bir sonraki opsiyon bileşenini seçin. Membran sekmesine geçin. Kullanılan membrana özgü belirteç için ilk olanı seçin.Hücre membranlarındaki her bir belirteç için minimum bir eşik veya pozitif değer belirlemek amacıyla tam ölçek optik yoğunluğu veya OD'yi ayarlayın. Membran sekmesi altında devam ederek maksimum hücre boyutunu seçin. Tüm seçenekleri belirledikten sonra hepsini segmente et (segment all) seçeneğini seçin.Ayarları görüntülere uygulayın ve görüntüleri inceleyin. IHC skorlama adımına geçmek için "advance" seçeneğini belirleyin ve skorlanacak doku kategorisini seçin. İstenen skorlama türünü ve skorlama analizinde kullanılacak hücre kompartmanını seçin.Ardından, bileşen verilerini görüntüle seçeneğini seçin ve ilgili bileşenler için pozitif hücrelerin boyanmasında uygun minimum optik yoğunluk eşiğini belirlemek amacıyla imleci eğitim görüntüleri üzerinde gezdirin. Doku segmentasyonu, hücre segmentasyonu ve skorlama değerleri aracılığıyla oluşturulan algoritmayı test etmek için eğitim setine ait verileri dışa aktarın; dışa aktarma dizini için yeni bir klasör oluşturmak üzere istemleri takip edin. Analizde oluşturulacak ve dahil edilecek görüntüleri ve tabloları seçin.Ardından, "export for all" (tümü için dışa aktar) seçeneğini belirleyerek analizi gerçekleştirin. Analiz tamamlandığında, ayarların doğruluğunu değerlendirmek için hem yüksek hem de düşük boyanmaya sahip görüntülere ait hücre segmentasyonu ve skorlama verilerini inceleyin. Ayarlardan memnun kaldığınızda, algoritmayı aktif projeye kopyalamak için toplu analiz (batch analysis) sekmesine tıklayın.Ardından yeni bir dışa aktarma dizini seçin ve analize dahil edilecek görüntüleri ve tabloları belirleyin. Giriş dosyaları seçeneği altından, toplu analize dahil edilecek tüm görüntüleri seçin. Analizi gerçekleştirmek için çalıştırma seçeneğini seçin.İşlem tamamlandığında gözden geçirme birleştirme (review merge) sekmesine ilerleyin. Tümünü dahil et (include all) seçeneğini ve ardından analiz için özet veriler içeren veri sayfaları oluşturmak üzere birleştir (merge) seçeneğini seçin. Görüntülerin epitel ve stromal kısımlara ayrılması için eğitim prostat dokuları üzerinde gerçekleştirilmiştir.Doku dışı bir bölme ile birlikte. Tüm görüntü setindeki doku tiplerini ve hastalık durumlarını temsil eden bir dizi eğitim görüntüsü, multispektral görüntüleme yazılımına aktarıldı. Stroma, epitel ve doku dışı olmak üzere doku kategorileri oluşturuldu ve kategoriler, eğitim görüntüleri üzerinde manuel çizimler yapılarak tanımlandı.Doku segmentasyonu için bir algoritma oluşturulmuş ve görüntülerin eğitim setine uygulanmıştır. Dokular doğru şekilde segmente edilmiştir. Multiplex immünohistokimya tekniği kullanılarak, renk ve metrik sinyallerin örtüşmesine rağmen, ER-alfa nükleer ekspresyonu için pozitif olan hücreler kırmızı, AR için pozitif olanlar ise kahverengi olarak tanımlanmıştır. CD-147'nin hücre membranına özgü ekspresyonu, marker protein olarak siyah renkli E-cadherin kullanılarak kantifiye edilmiştir.Bu videoyu izledikten sonra, parafinle gömülmüş dokularda protein ekspresyonunun ve ko-lokalizasyonun nasıl kantite edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

quantitation-protein-expression-co-localization-using-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

Detaylı bir iletişim kuralı için bir altı-marker multiplex ayirt panel en iyi duruma getirilmiş ve gerçekleştirilen, daha tutarlı sonuçlar ve daha kısa işlem süresi için bir otomatik stainer kullanarak. Bu yaklaşım doğrudan IMMUNO-Onkoloji araştırmalar amaçlı herhangi bir laboratuvar tarafından adapte edilebilir.

