Name: Çift Floresan birleştiren In Situ Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Öğrenin, fare beyin kesitlerinde üç genin eşzamanlı ifadesini çift floresan in situ hibridizasyon ve immünoişaretleme ile tespit etme yöntemini. Bu teknik, antikor bulunmadığında da gen ifadesini hücre tiplerine lokalize etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların laboratuvarlarındaki çalışmalar, Birleşik Krallık Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BB/J006602/1 ve BB/L003236/1), Wellcome Trust (WT100269MA) ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC, "Fikirler" Programı 293544) tarafından desteklenmiştir. SJ, EMBO uzun vadeli bir burs tarafından desteklendi. Yazarlar teknik yardımı için Stephen Grant'e teşekkür eder.

Etik Beyanı: Fare hayvancılık ve taşıma Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler), Birleşik Krallık ve Değişiklik Yönetmeliği 2012 Yasası 1986 ile uyumlu, UK Home Office düzenlemeleri ve UCL etik komite kurallarına uygundur. NOT: Tüm çözümler dietil pyrocarbonate (DEPC) ile yapılmalıdır - herhangi bir kalıntı RNAaz ari yok etmek için arıtılmış su. tüm DEPC globülleri sonra kayboldu DEPC aşağılamak için otoklav kadar DEPC tedavi için, DEPC (litre başına 1 ml) ekleyin, şiddetle çalkalanır. 1. RNA Probe Sentezi <ol><li> DİKKAT: formamid tutarken, Kişisel Koruyucu Ekipman (KKE) aşınma ve güvenlik kabini kullanın. Hibridizasyon tamponu hazırlayın: DEPC ile muamele edilmiş% 50 (h / h) deiyonize formamid, mM Tris-HCI, pH 7.5, 200 mM NaCI, 5 mM EDTA, 10 ile, iyonu giderilmiş suyun 5 mM NaH 2 PO 4, 5 mM Na-2 HPO 4, 0.01 mg / ml maya tRNA, 1 x Denhardt solutiilgili ve% 10 / h dekstran sülfat ağ. </li><li> RNA polimeraz promotörüne sahip bir plazmid olarak, ilgi konusu genin cDNA dizisini ihtiva eden bir DNA klonu seçin. Bu örnek için, Aspa için T7 ve SP6 RNA polimeraz promoterleri (Ek Şekil 1) sahip bir pCMV-SPORT6 klon, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934) kullanın. </li><li> şablon olarak doğrusallaştırılmış plazma DNA hazırlanır. <ol><li> DNA klonunun büyütün T7 ve SP6 evrensel primerler ile üreticinin protokolüne ve sırasına göre, küçük-ölçekli bir plazmid arındırma kiti ile plazmid ekstrakte edin. </li><li> cDNA&#39;nın yönlü sarmal kolunun 5 &#39;ucunda kesen bir sınırlama enzimi ile 1.020 | ig plazmid DNA Digest. Bu örnek için, pCMV-SPORT6- Aspa plazmid sindirimi 100 birim SalI kullanın. 37 o C&#39;de 1.5 saat süreyle inkübe edin </li><li> plazmid tamamen doğrusallaştırılmış olup olmadığını kontrol etmek bir agaroz jel üzerinde küçük bir kısım çalıştırın. </li></ol></li><li> arındırmakfenol-kloroform kullanılarak doğrusallaştırılmış plazmit kullanmak avantajlıdır. <ol><li> 3 M sodyum asetatın 1/10 hacmi, 10 mM Tris HCI (pH 8.0), bir hacim ekleyin - dengelenmiş fenol ve kloroform / izoamil alkol (IAA), bir hacim (24: 1). </li><li> (- 25 ° C, RT 20) ve özü, üst sulu faz, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 1 dakika için 16,000 x g&#39;de kloroform / IAA, santrifüj, bir hacim ekleyin ve üst akıcı faz ekstrakte edin. </li><li> Adımı tekrarlayın 1.4.3. </li><li> Etanol 2 hacimleri ekleyin ve 1 saat ya da O / N -20 o C&#39;de bırakın. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin. süpernatant atın. </li><li> % 70 soğuk etanol ile pelet yıkanır ve TE içinde 2.5 ul başına approximatively 1 ug cDNA (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 7.5) yeniden askıya. </li></ol></li><li> İki prob, digoxigenin (DIG) ile etiketlenmiş bir ve flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile diğer sentez. <ol><li> Anti-se yapmak için uygun RNA polimeraz seçin(Hedefe mRNA tamamlayıcı) nse sonda. Bu örnek için, Aspa probu yapmak için T7 RNA polimerazını kullanır. </li><li> In vitro transkripsiyon reaksiyonu hazırlayınız: 1 linearize DNA ug, 4.0 ul 5 x transkripsiyon tamponu, 100 mM DTT, 6.0 ul 10x