İnsan pluripotent kök hücrelerin Süspansiyon tabanlı Kardiyak Farklılaşma için mikro Agrega boyutu Optimizasyon
25 Eylül 2016
Geleneksel yöntemler, insan pluripotent süspansiyon toplam bazlı kalp farklılaşma hücreleri (hPSCs) agrega boyutu ve şekli açısından kültür heterojenite ile rahatsız edilir kaynaklanıyor başlatmak için. Burada, boyut kontrollü hPSC kalp teşvik koşullar altında kültüre agrega üretmek için mikro istihdam kalp farklılaşma için sağlam bir yöntem açıklanmaktadır.
İlk olarak, tek hücreli bir insan pluripotent kök hücresini veya HPSC süspansiyonunu beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, yıkama ortamını aspire edin ve hücreleri, mililitre başına 1.2 kez 10 ila altıncı hücre yoğunluğunda agregasyon ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra, hazırlanan mikrokuyu plakası üzerindeki her bir oyuğa bir mililitre hücre süspansiyonu tohumlayın ve hücreleri eşit olarak dağıtın.
Çok sayıda kuyuyu tohumlamak için, çökelmeyi önlemek için hücre süspansiyonunu periyodik olarak girdaplayın. Tohumlamadan sonra, plakayı beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, hücrelerin her bir mikrokuyunun dibine döndüğünü doğrulamak için plakayı mikroskop altında gözlemleyin.
Daha sonra, plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 CO iki,% 5O iki hipoksik inkübatörde inkübe edin. Agregasyonu takip eden bir gün, agregaları mikroskop altında inceleyin. Santrifüj sonrası hemen toplama ile karşılaştırıldığında, pürüzsüz kenarlarla sağlam görünmelidirler.
Mikrokuyu plakasını yatay olarak tutarak ve bir P-1000 mikropipetleyicinin ucunu kültür ortamının yüzeyine ve kuyunun kenarına yerleştirerek süpernatanı çıkarın. Ardından, mikro kuyuların dibindeki agregaları rahatsız etmemeye dikkat ederek ortamı yavaşça çıkarın. Orta seviyeyi dokulu mikro kuyu yüzeyinden yaklaşık bir ila iki milimetreye düşürdükten sonra, plakayı yavaşça eğin ve kalan ortamı kuyudan yavaşça aspire edin.
Pipet ucunu kuyunun iç kenarına karşı tutarak ve ortamı kuyunun iç duvarına çok yavaş bir şekilde dağıtarak taze hazırlanmış önceden ısıtılmış birinci aşama indüksiyon ortamından bir milileter ekleyin. Plakayı üç gün boyunca hipoksik koşullar altında inkübatöre geri koyun. Dördüncü günde, mikrokuyu plakasının her bir oyuğundan agregaları hasat etmek için beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.
15 mililitrelik konik bir tüpte 10 kuyuya kadar agrega süspansiyonu toplayın. Agregaların hipoksik bir inkübatörde 15 dakika dinlenmesine izin verin. Agregalar çökeldikten sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve artık indüktif sitokinleri çıkarmak için agregaları on mililitre önceden ısıtılmış yıkama ortamında yeniden süspanse edin.
Agregaları iki dakika boyunca 50 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı aspire edin ve peletlenmiş agregaları önceden ısıtılmış ikinci aşama indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin. Agrega süspansiyonunu, oyuk başına bir mililitre olan 24 oyuklu ultra düşük bir bağlantı plakasına aktarın.
Mikroskop altında agregaları tek tip sıkı hücreli kümeler olarak gözlemleyin. Altıncı güne kadar hipoksik koşullar altında inkübe edin. Altıncı günde, daha önce olduğu gibi 15 mililitrelik konik tüp başına 10 mililitreye kadar agrega toplayın.
Agregalar çökeldikten sonra, süpernatanı aspire edin ve agregaları önceden ısıtılmış üçüncü aşama indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin. Beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, agregaları oyuk başına bir mililitre olacak şekilde 24 oyuklu ultra düşük bir bağlantı plakasına yeniden dağıtın. Kültürün 10. gününde tam bir orta değişim gerçekleştirin.