IMMUNO-Onkoloji araştırmalar Formalin sabit Karsinomu doku örnekleri Multiplex ayirt Panel otomatik

Burada tarif biz multiplex floresan immunohistokimyasal boyama ve lenfoma içinde birden fazla kanser ilişkili antijenleri eş zamanlı yerelleştirme için görüntüleme için bir iletişim kuralı. Bu iletişim kuralı tüm doku bölümleri içinde biyolojik colocalization analizine genişletilebilir.

Çoğaltılmış floresan immunohistokimyasal boyama, görüntüleme ve analiz lenfoma histolojik örneklerinde

Burada, formalin-sabit parafin gömülü tümör doku bölümlerinde bağışıklık hücrelerini görselleştirmek, ölçmek ve haritalamak için basit ve erişilebilir bir strateji tanımlıyoruz. Bu metodoloji, mevcut görüntüleme ve dijital analiz tekniklerini görüntüleme testlerinin çoklama yeteneğini ve multiparametre analizini genişletmek amacıyla birleştirir.

Tümör Mikroortamında Bağışıklık Hücre Popülasyonlarının Görselleştirilmesi, Ölçülmesi ve Haritalanması

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Çok katlı barkodlama görüntü analizi son zamanlarda tümör mikroçevresinin karakterizasyonunu geliştirmiş ve hücre kompozisyonu, fonksiyonel durum ve hücre-hücre etkileşimleri hakkında kapsamlı çalışmalara izin vermiştir. Burada, oligonükleotid konjuge antikorların barkodlamasını ve siklus görüntülemeyi kullanarak, yüksek boyutlu bir görüntü analiz tekniğinin kullanılmasına izin veren bir boyama ve görüntüleme protokolünü tanımlıyoruz.

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Bu makalede, manuel tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) multipleks immünofloresan (mIF) protokolü ile birlikte görüntü analizi ve uzamsal analiz anlatılmaktadır. Bu protokol, laboratuvarda bulunan slayt tarayıcısına bağlı olarak slayt başına iki ila altı antijenin boyanması için formalin sabit parafin gömülü (FFPE) bölümlerle birlikte kullanılabilir.

Multipleks İmmünofloresan, Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Uzamsal Görüntü Analizi ile Kombine Edildi

Bu deneysel protokol, esas olarak tek kanallı antikor inkübasyon koşullarını optimize ederek ve klinik kökenli akciğer kanseri dokularında otofloresan ve kanal karışma problemlerini çözmek için antikorların ve kanalların ayarlarını ayarlayarak bir multipleks immünohistokimya (IHC) boyama yöntemini tanımlar ve optimize eder.

Parafine Gömülü Akciğer Kanseri Dokusu için Multipleks İmmünohistokimya Boyama

Bu rapor, otomatik bir slayt boyayıcı üzerinde multipleks immünofloresan (mIF) testleri için otomatik bir protokolü açıklar. Translasyonel araştırmalarda çok sayıda doku slaytında özel mIF tahlilleri için ideal olan standart yüksek verimli doku otomatik boyalayıcıları ve tam slayt floresan görüntüleyiciler üzerinde uzamsal proteomiklerin yüksek tekrarlanabilirliğini gösterir.

Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri

Bu protokol, formalin sabit parafine gömülü doku kesitlerinde protein görüntüleme kütle sitometrisi ile multipleks mRNA tespiti için bir metodolojiyi detaylandırır.

Çift modaliteli Moleküler Kartografi: Multipleks mRNA Tespitinin Protein Görüntüleme Kütle Sitometrisi ile Entegre Edilmesi

Öğrenin çoklanmış immuno-histokimyasal boyama ve multispektral görüntüleme yöntemiyle protein ekspresyonu ve ko-lokalizasyon kantifikasyonu. Bu teknik operatör özneliğini ortadan kaldırarak nöroloji ve patoloji araştırmalarında tekrarlanabilirliği artırır.

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu (Video) | JoVE Journal

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Daha fazla video keşfet