Çift Floresan birleştiren In Situ Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Bu deneyin genel amacı, çift floresan in situ hibridizasyon ve ardından immün boyama kullanarak beyin bölümlerinde üç farklı genin ekspresyonunu aynı anda tespit etmektir. Bu yöntem, sinirbilim alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, örneğin hangi hücre tipi ilgilendiğim geni ifade ediyor? Bu tekniğin ana avantajı, ilgilendiğiniz genin ekspresyonunu belirli bir hücre tipine lokalize edebilmek için iyi bir antikora ihtiyacınız olmamasıdır.

Bu prosedürü özetlemek gerekirse, ilk gün, sabit doku kesitleri kesilir ve gece boyunca iki farklı etiketli RNA probu ile hibritlenir. İkinci gün, bölümler FITC işaretli probu hedefleyen bir antikor ile gece boyunca inkübe edilir. Bu antikor, üçüncü günde bir floresan Tyramide ilavesini katalize eden yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilir.

Daha sonra, DIG işaretli probu hedeflemek için bir alkalin fosfataz konjuge antikor kullanılır. Dördüncü günde, bu enzim Fast Red çözeltisi ile inkübe edildiğinde floresan çökelti oluşumunu katalize eder. Daha sonra kesitler, ilgilenilen bir proteini hedef alan bir primer antikor ile gece boyunca inkübe edilir.

Son olarak, beşinci günde, bu protein bir florofor konjuge ikincil antikor ile görselleştirilir. Bu prosedüre başlamak için, RNA polimeraz promotörleri olan bir plazmitte ilgilenilen genin cDNA dizisini içeren bir DNA klonu seçin. Daha sonra, DNA klonunu büyütün, plazmiti küçük ölçekli bir plazmit saflaştırma kiti ile ekstrakte edin ve bir T7 ve SP6 evrensel primerleri ile dizileyin.

10 ila 20 mikrogram plazmit DNA'yı, cDNA'nın duyu zincirinin beş ana ucunu kesen bir kısıtlama enzimi ile sindirin. 37 santigrat derecede 1,5 saat inkübe edin. Ardından, plazmidin tamamen doğrusallaştırıldığını kontrol etmek için bir agaroz jeli üzerinde küçük bir alikot çalıştırın.

Doğrusallaştırılmış plazmidi saflaştırmak için, üç molar sodyum asetatın hacminin 1 / 10'u, bir hacim 10 milimolar Tris-HCl eşdeğer fenol ve bir hacim kloroform izoamil alkol ekleyin. Oda sıcaklığında bir dakika boyunca 16.000 Gs'de santrifüjleyin ve üst sulu fazı çıkarın. Sonra bir hacim kloroform IAA ekleyin.

Bir dakika boyunca 16.000 Gs'de santrifüjleyin ve üst sulu fazı çıkarın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Ardından, iki hacim etanol ekleyin ve bir saat veya gece boyunca eksi 20 santigrat derecede tutun.

Bundan sonra, 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 16.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti% 70 soğuk etanol ile yıkayın. Daha sonra, 2.5 mikrolitre başına bir mikrogram cDNA konsantrasyonunda TE'de yeniden süspanse edin.

İki probu sentezlemek için önce uygun RNA polimerazı seçin. Ardından, in vitro transkripsiyon reaksiyonunu hazırlayın ve son hacmi DEPC ile arıtılmış su ile 20 mikrolitreye getirin. 37 santigrat derecede 1.5 saat inkübe edin.

Daha sonra, reaksiyonun işe yarayıp yaramadığını kontrol etmek için% 1'lik bir agaroz jel üzerinde bir mikrolitre transkripsiyon reaksiyonu çalıştırın. Jel, doğrusal şablonu ve probun parlak bir bandını göstermelidir. Bu prosedürde, bir kriyostatta donmuş dokunun 15 mikrometre kalınlığında kesitlerini kesin.