12. günde, kültür periyodunun geri kalanında hücreleri %20 oksijen ve %5 karbondioksit normoksik kültür koşullarına aktarın. Kardiyak indüksiyon evresi üç ortada altı güne karşılık gelen 12 günlük farklılaşmadan sonra, kuvvetli agrega çapında kasılmalar gözlendi. 17. günde, hücrelerin% 74.8'i, histogramın dolu kısmı ile gösterildiği gibi, akış sitometrisi ile kardiyak troponin T için pozitiftir.
Ayrıca, histogramın doldurulmamış bölümü tarafından gösterilen, yalnızca ikincil antikor ile boyanmış hücreler de gösterilmiştir. Bu prosedürü denerken, kardiyak indüksiyon pahasına eser miktarda sitokin seviyesini, özellikle de endoderm farklılaşmasını teşvik eden aktivin-A'yı çıkarmak için agregaları dördüncü günde iyice yıkamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, agrega içindeki indüktif hücre tiplerinin soğuk kültürü gibi diğer yöntemler, komşu embriyonik dokulardan gelen parakrin sinyalizasyonunun, insan pluripotent kök hücre farklılaşmasını kardiyak soy içine nasıl etkilediği gibi diğer soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.
Genel Bakış
Bu makale, boyut kontrollü agregatlar oluşturmak için mikrokuyucuklar kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) kardiyak diferansiyasyonu için sağlam bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, geleneksel tekniklerle ilişkili kültür heterojenliği sorunlarını gidermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kök Hücre Biyolojisi
- Kardiyak Diferansiyasyon
- Doku Mühendisliği
Arka Plan
- İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), kardiyak hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilir.
- Geleneksel yöntemler genellikle farklı boyut ve şekillerde agregatlarla sonuçlanarak farklılaşma çıktılarını etkiler.
- Mikrokuyu teknolojisi, tekdüze agregatlar oluşturmak için bir çözüm sunar.
- Etkili farklılaşma için kardiyak gelişimi destekleyen koşullar esastır.
Çalışmanın Amacı
- Boyut kontrollü hPSC agregatları oluşturmak için bir yöntem geliştirmek.
- Kardiyak diferansiyasyon sonuçlarının tutarlılığını artırmak.
- Kardiyak doku mühendisliği üzerine yapılacak daha ileri araştırmaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Agregatlar oluşturmak için hPSC süspansiyonunun santrifüjlenmesi.
- Agregat boyutunu kontrol etmek için mikrokuyu plakaların kullanımı.
- Kardiyak diferansiyasyonu teşvik etmek için hipoksik koşullar altında inkübasyon.
- Diferansiyasyon aşamalarını indüklemek için ardışık besiyeri değişimleri.
Ana Sonuçlar
- Diferansiyasyon süreci boyunca tekdüze agregatlar oluşturuldu ve korundu.
- Diferansiye olan hücrelerde belirgin kardiyak troponin T ekspresyonu gözlendi.
- İndüktif sitokinlerin daha etkili bir şekilde uzaklaştırılması, kardiyak soy taahhüdünü artırdı.
- Diferansiyasyonun 12. gününden sonra agregat genelinde kontraksiyonlar kaydedildi.
Sonuçlar
- Mikrokuyu yöntemi, hPSC'lerin kardiyak diferansiyasyonu için güvenilir bir yaklaşım sunar.
- Boyutu kontrol edilen agregatlar, daha tutarlı diferansiyasyon sonuçlarına yol açar.
- Bu teknik, kardiyak gelişim ve hastalık modellemesini daha detaylı incelemek için uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Uygunluk
Süspansiyon tabanlı kardiyak farklılaştırmada agregat boyutunun kontrol edilmesi, hPSC kaynaklı kardiyomiyosit üretimindeki temel bir darboğazı, yani değişken verimliliklere yol açan kültür heterojenitesini giderir. Mikrokuyu teknolojisi aracılığıyla tekdüze agregat oluşumunun sağlandığı bu yöntem, farklılaşma sonuçlarındaki öngörülebilirlik güvenini artırarak ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir preklinik model oluşturulmasını destekler. Bu durum, yaklaşımı, erken keşif ve translasyonel iş akışlarında kardiyak soy taahhüdündeki riskleri azaltmak için stratejik bir araç haline getirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değeri: Kardiyak indüksiyondaki boyut bağımlı sinyal yollarının incelenmesini sağlayarak soy belirlemesinin mekanistik itici güçlerini netleştirir.
