Name: İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Öğrenin, dönen duvarlı biyoreaktörler kullanılarak mikrogravite ortamında insan bağırsak mukozasının çok hücreli 3-D organotipik modelinin nasıl geliştirildiğini. Bu yöntem, patojen etkileşimleri ve inflamatuar süreçler için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, kısmen, MBS'ye NIAID, NIH, DHHS federal araştırma hibeleri R01 AI036525 ve U19 AI082655 (CCHI) ve AF'ye NIH hibe DK048373 tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Etik deyimi: Tüm kan örnekleri protokol numarası HP-00040025-1 katılan gönüllülerden toplanmıştır. Maryland Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi bu protokolü onayladı ve bu yazıda yer alan çalışmalar için sağlıklı gönüllülerden kan örneklerinin koleksiyonu yetkili. Bu çalışmanın amacı, gönüllülere açıklanmış ve tüm gönüllüler bilgilendirilmiş verdi, kan beraberlik önce rızasını imzaladı. Not: Orta takviyesi hazırlığı için Tablo 1&#39;e bakınız. 3-D kültür ortamının hazırlanması için Tablo 2&#39;ye bakınız. Kültür Gemiler hazırlanması 1. <ol><li> 50 ml&#39;lik kabın dolum bağlantı kapağını çıkarın ve steril kültür ortamına 50 ml (ör. RPMI) ile doldurun. laminar kaput steril koşullar altında tüm prosedürleri uygulayın. </li><li> Kapağı değiştirin ve% 70 etanol ile herhangi bir yüzeyde herhangi dökülen orta silin. </li><li> gemi inkubasyon izin verOda sıcaklığında O / N, en az 15 dakika boyunca yedi. </li><li> Kültür ortamı atılır ve 3-B kültür ortamında 30 ml ilave dolum kapısının kullanın. </li><li> % 70 etanol ile herhangi bir yüzeyde herhangi dökülen orta silin. </li></ol> Hücreler 2. Hazırlık <ol><li> Insan epitel hücre çizgisi (HCT-8) 24,40. <ol><li> RPMI kültür hücreler 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 50 mg / ml gentamisin, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM HEPES (tampon ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu FBS ile takviye edilmiş ) (ek 1). % 70 ortak akışkanlığa da 1 oranında bölünmüş hücreleri: 5&#39;tir. </li></ol></li><li> İnsan kolonik fibroblastlar (CCD-18Co hücreleri) 24,41. <ol><li> Ek 1 ile zenginleştirilmiş Bazal Eagle ortamı içinde kültür hücreleri Akışların birleştiği yerde hücreler, 1 oranında bölünmüş hücre. 3. </li></ol></li><li> İnsan Umbilikal Ven Endotelyal (HUVEC) hücreleri <sup&gt; 24,42. <ol><li> Endotel Bazal Ortamda (EBM) Kültür hücrelerinin ortamı 100 ug / ml heparin, 3 ug / ml endotel hücre büyüme takviyesi (ECGS) ile zenginleştirilmiş ve 1 ek% 70 ortak akışkanlığa, 1 oranında bölünmüş hücreler de. 2. </li></ol></li><li> Lenfositler / Monositler <ol><li> Standart teknikler 43 kullanılarak yoğunluk gradyan santrifüj ile kandan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC) izole edilir. <ol><li> Kısaca, 10 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak, dikkatli bir şekilde seyreltilmiş kan 30 ml ilave (1: 1, kan: Fosfat tamponlu tuz (PBS)) yoğunluk santrifüj, 10 mL ortam ihtiva eden bir 50 mL konik tüp içine. santrifüj aşamasından sonra, lenfositler ve monositler yoğunluk santrifüj medya ve plazma katmanları arasında &quot;beyaz&quot; katmanında ikamet edecek. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak beyaz tabakayı toplayın. yoğunluk santrifüj medya koleksiyonu sınırlayarak granülosit kirlenmesini önlemek. 