DIG ya da FITC RNA işaretleme karışımı içeren dNTP 2.0 ul, 1 ul RNaz inhibitörü ve 20 - Tr 40 RNA polimerazının birim; DEPC arıtılmış su ile 20 ul son hacmi oluşturuyor. </li><li> 1.5 saat 37 o C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> % 1.0 agaroz jeli üzerinde transkripsiyon reaksiyonunun IKAZ1 ul reaksiyon çalıştığı kontrol etmek için. Jel doğrusal şablonu ve prob parlak bir bant göstermesi gerekir. </li><li> melezleme tamponu ile 100 ul birimi oluşturacak ve -80 ° C&#39;de 10 ul alikotları saklayın. </li></ol> 2. perfüzyon, Fiksasyon ve Doku Koleksiyonu <ol><li> DİKKAT: (PFA) paraformaldehid taşırken hem katı hem deSulu, PPE giymek ve bir güvenlik kabini kullanın. ısı (55 ° C) PFA 1x olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi (ağ / hac)% 4 çözülmesiyle formaldehid çözeltisi hazırlayın. filtre kağıdı ile formaldehit çözüm Filtre. </li><li> damıtılmış su içinde sükroz (ağ / hac)% 20 eritilerek sukroz çözeltisi hazırlayın ve% 0.1 (h / h) DEPC çözeltisi ilave edilir. gevşek kapaklı ve otoklav ile oda sıcaklığında O / N bırakın. </li><li> Son aşamada pentobarbitonun intra-peritoneal enjeksiyonu (50 mg / kg) ile fare uyuşturan. ayak tutam anestezi derinliği değerlendirmek ve geri çekme refleksi yokluğu derin anestezi gösterir. </li><li> Fare derin anestezi altına alındıktan sonra, göğüs kafesine altında bir kesi yapmak ve her iki tarafta göğüs kafesinin kesti, kalp maruz kaldırın. </li><li> kalbin sol ventrikül içine 25 G iğne takın. kalbin sağ atrium küçük bir kesi yapmak. </li><li> 20 mi, PBS ile hayvan ve daha sonra 40 mi formaldehid çözeltisi serpmek. P30 ve üzerifareler, 12 ml / dk&#39;lık bir perfüzyon oranı kullanıldığında daha genç hayvanlar daha düşük bir oranı kullanım için (7-10 ml / dakika). </li><li> beyin teşrih. <ol><li> Kulağımıza gelen bir kesim posterior yaparak cerrahi makas ile fare kafasını Sever. deride bir kaudal orta hat kesi yapmak ve kafatası cilt kaldırmak için rostrally çalışır. </li><li> kaudal kısmından başlayarak, orta hat boyunca kafatasının üst kısmından ve İris makasla gözler arasındaki kesti. Bir kemik plaka bir tarafını her zaman devrilir ve cımbız ile kapalı yakalamaya tarafından parietal ve frontal kemik plakaları çıkarın. </li><li> Yavaşça cımbız ile ön kısmından yukarı doğru beyin tilt ve optik sinirleri ve diğer kranial sinirler kesilir. Yavaşça kafatası dışına beyin kaldırın. </li></ol></li><li> Bir fare koronal beyin matriks içine beyin yerleştirin. Bir tüy jilet ile 3 yaklaşık 4 mm parçalar halinde beyin dilimleyin. </li><li> % 4 PFA çözeltisi içine dilim aktarın ve 4 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> aktarım beyindilim-DEPC işlenmiş% 20 sukroz çözeltisi ve 4 ° C &#39;de, O / N kuluçkalanması </li><li> kuru cryomould içine her beyin dilim koyun, optimum kesme sıcaklığı (OCT) orta ile çevreleyen ve kuru buz üzerinde dondurma. -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 3. Cryosectioning <ol><li> Bir kriyostat içinde donmuş doku 15 mikron bölümleri kesmek ve mikroskop lamı üzerine bölümleri toplamak. Eğer gerekirse, DEPC ile muamele edilmiş, PBS ile bölümleri ıslak ve ince bir fırça ile düzleştirin. </li><li> Doku slayt uygun olduğundan emin olmak için yaklaşık 1 saat boyunca kurumaya slaytlar bırakın. </li></ol> 4. Melezleme <ol><li> 65 ° C yıkama tamponu hazırlayın: 150 mM NaCI, 15 mM Na-3 Cı 3H 5 O (COO) 3 (= 1x tuzlu su, sodyum sitrat), 50% (h / h) formamid ile% 0.1 (h / h) Tween 20. </li><li> 100 mM maleik asit, 150 mM NaCI,% 0.1 (h / h) Tween-20, pH 7,5: MABT tamponu hazırlayın. </li><li> DIG etiketli ve FITC-işaretlenmiş (iki prob seyreltind) hibridizasyon tampon maddesi içinde 1 / 1.000 65 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış ve iyice karıştırın. </li><li> Her bir slayt, coverslipwith fırında pişmiş (200 ° C) lamelleri üzerine hibritleme karışımının yaklaşık 300 ul uygulayın ve