- Operasyonel Değeri: Agregat oluşumundaki değişkenliği azaltarak deneyler ve ekipler arasındaki tekrarlanabilirliği artırır.
- Öngörücü Değeri: Agregat geometrisini kontrollü bir değişken olarak standartlaştırarak morfojen maruziyetinin doz-yanıt modellemesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Yüksek içerikli görüntüleme ve akış sitometrisi tabanlı kardiyomiyosit sayımı için uygun, tekdüze mikro dokular üretir.
- Ölçeklenebilirlik: Mikrokuyu plak formatı, karşılaştırmalı tarama için birden fazla koşulun veya genetik arka planın paralel olarak işlenmesine olanak tanır.
- Kantitatif Çıktı: Bileşik veya genetik pertürbasyon çalışmalarında fonksiyonel bir okuma olarak kardiyak troponin T-pozitif hücrelerin tutarlı bir şekilde ölçülmesini sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgili Sistem: Kalıtsal kardiyomiyopatilerin veya ilaç kaynaklı kardiyotoksisitenin modellenmesi için ölçeklenebilir, homojen kardiyak agregatlar üretir.
- Translasyonel Süreklilik: Lotlar arası tutarlı hücresel materyal sağlayarak, keşif aşamasındaki diferansiyasyon ile preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Agregat boyutu heterojenliğinden kaynaklanan karıştırıcı değişkenleri minimize ederek, fenotipten genotipe ilişkilendirmelere olan güveni artırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hastalık modelleme, güvenlik farmakolojisi ve rejeneratif tıp aday değerlendirmesi gibi sonraki uygulamaları besleyen standardize hPSC diferansiyasyonuna olanak tanıyarak, keşiften preklinik sürece uzanan süreklilik içerisinde yer alır.
- Keşif Biyolojisi: Agregat boyutunun ve şeklinin hassas kontrolü yoluyla, kardiyak soy hattı belirlemesindeki biyofiziksel ipuçlarına dair hipotezlerin test edilmesini destekler.
- Tarama: Agregasyon değişkenliğinden kaynaklanan gürültüyü azaltarak, bileşik kütüphanesi taramaları için tekrarlanabilir mikro-doku dizileri sağlar.
- Analizler: Popülasyon homojenliği sayesinde artan sinyal-gürültü oranı ile kantitatif akış sitometrisi ve görüntüleme çıktılarını (örneğin, kardiyak troponin T) kolaylaştırır.
- Translasyonel Araştırma: Kontraktilite ve elektrofizyoloji dahil olmak üzere, preklinik fonksiyonel analizler için ölçeklenebilir bir kardiyomiyosit kaynağı sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Mikro-kuyu plakaları farklı projeler ve hücre hatları arasında yeniden kullanılabilir; böylece kök hücre farklılaşma iş akışlarında platform düzeyinde standardizasyonu destekler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Agregat boyutu varyasyonundan kaynaklanan biyolojik gürültüyü en aza indirerek diferansiyasyon sonuçlarındaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış ve ölçeklenebilir agregat oluşumu yoluyla tekrarlanabilirliği ve işlem hacmini geliştirir.
- Stratejik Değer: Verimsiz diferansiyasyondan kaynaklanan yanlış negatifleri azaltarak, erken evre kardiyak programlardaki devam/durdurma kararlarının güvenilirliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Güvenilir kardiyomiyosit verim metriklerine dayalı, riske göre ayarlanmış kaynak tahsisine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- hPSC kültürü, agregat yönetimi ve hipoksik inkübasyon sistemleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Belirli kuyu boyutlarına ve düşük tutunma yüzeylerine sahip mikrokuyu plakalarına erişime bağlıdır.
- Yıkama adımları sırasında agregatların dağılmasını önlemek için standartlaştırılmış besiyeri değişim protokolleri gerektirir.
- Boyut ile farklılaşma verimliliği arasındaki ilişkilerin tutarlı olduğundan emin olmak için farklı hPSC hatlarında doğrulama gerektirir.
- Özel ekipman (hipoksik inkübatörler, düşük tutunma plakaları) ihtiyacı ve hedef dışı farklılaşmayı önlemek için optimize edilmiş sitokin yıkama adımları ile sınırlıdır.