43 yıkandıktan sonra, Uolarak se PBMC ya da sıvı N 2 kriyoprezerve. Not: PBMC, büyük ölçüde, dendritik hücreler ve diğer hücre tipleri arasında, küçük bir oranda, lenfositler ve monositler oluşur vurgulamak önemlidir. </li></ol></li></ol></li><li> % 5 CO2 içeren bir atmosferde 37 ° C&#39;de, standart kültür koşulları altında tüm hücreleri büyütün. </li></ol> Kolajen gömülü hücrelerin 3. hazırlanması <ol><li> ekler sayısını belirlemek deneysel koşullar numaraları göre gerektiğinde set-up olmak. 6-çukurlu bir plaka gözlerine insertlerin uygun sayıda yerleştirin. </li><li> HUVEC ve fibroblast bir süspansiyon hazırlamak: <ol><li> PBS içinde iki kez şişeler yıkayın ve% 0.05 tripsin-tetrasodyum etilendiamintetraasetat (Tripsin-EDTA) ile tripsin,% 0.25 (1x) kullanarak hücreleri ayırmak. Hücre kültürü yüzey alanının tamamını kapsayacak kadar tripsin solüsyonu ekleyin. Sıyrılma, genellikle 15 dakika ile 5 dakika içinde meydana gelir </li><li> ToplamakDulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM)% 30 FBS ortamı 30 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüp içinde müstakil hücreleri. </li><li> 10 dakika boyunca 500 xg&#39;de tüp santrifüjleyin. </li><li> DMEM% 30 FBS ortamı 30 ml tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Tripan mavi boya 20 ul ile yeniden süspanse hücre 20 ul seyreltilmesiyle yaşayan hücrelerin sayısı. Hücre karışımı ile hemasitometre yükleyin. Canlı PBMC&#39;ler açık beyaz olacaktır; cansız PBMC boya kazanmak ve mavi olacak. <ol><li> 8 x 10 7 hücre ml - - ​​5 konsantrasyonda DMEM% 30 FBS ortamı içinde her hücre tipi yeniden süspanse 1. </li></ol></li></ol></li><li> hücre içeren kollajen jel hazırlanması Not: Her bir kap hücre içeren kollajen jel ~ 5 ml hazırlanmasını gerektirir. <ol><li> 50 ml&#39;lik konik bir tüp içinde 50 ug / ml gentamisin, 2 mM L-glutamin ve% 10 ısı ile inactivat ile takviye edilmiş 1 X DMEM ortamı ekleyerek kollajen karışımının hazırlanmasıEd FBS artı 3 mg / ml sığır kollagen-l, 10 ug / ml laminin, 40 ug / ml kolajen IV, 10 ug / ml fibronektin, 2 ug / ml heparin sülfat proteoglikan, 15 mM NaOH (fizyolojik pH değerinin elde edilmesi). </li><li> Tüp kapatılır ve karışım tamamen homojenize kadar birkaç kez ters yüz edilerek karıştırılır. kabarcık oluşumunu önlemek. ÖNEMLİ: jelleşme önlemek için buz karışımı tutun. <ol><li> Kritik adım: Karışım bir asidik görünüm (sarı renkli) oluşursa, karışımın nötralize edilmesi için, steril 1 N NaOH ve bir kaç damla ekleyin. </li></ol></li><li> Sırası ile zenginleştirilmiş-kollajen karışımı (yukarıda tarif edilmiştir) ile, 2.0 x 10 6 hücre / ml - 1.2 ve 1,5-1,0 yoğunluğunda konsantre HUVEC ve fibroblastlar ekleyin. tüpleri kapatın ve karışım tamamen homojenize kadar birkaç kez ters yüz edilerek karıştırılır. kabarcık oluşumunu önlemek. ÖNEMLİ: jelleşme önlemek için buz karışımı tutun. </li><li> hücre içeren kollajen 5 ml - 4 eklemeher ekleme jel, önce bir 6 kuyu-plakasının içine yerleştirilir ve 1 saat boyunca çok az veya hiç hareket kaputu gelify bırakıldı. </li><li> 2 saat daha - 1 saat sonra, 1 için bir 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör 6 oyuklu plaka aktarın. </li><li> başlık 6 oyuklu plaka dönün ve steril bir forseps yardımıyla ve aseptik kesme neşter bir membran hücre ihtiva eden jel ayırma elemanından. küçük