nemli bir oda içinde 65 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin. </li><li> önceden ısıtılmış yıkama tampon içeren bir Coplin kavanoza slaytlar aktarın. Yıkama tamponu ile 65 ° C &#39;de iki kez 30 dakika için slaytlar yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında, 10 dakika süreyle MABT ile üç kez slaytlar yıkayın. </li></ol> FITC Probe 5. Görselleştirme <ol><li> ISH engelleme tamponu hazırlayın: MABT% 2 bloke reaktif ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş koyun serumu. </li><li> İsteğe bağlı: Gerekli antikor çözümleri hacmini azaltmak için slayt doku bölümleri etrafında daireler çizmek için bir hidrofobik kalem kullanın. </li><li> ISH nemlendirilmiş bir odada Blokaj tamponu ile oda sıcaklığında 1 saat için slaytlar inkübe edin. </li><li> bir yaban turbu peroksidaz ile 4 ° C&#39;de (POD) de slaytlar O / N inkübe - konjugatD, anti-FITC antikoru 1/500 (h / h) ISH engelleme tamponu seyreltilmiştir. </li><li> % 0.1 (h / h) Tween-20 (PBST) ile PBS içeren bir Coplin kavanoza slaytlar yerleştirin. her PBST içinde 10 dakika süre ile 3 kere yıkayın ve taze PBST ile değiştirin. </li><li> Kullanımdan hemen önce, Amplifikasyon seyreltici olarak 100 kez seyreltilmesi ile floresan tiramid hazırlar. Bu örnek için, FITC-tiramid kullanımı. </li><li> slaytlar bu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. </li><li> Bir Coplin kavanoza slaytlar yerleştirin ve 10 dakika süre ile PBST içinde 3 kez yıkayın. </li></ol> DIG Probe 6. Görselleştirme <ol><li> 0.1 M Tris-HCl, pH 8.2 hazırlanır. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat için ISH bloke edici tampon ile slaytlar inkübe edin. </li><li> bir alkalin fosfataz (AP) ile 4 ° C&#39;de slaytlar O / N inkübe seyreltildi 1 / 1.500 (h / h) ISH engelleme tamponu, anti-DIG antikoru ile konjüge edilmiş. </li><li> 10 dakika için üç kez MABT ile yıkayınız. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0.1 M Tris-HCI pH 8.2 ile iki kez yıkanır. </li><li>Kullanımdan hemen önce, 0.1 M Tris, pH 8.2 tabletler çözülmesiyle Hızlı Kırmızı solüsyon hazırlanır. 0.22 um&#39;lik bir filtreden filtre solüsyonu. </li><li> nemli bir oda içinde Hızlı Kırmızı çözelti ile 37 ° C&#39;de slaytlar inkübe edin. uygun gelişimi için geçen sürenin de, çökeltinin oluşumuna izlemek için flüoresan mikroskop ile düzenli slaytlar edin. 3 saat - Bu örnekte, 2, sonra reaksiyonu durdurun. </li><li> 10 dakika için üç kez PBST ile yıkanır. </li></ol> 7. İmmünhistokimya <ol><li> IHC bloke tamponu hazırlayın:% 10 PBST (birincil antikor konak için farklı türlerin) (h / h) serum. </li><li> IHC nemlendirilmiş bir odada, oda sıcaklığında 1 saat süre ile blokaj tamponu ile slaytlar inkübe edin. </li><li> Primer antikor hazırlanması (birincil antikor konakçıya farklı türlerin)% 5 serum ile PBST içinde, uygun bir seyreltme oranında primer antikor seyreltin. Bu örnekte, 1/400 (h / h) seyreltmede bir tavşan anti-olig2 antikor kullanımı. </li><li>4 ° de CO / N primer antikor çözeltisi içinde inkübe edin. </li><li> 10 dakika için üç kez PBST ile yıkanır. </li><li> İkincil antikor hazırlanması: Bu örnekte ve% 0.1 (h / h) Hoechst 33258. (farklı bir birincil antikor konak türlerin)% 5 ile PBST içinde, uygun bir seyreltme oranında (hac / hac), serum, bir florofor-konjuge sekonder antikor seyreltik 1 / 1.000 (h / h) seyreltmede ikincil antikor Alexa647 bir eşek anti-tavşan kullanın. </li><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin. </li><li> 10 dakika için üç kez PBST ile yıkanır. </li></ol> 8. Montaj <ol><li> Kısmen oda sıcaklığında slaytlar kuru ve, floresan montaj ortamına sahip monte edilir. Hızlı Red için 570 nm, FITC için 488 nm, olig2 immüno için 647 nm ve Hoechst için 350 nm: 10X altında konfokal mikroskop sonra, 20X ve aşağıdaki uyarma dalga boyları ile 4 farklı kanalları kullanarak 63X hedefleri görüntü kuru ve slaytlar bırakın . </li></ol>

