İnsan pluripotent kök hücrelerin Süspansiyon tabanlı Kardiyak Farklılaşma için mikro Agrega boyutu Optimizasyon

İlk olarak, tek hücreli bir insan pluripotent kök hücresini veya HPSC süspansiyonunu beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, yıkama ortamını aspire edin ve hücreleri, mililitre başına 1.2 kez 10 ila altıncı hücre yoğunluğunda agregasyon ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra, hazırlanan mikrokuyu plakası üzerindeki her bir oyuğa bir mililitre hücre süspansiyonu tohumlayın ve hücreleri eşit olarak dağıtın.

Çok sayıda kuyuyu tohumlamak için, çökelmeyi önlemek için hücre süspansiyonunu periyodik olarak girdaplayın. Tohumlamadan sonra, plakayı beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, hücrelerin her bir mikrokuyunun dibine döndüğünü doğrulamak için plakayı mikroskop altında gözlemleyin.

Daha sonra, plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 CO iki,% 5O iki hipoksik inkübatörde inkübe edin. Agregasyonu takip eden bir gün, agregaları mikroskop altında inceleyin. Santrifüj sonrası hemen toplama ile karşılaştırıldığında, pürüzsüz kenarlarla sağlam görünmelidirler.

Mikrokuyu plakasını yatay olarak tutarak ve bir P-1000 mikropipetleyicinin ucunu kültür ortamının yüzeyine ve kuyunun kenarına yerleştirerek süpernatanı çıkarın. Ardından, mikro kuyuların dibindeki agregaları rahatsız etmemeye dikkat ederek ortamı yavaşça çıkarın. Orta seviyeyi dokulu mikro kuyu yüzeyinden yaklaşık bir ila iki milimetreye düşürdükten sonra, plakayı yavaşça eğin ve kalan ortamı kuyudan yavaşça aspire edin.

Pipet ucunu kuyunun iç kenarına karşı tutarak ve ortamı kuyunun iç duvarına çok yavaş bir şekilde dağıtarak taze hazırlanmış önceden ısıtılmış birinci aşama indüksiyon ortamından bir milileter ekleyin. Plakayı üç gün boyunca hipoksik koşullar altında inkübatöre geri koyun. Dördüncü günde, mikrokuyu plakasının her bir oyuğundan agregaları hasat etmek için beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.

15 mililitrelik konik bir tüpte 10 kuyuya kadar agrega süspansiyonu toplayın. Agregaların hipoksik bir inkübatörde 15 dakika dinlenmesine izin verin. Agregalar çökeldikten sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve artık indüktif sitokinleri çıkarmak için agregaları on mililitre önceden ısıtılmış yıkama ortamında yeniden süspanse edin.

Agregaları iki dakika boyunca 50 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı aspire edin ve peletlenmiş agregaları önceden ısıtılmış ikinci aşama indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin. Agrega süspansiyonunu, oyuk başına bir mililitre olan 24 oyuklu ultra düşük bir bağlantı plakasına aktarın.

Mikroskop altında agregaları tek tip sıkı hücreli kümeler olarak gözlemleyin. Altıncı güne kadar hipoksik koşullar altında inkübe edin. Altıncı günde, daha önce olduğu gibi 15 mililitrelik konik tüp başına 10 mililitreye kadar agrega toplayın.

Agregalar çökeldikten sonra, süpernatanı aspire edin ve agregaları önceden ısıtılmış üçüncü aşama indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin. Beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, agregaları oyuk başına bir mililitre olacak şekilde 24 oyuklu ultra düşük bir bağlantı plakasına yeniden dağıtın. Kültürün 10. gününde tam bir orta değişim gerçekleştirin.

12. günde, kültür periyodunun geri kalanında hücreleri %20 oksijen ve %5 karbondioksit normoksik kültür koşullarına aktarın. Kardiyak indüksiyon evresi üç ortada altı güne karşılık gelen 12 günlük farklılaşmadan sonra, kuvvetli agrega çapında kasılmalar gözlendi. 17. günde, hücrelerin% 74.8'i, histogramın dolu kısmı ile gösterildiği gibi, akış sitometrisi ile kardiyak troponin T için pozitiftir.

Ayrıca, histogramın doldurulmamış bölümü tarafından gösterilen, yalnızca ikincil antikor ile boyanmış hücreler de gösterilmiştir. Bu prosedürü denerken, kardiyak indüksiyon pahasına eser miktarda sitokin seviyesini, özellikle de endoderm farklılaşmasını teşvik eden aktivin-A'yı çıkarmak için agregaları dördüncü günde iyice yıkamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, agrega içindeki indüktif hücre tiplerinin soğuk kültürü gibi diğer yöntemler, komşu embriyonik dokulardan gelen parakrin sinyalizasyonunun, insan pluripotent kök hücre farklılaşmasını kardiyak soy içine nasıl etkilediği gibi diğer soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.