kareler halinde müstakil jel (~ 5 x 5 mm) kesin. </li><li> dolum bağlantı noktasını kullanarak 50 ml HARV olarak küçük hücreli içeren kareler ekleyin. </li></ol></li><li> HCT-8 epitel hücrelerinin bir süspansiyonu hazırlanması: <ol><li> PBS içinde iki kez şişeler yıkayın ve Tripsin-EDTA tedavisi ile tripsin,% 0.25 (1x) kullanarak hücreleri ayırmak. Hücre kültürü yüzey alanının tamamını kapsayacak kadar tripsin solüsyonu ekleyin. Sıyrılma, genellikle 10 ila 15 dakika içinde meydana gelir. </li><li> DMEM% 30 FBS ortamı 30 ml müstakil hücreleri toplamak. </li><li> Santrifüj10 dakika boyunca 500 xg&#39;de tüp ihtiva Uge DMEM% 30 FBS ortamı. </li><li> DMEM% 30 FBS ortamı 30 ml tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 3.2.5 tarif edildiği gibi canlı hücre sayısı. </li><li> 10 7 hücre ml&#39;lik bir konsantrasyonda DMEM% 30 FBS ortamı içinde HCT-8 epitel hücreleri tekrar - 1. </li><li> dolum bağlantı noktasını kullanarak 50 ml HARV halinde konsantre HCT-8 epitel hücrelerinin 1 ml ilave edilir. </li></ol></li><li> gemi neredeyse dolana kadar doldurma bağlantı noktasını kullanarak, (~ 20 ml) ilave 3-D kültür ortamı ekleyin. </li><li> Kapağı değiştirin ve% 70 etanol ile dolgu liman dudağını silin. </li><li> RWV her şırınga limanında bir şırınga yerleştirin: yer 3 içeren 5 ml&#39;lik şırınga - 4 tek limanda 3-D kültür ortamı ml ve diğer limanda 5 ml boş şırınga. </li><li> orta yaklaşık aynı hacimde başka şırınga bağlantı noktası üzerinden enjekte edilir iken boş şırınga içine çekerek herhangi bir görünür kabarcıklarını çıkarın. </li><li> ves yerleştirindamarları biyoreaktör, gücü açın ve dakikada yaklaşık 13 ila 14 rotasyonlar için hızını ayarlayabilirsiniz. Not: Kritik adım: Rotasyon hızı böylece damar duvarları ile temas kaçınarak, damar içinde yörüngedeki hücreleri korumak için bir deney sırasında birkaç kez ayarlanması gerekebilir. </li><li> RWV biyoreaktör tarafından sağlanan 37 ° C, mikrogravite altında,% 5 CO2, kültür hücreleri. </li><li> Taze 3-D kültür ortamı ile yaklaşık 30 ml değiştirerek 4 gün - her 3 değiştirin kültür ortamı. </li><li> 4 gün sonra (± 1 gün) sonra, biyoreaktörden damarları çıkarın ve kaplar (x 10 7 / kabı 2) ila lenfositler / monositlerin ekleyin. </li><li> Ek bir 5 gün (± 1 gün) boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 geri biyoreaktör kapları. </li><li> Ek 5 gün (kültürün gün 9) sonra, damarların (2 x 10 7 / damar) ile lenfositler / monositler eklemek ve 12 adede kadar ek gün için kültürleri devam ediyor. </li&gt; <li> Taze 3-D kültür ortamı ile yaklaşık 30 ml değiştirerek 4 gün - her 3 değiştirin kültür ortamı. </li></ol> Histoloji 4. Hasat 3-D Kültürler <ol><li> % 10 formalin 10 ml tampon içeren altı oyuklu plaka Bir transfer pipeti hasat yardımıyla artık olarak adlandırılan her küçük jel fragmanı &quot;yapı&quot; ile. Oda sıcaklığında 3 saat bekleme veya 12 - 4 ° C&#39;de 16 saat. </li><li> etiketleme ve her kaset içine biyopsi köpük pedler iki adet ekleyerek doku işleme ve gömme kasetleri hazırlayın. </li><li> % 10 formalin tamponda kasetleri daldırın. </li><li> Forseps yardımıyla iki köpük ped arasındaki sabit yapıları yerleştirin. </li><li> % 10 formalin tamponda kasetleri daldırın. </li><li> , Gömme kesit ve 44 boyanması için standart prosedürler ile devam edin. </li></ol>