<ol><li>Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+as+intrinsic+components+of+non-cell-autonomous+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).</li>
<li>Baslow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylaspartate+in+the+vertebrate+brain%3A+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.</a> Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).</li>
<li>Hoshino, H., Kubota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canavan+disease%3A+clinical+features+and+recent+advances+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Int%22%5BJournal%5D)">Canavan disease: clinical features and recent advances in research.</a> Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).</li>
<li>Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+human+aspartoacylase+cDNA+and+a+common+missense+mutation+in+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease.</a> Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).</li>
<li>Divry, P., Mathieu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+deficiency+and+N-acetylaspartic+aciduria+in+patients+with+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease.</a> Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).</li>
<li>Bartalini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+diagnosis+of+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Childs+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Biochemical diagnosis of Canavan disease.</a> Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).</li>
<li>Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetylaspartate+in+the+CNS%3A+from+neurodiagnostics+to+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology.</a> Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).</li>
<li>D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occurrence+of+N-acetylaspartate+amidohydrolase+%28aminoacylase+II%29+in+the+developing+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat.</a> J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).</li>
<li>Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+regional+distribution+of+aspartoacylase+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue.</a> J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).</li>
<li>Sommer, A., Sass, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+aspartoacylase+%28ASPA%29+and+Canavan%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan.</a> Gene. 505 (2), 206-210 (2012).</li>
<li>Klugmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+distribution+of+aspartoacylase+in+the+postnatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain.</a> Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).</li>
<li>Madhavarao, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+aspartoacylase+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system.</a> J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).</li>
<li>Hershfield, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+is+a+regulated+nuclear-cytoplasmic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme.</a> Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).</li>
<li>Moffett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+aspartoacylase+expression+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system.</a> Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).</li>
<li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+is+restricted+primarily+to+myelin+synthesizing+cells+in+the+CNS%3A+therapeutic+implications+for+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease.</a> Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).</li>
<li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+of+aspartoacylase+in+oligodendrocytes+parallels+CNS+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination.</a> Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu protokol immün tarafından takip In situ hibridizasyon çift RNA için bir adım-adım prosedürü sağlar. Biz Aspa birkaç beyin bölgelerindeki olgun oligodendrosit ifade edilmektedir onaylamak için bu protokolü kullanılır. Bu çok aşamalı prosedür hassasiyetini etkileyebilir ve kaçınılmalıdır pek çok potansiyel tuzaklar vardır. İlk olarak, transkripsiyon reaksiyonu için tüm çözümleri ve depolama tamponlar RNaz ücretsiz olması gerekir. İkinci olarak, cDNA şablonları seçimi öneml...