Bölümleri mikroskop slaytlarının üzerine toplayın ve dokuların slaytlara yapışmasını sağlamak için slaytları bir saat kurumaya bırakın. Bu prosedürün iyi işlemesi için en önemli faktör bölümlerin kalitesidir. Bu, kısmen iyi perfüze edilmiş ve sabit dokuya sahip olmaya ve kısmen de RNaz kontaminasyonu içermeyen düz bölümler elde etmek için kesit alma tekniğine bağlıdır.

Ardından, iki probu önceden 65 santigrat dereceye ısıtılmış hibridizasyon tamponunda seyreltin ve iyice karıştırın. Her slayta 300 mikrolitre hibridizasyon karışımı uygulayın ve fırında pişmiş bir kapak fişi ile örtün. Daha sonra, slaytları gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 65 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, slaytları önceden ısıtılmış yıkama tamponu içeren bir Coplin kavanozuna aktarın ve slaytları 65 santigrat derecede iki kez 30 dakika yıkayın. Bundan sonra, slaytları oda sıcaklığında MABT yıkama solüsyonu ile üç kez 10 dakika yıkayın. Bu adımda, doku bölümlerinin etrafına daireler çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın.

Daha sonra slaytları nemlendirilmiş bir odada ISH engelleme tamponu ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, slaytları gece boyunca 4 santigrat derecede yaban turpu peroksitlenmiş konjuge anti-fitc antikoru ile inkübe edin. Ardından, slaytları PBST içeren bir coplin kavanozuna yerleştirin.

Her seferinde 10 dakika boyunca PBST'de üç kez yıkayın ve her seferinde yeni PBST ile değiştirin. Daha sonra slaytlara floresan tiromit ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Slaytları bir coplin kavanozuna koyun ve PBST'de üç kez 10 dakika yıkayın.

Daha sonra, slaytları oda sıcaklığında bir saat boyunca ISH engelleme tamponu ile inkübe edin. Ardından, slaytları gece boyunca dört santigrat derecede bir alkalin fosfataz konjuge anti-kazma antikoru ile inkübe edin. Bundan sonra, her seferinde 10 dakika boyunca MABT ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, slaytları oda sıcaklığında beş dakika boyunca pH 8.2'de 0.1 molar tris HCL ile iki kez yıkayın. Hızlı kırmızı çözeltiyi süzün ve slaytları nemlendirilmiş bir odada hızlı kırmızı çözelti ile 37 derece Celcius'ta inkübe edin. Optimum gelişme süresi değiştikçe, çökelti oluşumunu izlemek için slaytları düzenli olarak bir floresan mikroskobu ile kontrol edin.

Ardından, her seferinde 10 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın. İmmünohistokimya yapmak için, slaytları nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında bir saat boyunca IHC bloke edici tampon ile inkübe edin. Daha sonra, slaytları birincil antikor çözeltisi içinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, slaytları PBST ile üç kez 10 dakika yıkayın. Onları ikincil antikor çözeltisinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, her seferinde 10 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, slaytları oda sıcaklığında kısmen kurutun ve bir floresan montaj ortamı ile monte edin. Slaytları konfokal mikroskopta görüntülemeden önce kurumaya bırakın. Burada, Aspa ve Mbp için ISH'den temsili görüntüler gösterilmekte, ardından kanca boyama ile birlikte OLIG2 için immüno-boyama gösterilmektedir.

Aspa, kortekste ve korpus kallozumda bazı MBP pozitif OLIG2 pozitif hücrelerde eksprese edildi. Bazı Mbp pozitif OLIG2 pozitif hücreler Aspa'yı eksprese etmez. Bu prosedürü gerçekleştirirken, dilimleri ve tüm çözeltileri RNase kontaminasyonundan uzak tutmayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, N-sitrin inhibizasyonu ve immünohistokimya ile gen ekspresyon kalıplarının nasıl çalışılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, farklı kökenlere ve gelişim aşamalarına sahip çeşitli dokular için uyarlanabilir.