Yazarlar, ABD Patent ve Ticari Marka Ofisine bir ABD Geçici Olmayan Patent Başvurusu yapıldığını beyan ederler (Sayı: 13/360,539).

Bu makalede, primer insan lenfositleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri, hem de intestinal epitelyal hücre hatları 24 de dahil olmak üzere katları hücre tiplerinin oluşan insan bağırsak mukozasının bulasıcı modelinin oluşturulmasını tarif eder. Bu 3 boyutlu modeli, hücreler mikrogravite koşulları 24 altında kollajen zengin hücre dışı matris içinde kültüre edilir. Daha önce açıklandığı gibi, bu modelin en önemli özellikleri şunlardır: (i) epitel doku ...

Bilim adamları, farklı iskele türlerini (örneğin., Laminin, kollajen tip I kollajen IV ve fibronektin) ve geliştirmek için büyüme faktörlerinin kokteyller araştırmak başladı 3 boyutlu bir model inşa ilk atılım 1980&#39;lerin başlarında bildirildi hücre-hücre ve &quot;statik&quot; 3-D modelleri 1-7 ECM etkileşimlerinde. O zamandan bu yana, bu modellerin temel sorun orta ve doku yapıları 8 içinde besin transferi ve oksijen sınırlamalar olmuştur. Kan damarlarının ağları çevreleyen sürekli bir besin akışı ve oksijen alır, in vivo ortamda hücrelerin aksine, bu modellerin statik yapısı hücrelerine sınırlı bir şekilde dağılımını engellemektedir. Örneğin, boyutu bir kaç milimetreyi aşan, in vitro statik modellerde üretilen hücre agrega değişmez hipoksik, nekrotik çekirdeği 9 gelişecektir. RWV biyoreaktörler Bu sorunu aşmak olabilirbesin ve oksijen 10-12 verimli yayılmasına imkan akışkanlar dinamiği sağlayarak. Ancak, bugüne kadar, RWV biyoreaktörler kullanarak çalışma bir veya iki hücre tipinin 13-17 dahil sınırlı kalmıştır. Ayrıca yerine doğal dokuların benzer bir mekansal yönlenmelerinin, bu hücreler, hücre agregatları oluşturdu. Bu sınırlamalar başlıca nedeni entegre bir şekilde hücreleri dahil etmek mümkün bir iskele eksikliği olmuştur. Bugüne kadar RWV biyo-reaktörlerde kullanılan iskeleleri esas olarak sentetik mikro-, borulu silindirler veya küçük yaprak 13-15,19-23 arasında birkaç istisna dışında 16-18 ile, oluşur. Bunlar, bir bileşim ve esneklik manipüle edilemez ve hangi hücrelerin yüzeyine bağlı oldukları sert malzemelerdir. Bu nedenle, bu modellerin entegre bir şekilde değerlendirmek için bir sistem sağlamak olası değildir, çeşitli hücre gibi stromal hücreleri gibi bileşenler (örneğin., Fibroblastlar, bağışıklık ve endotelyal hücreler) bu should yakından insan dokusu taklit etmek için iskele içinde dağıtılabilir. Burada bir bağırsak epitel hücre hattı ve primer insan endoteliyal hücrelerde oluşan insan bağırsak mukoza çok hücreli 3-D organotipik modelinin geliştirilmesi tarif eder ve fibroblastlar 24. Bu hücreler mikrogravite altında RWV biyoreaktör 13,25-30 tarafından temin kültürlenmiştir. Bizim 3-D modelinde ECM çok belirgin, kültür ortamına benzer bir ozmolalite (örn., Kültür sırasında ihmal difüzyon başlıkları) ve hücrelerden ve diğer ilgili hücre dışı matris proteinleri dahil yeteneği gibi özellikleri, hem de sahip uygun sertlik biyoreaktörler 24 kullanılır. Biyolojik sistemler çok karmaşık ve son birkaç yıldır,, izolasyon onları okuyan ziyade çevreleriyle hücre etkileşimleri incelenmesi yönünde mukozal araştırma odak bir kayma olmuşturn. Özellikle, Bağırsak hücre hayatta kalma ve farklılaşmasını etkileyen hücre-hücre etkileşimleri önemi iyi 31-34 belgelenmiştir. Özellikle, epitel hücreleri ve bunların niş arasındaki iletişim epitel hücre genişlemesi ve farklılaşması 35 üzerinde derin bir etkisi vardır. Gerçekten de, yaygın olarak kabul edilen tek değil, hücre-hücre hem