Merkezi sinir sisteminde (CNS) içinde en bol hücrelerdir glial hücreler, oligodendrositlerin (CNS myelinating hücreleri), oligodendrositler öncüleri (aynı zamanda &quot;NG2 hücreler&quot; olarak da bilinir OP), astrositler ve mikroglia içermektedir. Nörolojik hastalıklarda 1 glial hücreler ve bunların potansiyel rolleri fonksiyonları artan bir ilgi vardır. Örneğin, Canavan hastalığı (CD) genellikle yaş 2,3 10 yıl önce ölüme yol açan, erken süngersi leukodystrophy ve nöronların ilerleyici kaybı ile bebeklik döneminde başlayan bir kalıtsal nörodejeneratif bir hastalıktır. Yol Aspartoacyclase (ASPA&#39;nın) genindeki mutasyonlar ölçüde CD ASPA&#39;nın aktivitesi 4 düşürülen tespit edilmiştir. ASPA N-asetilaspartat (NAA) deasetilasyonu katalize bir enzim, yüksek beyin içinde konsantre molekülü üreten asetat, aspartat 5-7. Birçok CD hasta nedeniyle ASPA ac eksikliği NAA daha yüksek olduğunu göstermektedirtivity. Bazı çalışmalar NAA türetilmiş asetat gelişimi sırasında yağ asitleri / beyinde lipidlerin önemli bir kaynağı olabilir ve 3,5,6 aşağı kırılması NAA yetmezliği nedeniyle gelişimi sırasında miyelin sentezi azaldığı CD neden olabilir spekülasyon. ASPA ağırlıklı beyin böbrek, karaciğer ve beyaz cevherde bulunan ve CD&#39;deki ASPA önemli rolü verilir, beyindeki bu enzimin hücre ifadesi birkaç laboratuvarlar tarafından incelenmiştir. Beyinde ASPA enzimatik aktivite bakarak, daha önceki çalışmalarda beyin gelişimi sırasında ASPA aktivite artışı miyelinasyon 8-10 zaman sürecini paralellik bulundu. Hücresel düzeyde, enzimatik aktivitesi için hem de in situ hibridizasyon (ISH) ve immünohistokimya (IHC) deneyleri ASPA&#39;nın esas olarak beyinde konumlandığı, fakat nöronlar veya astrosit 11-16 oligodentrositler ifade olduğunu göstermektedir analizleri. Birkaç çalışmalarda ASPA da olabilir oCNS 12,14 olarak mikroglia olarak ifade edilebilir. Operasyonel olarak ASPA ifadesine Şimdiye kadar veriler sınırlıdır. Nöronlar, astrositler, OP&#39;lerle, yeni kurulan oligodendrositler, myelinating oligodendrositler, mikroglia, endotelyal hücreler ve perisitlere dahil fare serebral korteks farklı hücre tiplerinin transcriptomes RNA sıralanması 17 ile analiz edildi Yeni bir araştırmaya göre, ASPA sadece oligodendrositlere ifade edilir , oligodendrositlerin myelinating özellikle (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Beyinde ASPA ifade deseni bu çalışmalara rağmen, belirsizliklerin bir dizi kalır. Farklı teknikler gen ekspresyonu incelemek için kullanılabilir. IHC doku kesitlerinde bir gen ekspresyonunun işlevsel bir ürün (örneğin, protein) tespit etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. uygulama ve özgünlüğü tabi t gibi onun büyük yarar rağmen, bu tekniğin sınırlamaları vardırihtiyaç duyulan antikorun mevcudiyeti ve özgünlüğü o. Buna karşılık, ISH mRNA düzeyinde bir genin ekspresyonunu ortaya çıkarmak mümkün olma avantajına sahiptir. Bununla birlikte, özel hücre tipleri için bir gen ekspresyonunu lokalize etmek için aynı anda birden fazla prob kullanımı teknik olarak zor olabilir. Bu yazıda, bir proteinin floresan immüno ile in situ hibridizasyon çift floresan RNA birleştiren bir protokol açıklar. Biz fare beyninde Aspa salgılanma modelini incelemek için teknikler bu dizi kullandık. Bu yöntem, konfokal mikroskopi kullanılarak gen ekspresyonunun hassas çalışma sağlar.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>ISH bloke edici tampon için</td><td>deiyonize formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik susuz</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik dihidrat</td><td>Sigma</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Maya tRNA</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt'ın çözümü</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran sülfat</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Aspa cDNA klonu</td><td>Kaynak Biyobilim</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Dengelenmiş fenol</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>İzoamil alkol</td><td>Aldrich</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Uluslararası</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimeraz</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>Transkripsiyon tamponu</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG NTP karışımı</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>005479470</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>Dietil pirokarbonat</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon makası</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge iğne</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Cole-Parmer Instrument Co., Ltd,</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>İris makası</td><td>Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>No.2 cımbız</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Koronal Beyin Matrisi</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı</td><td>Personna Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT orta</td><td>Doku tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat / mikrotom</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus slaytlar</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>65 ° C; C yıkama tamponu</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>Bloke edici reaktif</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile inaktive edilmiş koyun serumu</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik kalem</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&alfa;-FITC POD-konjuge antikor</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&trade; Artı Floresein Sistemi</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1: 1.500</td></tr> <tr><td>& -DIG AP konjuge</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı kırmızı tabletler</td><td>Roche</td><td>11496549001.22</td><td></td></tr> <tr><td>& M filtresi</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-Olig2 Tavşan karınca</td><td>gövdesi Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 647-konjuge &alfa;-tavşan antikoru</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>A-31573</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Çift floresan birleştiren<em&gt; in situ</em&gt; fare beyin bölüm Üç genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile hibridizasyon

