İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen

Bu prosedürün genel amacı, dönen duvar kabı biyoreaktörleri tarafından sağlanan mikro yerçekimi altında kültürlenen insan bağırsak mukozasının çok hücreli 3 boyutlu organotipik bir modelinin geliştirilmesini tanımlamaktır. Bu yöntem hem sağlıkta hem de hastalıkta bir keşif aracı olarak geniş bir potansiyele sahiptir. Patojenlerle etkileşimler, antijen kaçakçılığı ve enflamatuar süreçler dahil.

Bu tekniğin temel avantajları, kedinin fenotipik çeşitliliğinin taklit edilmesi ve besinlerin ve oksijenin verimli bir şekilde difüzyonuna izin veren D-12 damar biyoreaktörlerinin kullanılmasıdır. Kültür kabının doldurma portundan kapağı sökerek ve 50 mililitre PMI ekleyerek başlayın. Kap dolduğunda, kapağı değiştirin ve dökülen ortamları %70 etanol ile silin.

Geminin oda sıcaklığında en az 15 dakika ila gece boyunca inkübe etmesine izin verin. Devam etmeye hazır olduğunuzda, kültür ortamını atmak için doldurma portunu kullanın ve kaba 30 mililitre 3B kültür ortamı ekleyin. Doldurma portundaki kapağı yerine takın ve tekrar dökülen ortamları %70 etanol ile silin.

İnsan göbek damarı, endotel hücreleri ve insan kolonik fibroblastlarını içeren birleşen şişelerin yakınını inkübatörden çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, hücreleri% 0.25 tripsin EDTA ile% 0.05 tripsin çözeltisi kullanarak kaplayarak ayırın. Hücreler ayrıldıktan sonra,% 30 FBS içeren 30 mililitre DMEM ile önceden yüklenmiş 50 mililitrelik bir tüpte toplayın.

Hücreleri peletlemek için tüpü 10 dakika santrifüjleyin. Ardından,% 30 FBS içeren 30 mililitre DMEM'deki hücreleri yeniden süspanse edin. Daha sonra, yeniden süspanse edilmiş hücrelerin 20 mikrolitresini 20 mikro litre tripan mavisi boya ile seyreltin.

Hemositometreyi hücre karışımı ile yükleyin ve canlı hücrelerin konsantrasyonunu sayın. Ardından,% 30 FBS içeren DMEM'de her hücre tipini mililitre başına 50 ila 80 milyon hücrede yeniden askıya alın. İlk olarak, uygun sayıda kültür ekini altı oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin.

Daha sonra, önce 50 mililitrelik konik bir tüpe 10x DMEM, 10x Sulandırma Ortamı, 200 milimolar L-glutamin ve ısıyla inaktive edilmiş FBS ekleyerek kollajen karışımını hazırlayın. Daha sonra sığır kollajen tip bir, laminin, kollajen tip dört, fibronektin, heparin sülfat proteoglikan ekleyin ve son olarak çözeltinin pH'ını nötralize etmek için sodyum hidroksit ekleyin. Herhangi bir zamanda karışım sarımsı renkli asidik bir görünüm geliştirirse, karışımı nötralize etmek için birkaç damla steril 1 normal sodyum hidroksit ekleyin.

Tüpü kapatın ve kabarcık oluşumunu önlerken çözeltiyi birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Karıştırmadığı zaman, polimerleşmesini önlemek için çözeltiyi buz üzerinde tutun. Karıştırıldıktan sonra, hücre süspansiyonlarını kollajen preparatına ekleyin ve kabarcık oluşumunu önlemek için tüpleri birkaç kez hafifçe ters çevirerek tüpleri karıştırın.

Sonra onları tekrar buzun üzerine yerleştirin. Her bir ek parçaya dört ila beş mililitre kollajen çözeltisi ekleyin ve kollajenin bir saat boyunca çok az hareketle veya hiç hareket etmeden başlıkta jelleşmesine izin verin. Bir saat sonra, altı oyuklu plakayı bir ila iki saat daha inkübatöre aktarın.