de hücre-ECM etkileşimleri 3-D kültür modellerinde epitelyal hücrelerin bakım ve farklılaşma için kritik öneme sahiptir. Önceki çalışmalar kollajen I 24,36,37, laminin 38 ve fibronektin 39 yerli mukozaya benzer uzaysal oryantasyon elde etmek için bağırsak epitel hücrelerini etkileyen vesile olduğu gibi bu bağırsak ECM proteinleri göstermiştir. Araştırmacılar kompleks hücresel ve yapısal mimari yeniden niyetinde olmadığını Böylece, yeni teknolojilerin gelişmesi, bizim 3-D modeli 24 gibi, bu bağırsak fenotipik çeşitlilik gereklidir taklit edebilirve bağırsak mikro-işlevi. Bu modeller, yeni oral ilaçlar ve aşı adaylarının gelişimi ve değerlendirilmesinde önemli bir araç oluşturmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Dört Döndürücü / Bağımsız Döner Duvar Kabı (RWV) biyoreaktörü&nbsp;</td><td>Synthecon</td><td>RCCs-4DQ</td><td>4 gemiye kadar. Daha fazla veya daha az gemili modeller de mevcuttur.</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık 50 ml'lik</td><td>Synthecon</td><td>D-405</td><td>Kutusu, 4 damarlı</td></tr><tr><td>HCT-8 epitel hücreleri&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-244</td><td></td></tr><tr><td>CCD-18Co Fibroblastlar&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Göbek Veni Endotel Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td>HUVEC</td></tr><tr><td>Fibroblast Büyüme Faktörü-Temel&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>bFGF</td></tr><tr><td>Kök Hücre Faktörü&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7901</td><td>SCF</td></tr><tr><td>Hepatosit Büyüme Faktörü&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1404</td><td>HGF</td></tr><tr><td>Endotelin 3</td><td>Sigma</td><td>E9137</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>Fare Engelbreth-Holm-Swarm tümöründen izole</td></tr><tr><td>edilmiştir Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V7259</td><td>VEGF</td></tr><tr><td>Lösemi İnhibitör Faktör&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-4377</td> <td>(LIF</td></tr><tr><td>Adenin</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>3,3 ', 5-triiyodo-L-tironin ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-6397</td><td>T3</td></tr><tr><td>Kolera Toksini</td><td>Sigma</td><td>C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>BD</td><td>354008</td><td>İnsan plazmasından</td></tr><tr><td>izole edilmiştir apo-Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T-1147</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sülfat ve proteoglikan</td><td>Sigma</td><td>H4777</td><td>Farenin bazal membranından izole edilmiştir&nbsp; Engelbreth-Holm-Swarm tümörü</td></tr><tr><td>Kollajen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>İnsan plasentasından izole</td></tr> edilmiştir <tr><td>Isı ile aktive edilmiş fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM, toz</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td></td></tr>% <tr><td>10 formalin&ndash; PBS&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Sığır tip I kollajen&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptominsin ve nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Jambon F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Bazal Orta Kartal</td><td>Invitrogen</td><td>21010-046</td><td>BME</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Bazal Orta</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>EBM-2</td></tr><tr><td>Endotel hücre büyüme takviyesi</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td>EKGS</td></tr></tbody></table>