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Beyin hücreleri, örneğin nöronlar, astrositler, oligodendrositler, oligodendrosit öncüleri ve mikroglia farklı gen ifadesinin saptanması, immün spesifik primer ya da sekonder antikorların yokluğuyla engellenebilir. Burada üçüncü geni tarafından kodlanan proteine ​​karşı yöneltilmiş yüksek özgüllük bir antikor ile immün ardından, iki gen spesifik problar ile in situ hibridizasyon, çift floresan kullanılarak aynı beyin kısmında üç farklı gen ekspresyonunu tespit etmek için bir protokol açıklar. Aspartoacyclase (ASPA) geni, mutasyonlar nadir insan beyaz madde hastalığı neden olabilir - Canavan hastalığı - oligodendrositler ve mikroglia ancak astrositler ve nöron ifade edilmesi düşünülmektedir. Bununla birlikte, beyinde ASPA kesin ifade deseni henüz belirlenmemiştir zorundadır. Bu protokol ASPA olgun oligodendrosit a bir alt kümesi olarak ifade edildiğini belirlemek için bize izin verdiND genellikle gen ekspresyon paterni çalışmalar çeşitli uygulanabilir.

Bu makalede, bir fare beyin bölümlerinde immüno ardından çift flüoresan ISH için bir yöntem tarif eder. Bu protokolün kısa bir açıklama ilk adım Aspa ve MBP (miyelin bazik proteini) özel problar sentezlemek oldu Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Probes sentezlenmiş olduğunu kontrol etmek için, her bir reaksiyonun küçük bir kısım, bir agaroz jel üzerinde yürütülmüştür. Hafif lineer şablonu ve RNA probu büyük miktarda (Şekil 2) görülebilir. ...

Gen ekspresyonunu spesifik hücre tiplerine lokalize etmek, spesifik antikorların eksikliği nedeniyle zor olabilir. Burada, çift floresan RNA'nın yerinde hibridizasyonunun immün boyama ile birleştirilmesiyle gen ekspresyonunun eşzamanlı üçlü tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Bu deneyin genel amacı, çift floresan in situ hibridizasyonu ve ardından immün boyama kullanarak, beyin kesitlerinde üç farklı genin ekspresyonunu eş zamanlı olarak tespit etmektir. Bu yöntem, nörobilim alanındaki "ilgilendiğim geni hangi hücre tipi eksprese ediyor?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgi duyulan genin ekspresyonunu belirli bir hücre tipinde lokalize edebilmek için bu gene yönelik iyi bir antikore ihtiyaç duymamanızdır.Bu prosedürü özetlemek gerekirse, birinci gün, tespit edilmiş doku kesitleri alınır ve gece boyunca iki farklı etiketli RNA probu ile hibridize edilir. İkinci gün, kesitler gece boyunca FITC etiketli probu hedefleyen bir antikor ile inkübe edilir. Bu antikor, üçüncü gün floresan Tyramide eklenmesini katalize eden horseradish peroxidase ile konjuge edilmiştir.Ardından, DIG işaretli probu hedeflemek için alkali fosfataz konjuge bir antikor kullanılır. Dördüncü günde, bu enzim Fast Red solüsyonu ile inkübe edildiğinde floresan presipitat oluşumunu katalize eder. Sonrasında kesitler, ilgilenilen bir proteini hedefleyen bir primer antikor ile gece boyunca inkübe edilir.Son olarak, beşinci günde, bu protein

combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Fare doku veri toplama maksimize etmek için farklı teknikler bir arada sunulmaktadır.

Lipofilik boya birleştiren In situ Hibridizasyon, İmmünohistokimya ve Histoloji

Kaynak: Jolly, S., et.al. Fare Beyin Bölümlerinde Üç Genin Ekspresyonunun Tespiti için Çift Floresan In Situ Hibridizasyonunun İmmünoetiketleme ile Birleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2016). Bu video, fare beyni bölümlerindeki iki RNA hedefinin ekspresyonunu görselleştirmek için çift floresan in situ hibridizasyonun kullanımını göstermektedir. Protokol, floresein, izotiyosiyanat ve digoksijenenin ile etiketlenmiş problar kullanılarak RNA'nın sıralı tespitini ve ardından duyarlılığı artırmak için...

 Fare Beyin Bölümlerinde Gen Ekspresyonunu Tespit Etmek için Çift Floresan In Situ Hibridizasyon Yapılması

Kaynak: Baleriola, J., et. al., Yüksek Çözünürlüklü In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Beyin Bölümlerinde Aksonal Lokalize mRNA'ların Tespiti.  J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, floresan in situ hibridizasyon ve antikor boyama kullanılarak sabit fare hipokampal dilimlerinde kolinerjik aksonlar içinde mRNA'nın tespitini göstermektedir. Floresan mikroskobu, kolinerjik nöronlarda prob etiketli mRNA'ların ve kolin asetiltransferazın mekansal lokalizasyonunu ortaya çıkarır.

Floresan In Situ Hibridizasyonun Ardından Fare Beyin Dilimlerinde Nöronların İmmün Boyanması

Bu giriş seviyesi protokolü, örnek olarak mikroglia ve nöronal elementler için belirteçler kullanarak, kemirgen beyinlerinin immünohistokimyasal boyamasını tamamlamak için gereken reaktifleri, ekipmanı ve teknikleri açıklar.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Bu video makale, aynı doku kesitinde yetişkin hipokampal nörogenezin tüm aşamalarını tespit etmek ve ölçmek için kapsamlı bir protokolü göstermektedir. Farklı konakçı türlerden uygun antikorlar mevcut olmadığında ortaya çıkan dolaylı çoklu immünofloresan sınırlamalarının üstesinden gelmek için bir yöntem geliştirdik.

Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Bu protokol, çok etiketli FISH ve floresan IHC sinyali elde etmek amacıyla hem taze dondurulmuş hem de sabit fare beyin bölümlerinde floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve floresan immünohistokimyasını (IHC) birleştirmek için bir yöntemi açıklar. IHC, sitoplazmik ve membrana bağlı proteinleri hedefledi.

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon (EASI-FISH), kalın dokuda birden fazla genin ekspresyonunu tespit etmek için genleşme mikroskobunu floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiren sağlam bir tekniktir. Bu protokol, yöntemdeki son gelişmeleri ve bozulmamış Drosophila merkezi sinir sistemini etiketlemek için adaptasyonunu özetlemektedir.

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Sağlam Drosophila Beyindeki Gen Ekspresyonunun Multipleks Tespiti

Öğrenin, fare beyin kesitlerinde üç genin eşzamanlı ifadesini çift floresan in situ hibridizasyon ve immünoişaretleme ile tespit etme yöntemini. Bu teknik, antikor bulunmadığında da gen ifadesini hücre tiplerine lokalize etmenizi sağlar.

Çift Floresan birleştiren

Daha fazla video keşfet