Daha sonra, plakayı doku kültürü başlığına geri koyun ve zarı ek parçadan aseptik olarak kesmek için bir çift steril forseps ve bir neşter kullanın. Jel içeren hücreyi zardan ayırın ve ardından ayrılan jeli küçük kareler halinde kesin. Kollajen kareleri içeren küçük hücreyi, doldurma portunu kullanarak önceden doldurulmuş 50 mililitrelik kaplardan birine ekleyin.

Daha sonra, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi HCT-8 insan epitel hücrelerinin bir süspansiyonunu hazırlayın. % 30 FBS içeren DMEM'de hücreleri mililitre başına 10 milyon hücre konsantrasyonunda yeniden askıya alın. Ardından, doldurma portunu kullanarak 50 mililitrelik kaba bir mililitre HCT-8 hücre süspansiyonu ekleyin.

Hücreleri ekledikten sonra, kabın içine neredeyse dolacak şekilde 20 mililitre daha 3 boyutlu kültür ortamı ekleyin. Kapağı değiştirin ve doldurma portunun dudağını %70 etanol ile ıslatın. Daha sonra, üç ila dört mililitre 3 boyutlu kültür ortamı içeren beş mililitrelik bir şırıngayı kabın bir portuna ve diğer porta boş beş mililitrelik bir şırınga yerleştirin.

şırıngadan kaba yaklaşık olarak aynı hacimde ortam enjekte edilirken, boş şırınganın içine çekerek görünür kabarcıkları çıkarın. Artık tüm hava çıkarıldıktan sonra, kapları biyoreaktöre yerleştirin, gücü açın ve hızı dakikada 13 ila 14 dönüşe ayarlayın. Hücrelerin damar duvarlarına temas etmesini önlemek için hızı gerektiği gibi ayarlayın.

Hücreleri mikro yerçekimi altında kültürleyin ve kültür ortamını her üç ila dört günde bir değiştirin. Ortamı değiştirmek için, kullanılan ortamın yaklaşık 30 mililitresini taze 3D kültür ortamıyla değiştirmek için çift şırınga yöntemini kullanın. Kültürde üç ila beş gün sonra, periferik kan mononükleer hücrelerini ekteki metin protokolünde tarif edildiği gibi izole edin.

Daha sonra damarı biyoreaktörden çıkarın ve doldurma portundan damarlara lenfosit ve monositlerden oluşan yaklaşık 20 milyon hücre ekleyin. Kapları biyoreaktöre geri koyun ve dört ila altı gün daha kültürleyin. Kültürün dokuzuncu günü civarında, damara lenfosit ve monositlerden oluşan 20 milyon hücre daha ekleyin ve kültürlere 12 güne kadar devam edin.

Deneyin sonunda, şimdi bir yapı olarak adlandırılan her küçük jel parçasını hasat etmek için bir transfer pipeti kullanın ve bunları 10 mililitre% 10 formalin tamponu içeren altı oyuklu bir plakanın kuyularına yerleştirin. Yapıları oda sıcaklığında üç saat boyunca sabitleyin ve ardından standart histolojik gömme, kesit alma ve boyama protokollerine devam edin. Bu videoda sunulan yöntemler, insan bağırsak mukozasının çok hücreli 3 boyutlu organotipik bir modelini üretir.

Mikro yerçekimi kültüründe, hücreler iyi farklılaşır ve 20. güne kadar düzenli, villus benzeri özellikler oluşturur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa altı saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, iyi hücre kültürü yönergelerine uymayı unutmamak önemlidir.

Hücrelerin canlılık, mikoplazma kontaminasyonu ve hücre büyüme davranışındaki değişiklikler açısından sistematik olarak kontrol edilmesi çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, soy ve hücre farklılaşması belirteçlerini belirlemek için immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, mikro yerçekimi altında kültürlenen insan bağırsak mukozasının çok hücreli 3 boyutlu organotipik bir modelinin nasıl geliştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.