İnsan bağırsak mukozasının bir multisellüler Üç boyutlu organotipik modelinin geliştirilmesi yerçekimi yetiştirilen

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Üç boyutlu (3-D) bir ortamda büyüyen hücreler çok 2-B ortamlarında hücre yetiştirme boşluklar (örn., Matara veya yemekler) köprü potansiyeline sahip çünkü. Aslında, yaygın şişelerde ya da bulaşıklar için yetiştirilen hücreler de-ayırt ve türetildikleri dokuların özel özellikleri kaybederler kabul edilmektedir. (A) statik model ve biyoreaktörler kullanılarak, (b) modeller: Şu anda, yerli ekstraselüler matriks (ECM) taklit eden hücreler iskelelerinin içine numaralı seribaşı 3-D kültür sistemleri iki tür temelde vardır. İlk atılım statik 3-D modelleri oldu. Böyle dönen duvar-gemi gibi biyoreaktörler kullanılarak 3-D modelleri (RWV) biyoreaktörle daha yeni bir gelişme vardır. RWV Biyoreaktörlerin orijinal konsept 1990&#39;ların başında NASA&#39;nın Johnson Uzay Merkezi&#39;nde geliştirilen ve hipoksik, nekrotik çekirdek geliştirme gibi statik modellerin sınırlamaları aşmak inanılmaktadır. RWV biyoreaktörler th aşmak olabilirbesin ve oksijenin etkili yayılmasına imkan akışkanlar dinamiği sağlayarak sorundur. Bu biyoreaktörler desteklemek ve onların havalandırma kaynak türüne göre farklılık kültür damarlarının iki farklı biçimleri döndürmek için hizmet veren bir döndürücü tabanının oluşur: Bir eş eksenli merkezi oksijenatör, ya da (1) Yavaş Torna Yanal Gemiler (STLVs) (2 düz, silikon kauçuk gaz transferi membranı yoluyla oksijenasyonu ile) Yüksek Boy Oranı gemiler (HARVs). kabarcık oluşumunu ve buna bağlı türbülans kaçınarak Bu gemilerin verimli gaz transferine izin verir. Bu koşullar modeller kültür kabı içinde ağırlık (yerçekimi) azaltılmış laminer akış ve minimal kesme kuvveti ile sonuçlanır. Burada RWV biyoreaktör tarafından sağlanan bir bağırsak epitel hücre hattı ve primer insan lenfositler, mikrogravite altında kültüre endotelyal hücreler ve fibroblastlar oluşan insan bağırsak mukoza çok hücreli 3-D organotipik modelinin geliştirilmesi açıklanmaktadır. &lt;/ P&gt;

<html> Daha önce, bir bağırsak epitel hücre hattı ve primer insan lenfositler, yerçekimi koşulları 24 (Şekil 1) altında kültür endotelyal hücreler ve fibroblastlar oluşan insan bağırsak mukoza çok hücreli 3-D Organotipik bir model oluşturduk. Fibroblastlar ve endoteliyal hücreler ben ek bağırsak bazal membran proteinleri 45 (yani., Laminin, kolajen IV, fibronektin ve heparin sülfat proteoglikan) zenginleştirilmiş matris, kolajen gömülü olan ...

Bir üç boyutlu (3-D) bir ortamda büyüyen hücreler 2-B ortamları (örneğin, şişeler ya da bulaşıklar için) hücre ekimi üzerinde belirgin bir iyileşme göstermektedir. Burada dönen duvar-damar (RWV) Biyoreaktörlerde tarafından sağlanan mikrogravite altında kültüre insan bağırsak mukozasının bir çok hücreli 3-D Organotipik modelinin gelişimini betimler.

İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Bu prosedürün genel amacı, döner duvarlı kap biyoreaktörleri tarafından sağlanan mikro yerçekimi altında kültüre edilmiş, insan intestinal mukozasının çok hücreli 3-boyutlu organotipik bir modelinin geliştirilmesini tanımlamaktır. Bu yöntem; patojenlerle etkileşimler, antijen taşınımı ve inflamatuar süreçler dahil olmak üzere hem sağlık hem de hastalık durumlarında keşif için bir araç olarak geniş bir potansiyele sahiptir.Bu tekniğin temel avantajları, kedinin fenotipik çeşitliliğinin taklit edilmesi ve besinlerin ve oksijenin verimli difüzyonuna olanak tanıyan D-12 kap biyoreaktörlerinin kullanılmasıdır. Kültür kabının dolum portundaki kapağı sökerek ve 50 mililitre PMI ekleyerek başlayın. Kap dolduğunda kapağı tekrar kapatın ve dökülen herhangi bir ortamı %70 etanol ile silin.Kabın oda sıcaklığında en az 15 dakika ile bir gece boyunca inkübe edilmesini sağlayın. Devam etmeye hazır olduğunuzda, dolum portunu kullanarak kültür ortamını boşaltın ve kaba 30 milliliters 3-D kültür ortamı ekleyin. Dolum portunun kapağını kapatın ve dökülen ortamı tekrar %70 etanol ile silin.İnsan göbek kordonu ven endotel hücreleri ve insan kolon fibroblastları içeren, konfluensa yakın flaskları inküba

development-multicellular-three-dimensional-organotypic-model-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Geliştirilmiş görüntüleme teknolojisi, gelişim sırasında organların üç boyutlu görüntülenmesine izin veriyor. Burada, fetal fare bağırsağında gelişmekte olan villusların canlı görüntülenmesine izin veren bütün bir organ kültürü sistemini tarif ediyoruz.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi Ex vivo Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Burada, bir protokol kültür insan enteroid veya ana bilgisayar microbiota epitel etkileşimleri hücresel ve biyokimyasal düzeyde çalışmaya sağlam bariyer fonksiyonu var colonoid monolayers mevcut.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

Burada bağırsak apikal spesifik etkileşimlerin modellenmesine izin veren iki protokol sunuyoruz. Organoid türevli bağırsak monolayerleri ve Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) kültürleri, hem aydınlık hem de bazolateral taraflardan erişilebilen iyi ayırt edilmiş epitellerin üretilmesini kolaylaştırırken, polarite ters bağırsak organoidleri apikal yanlarını ortaya çıkarır ve yüksek verim testlerine uygundur.

Bağırsak Organoid Modellerini Kullanarak Apikal Spesifik Etkileşimleri İncelemek için Kültür Yöntemleri

Biyopsi kaynaklı intestinal organoidler ve çip üzerinde organ teknolojileri, bölgeye özgü bağırsak işlevselliğini özetlemek için mikrofizyolojik bir platformda birleştirilir.

Bağırsak Bölgesine Özgü İşlevselliği Modellemek için İnsan Organoidlerini ve Çip Üzerinde Organ Teknolojisini Birleştirme

Bu protokol, bir klodin-7 nakavt modelinde kolonik kök hücrelerin aktivitesini ve işleyişini incelemek için bir murin kolonik organoid sisteminin kurulmasını açıklamaktadır.

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

Murin ince bağırsak kriptlerini ve kültür bağırsak 3D organoidlerini kriptlerden izole etmek için bir protokol tarif ediyoruz. Ek olarak, bir alt epitelyal hücresel nişin yokluğunda tek bir bağırsak kök hücresinden organoidler üretmek için bir yöntem tarif ediyoruz.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

Burada, sıçan bağırsak organoidleri üretmek ve bunları birkaç aşağı akış uygulamasında kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Sıçanlar genellikle tercih edilen bir klinik öncesi modeldir ve sağlam bağırsak organoid sistemi, in vivo çalışmalara eşlik edecek bir in vitro sistem ihtiyacını karşılar.

Sıçan Bağırsak Organoidlerinin Üretimi ve Manipülasyonu

Burada, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için temel bir üç boyutlu (3D) bağırsak hücre hattı model sistemi ve bir parafin gömme protokolü oluşturmayı açıklıyoruz. Seçilen proteinlerin boyanması, klinik öncesi ilaç tarama çalışmalarında potansiyel kullanım için tek bir deneyden birden fazla görsel parametrenin analizine izin verir.

Bağışıklık Bileşenli Temel Üç Boyutlu (3D) Bağırsak Model Sistemi

Köpek bağırsak organoidlerinin ve bir Çip Üzerinde Bağırsak mikroakışkan sisteminin entegrasyonu, insan bağırsak hastalıkları için ilgili translasyonel modeller sunar. Sunulan protokoller, bağırsağın 3D morfogenezine ve dinamik in vitro modellemesine izin vererek, köpeklerde ve insanlarda Tek Sağlık ile bağırsak hastalıkları için etkili tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olur.

İnflamatuar Bağırsak Hastalığı Hastalarından Türetilen Bağırsak Organoidleri Kullanılarak Çip Üzerinde Köpek Bağırsağında Üç Boyutlu Morfogenez

Bu çalışma, ince ve kalın bağırsaklardan türetilen 2D tek katmanlı domuz organoidleri oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Bu tek tabakaların büyümesi, sağlam epitel bütünlüğünü gösteren artan TEER değerleri ile işaretlenir. Ek olarak, bu tek tabakalar, forskolin uygulamasını takiben Ussing odası deneylerinde fizyolojik salgı tepkileri sergiler.

Doğal Bağırsağın Fizyolojik Özelliklerini Yansıtan İki Boyutlu Domuz Bağırsak Organoidleri

Öğrenin, dönen duvarlı biyoreaktörler kullanılarak mikrogravite ortamında insan bağırsak mukozasının çok hücreli 3-D organotipik modelinin nasıl geliştirildiğini. Bu yöntem, patojen etkileşimleri ve inflamatuar süreçler için değerli bir araçtır.

İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen

Daha fazla video keşfet