Name: Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Öğrenin mikroakışkan çip kullanarak yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve kültür yöntemini. Hücre hasarını en aza indiren bu teknik, kanser araştırmaları ve hücresel heterojenite çalışmaları için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüleri'nden (03-A1, BNMP11-014) bir hibe ile desteklenmiştir.

Not: Bizim mikroakışkan cihaz imalatı için photomask tasarımları bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak çizildi. tasarımlar daha sonra ticari bir hizmeti kullanarak krom, fotoğraf maskeleri imal etmek yararlanılmıştır. PDMS cihazlar yumuşak litografi teknikleri kullanılarak yapılmıştır. 11 Litografi tarafından Usta Kalıpları 1. Fabrikasyon <ol><li> Fotolitografi işlem 12 önce, bir alt-tabaka 4-inç çaplı silisyum gofret kullanımı ve 10 dakika boyunca 120 ° C de, geleneksel bir fırında gofret dihidrat. </li><li> Bir plazma temizleyici 30 saniye boyunca 100 watt oksijen plazma tedavisi ile susuz silikon gofret temizleyin. </li><li> Aşağıdaki pişirme işlemi için, sırası ile 65 ° C &#39;de iki ocak ve 95 ° C, ön ısıtma. </li><li> spin kaplayıcı ile temizlenir silikon gofret üzerinde olumsuz fotorezist (PR) Coat 5 g; 30 sn 1,200 rpm (SU-8 50) spin mikrokanal tabakası üretmek. </li><li> PR yerleştirin12 dakika boyunca 65 ° C&#39;de önceden ısıtılmış bir sıcak plaka üzerine gofret kaplanmış ve yumuşak bir fırında işlemini gerçekleştirmek için (100 mikron kalınlığında desenler) 33 dakika boyunca 95 ° C&#39;de bir ısıtılmış sıcak plaka aktarın. </li><li> Pişirme sonrasında, bir yarı otomatik maske hizalama sahibinin PR kaplı silikon gofret yerleştirin ve bir 25400 dpi çözünürlük şeffaflık photomask onu hizaya getirin. </li><li> Silikon gofret PR desen oluşturmak için 500 mJ / cm2 dozunda UV ışığı (365 nm) PR kaplı silikon gofret Açığa. </li><li> hizalama gelen gofret çıkarın ve 12 dakika süreyle 95 ° C&#39;de post-Pişirme için bir ocak üzerine yerleştirin. </li><li> hizalama işaretlerini ortaya çıkarmak için 12 dakika ve azot gazı ile hafifçe kuru için çapraz bağlanmamış PR yıkayın SU-8 geliştirici (propilen glikol monometil eter asetat, PGMEA) çözeltide gofret bekletin. </li><li> Yine, spin kaplayıcı tarafından gofret üzerinde olumsuz fotorezist ceket 5 g; 300 ve 30 sn için 30 saniye ve 1200 rpm&#39;de (SU-8 10) 700 rpm&#39;de (SU-8 100) spin# 181; m kalınlığında desen ve 27 mikron kalınlığında desen sırasıyla mikro katmanı yapmak. </li><li> (27 um, derin çekme çukurlu katmanı), 4 dakika ve 8 dakika boyunca 95 ° C &#39;de 65 ° C&#39; de bir sıcak plaka üzerinde PR kaplanmış gofret yerleştirin; 40 dakika boyunca 65 ° C &#39;de ve (300 um derin bir kültür çukurlu tabakası için), 110 dakika boyunca 95 ° C&#39; de. </li><li> Soğuduktan sonra, UV ışığı ile donatılmış maske hizalama PR kaplı silikon gofret yerleştirin. </li><li> 250 mJ / cm 2 (27 mikron kalınlığında deseni) ve 700 mJ / dozunda cm 2 (300 mikron kalınlığında pattern) UV ışığı (365 nm) PR kaplı silikon gofret Açığa. </li><li> sırasıyla 5 dakika boyunca (27 mikron kalınlığında deseni) ve 30 dakika (300 mikron kalınlığında kalıp) 95 ° C &#39;de gofret pişirilir. </li><li> sırasıyla 6 dakika (27 mikron kalınlığında deseni) ve 25 dakika (300 mikron kalınlığında desen), için PGMEA tarafından çapraz bağlanmamış PR yıkayın ve sonra azot gazı ile kurulayın. </li><li> desen özelliklerini yüksekliğini ölçmekBir tarayıcı lazer Profilometrenin xy-sahnede gofret koyarak tarama lazer profilometreyle gofret. <ol><li> açıkça desen 20X objektif mercek altında &quot;kamera görüntüsü&quot; gözlem modu kullanarak gofret özelliklerini göstermek için odak düzlemi ayarlayın. </li><li> &quot;Lazer görünüm&quot; &quot;kamera görüntüsü&quot; dan gözlem moduna geçmek ve özellikleri üst ve alt pozisyonları ayarlayın. </li><li> sırasıyla ölçüm modu, alanı, kalite ve saydam (üstte) kadar z-zift, 1 satır (1.024 x 1), yüksek doğruluk ve 0.5 mikron, ayarlayın ve ardından ölçüme başlamak için başlangıç ​​altını basın. </li></ol></li></ol> Tek hücreli İzolasyon PDMS Cihazlarının 2. Hazırlık <ol><li> PDMS döküm önce, daha kolay ana kalıpları PDMS kopyaları kalkmasına yapar hidrofobik bir yüzey yaratmak için trichlorosilane ile ana kalıpları Silanize. <ol><li> usta kalıpları ve içeren bir ağırlık tekne yerleştirin200 kurutucuda trichlorosilane ul ve 15 dakika boyunca vakum (-85 kPa) uygulanır. </li><li> vakumu durdurmak ve daha sonra en az 1 saat oda sıcaklığında ana kalıpları Silanize için desikatörde ana kalıpları bırakın. </li><li> desikatöre master kalıpları çıkarın ve 10 cm Petri kabındaki her ana kalıp yerleştirin. </li></ol></li><li> bir taban ve 10 arasında bir oranda bir sertleştirme ajanı ihtiva eden 17.6 g PDMS polimer kitinin bir toplam tutarını karıştırın: 1, ve daha sonra Petri kabındaki ana kalıp PDMS dökün. </li><li> desikatörde Petri kabı yerleştirin ve PDMS hava kabarcıklarını çıkarmak için 1 saat vakum (-85 kPa) uygulanır. </li><li> desikatör Petri çanağı çıkarın ve 3 65 ° C sıcaklıkta, geleneksel bir fırında yer - PDMS tedavisi için 6 saat. </li><li> ana kalıpları tedavi PDMS kopyaları çıkarın ve 0 iç-çapına sahip bir puncher&#39;ait yakalama-kuyu dizi PDMS çoğaltma Mikrokanallı iki ucunda iki bir giriş olarak delikleri ve bir çıkış yumruk.Akışkan kanalının (Şekil 2A) için 75 mm. </li><li> PDMS kopyaları yüzeyini temizlemek ve sonra kısa bir oksijen plazma tedavisi (14 sn için 100 watt) için bir plazma temizleyici PDMS kopyaları yerleştirmek için bant kullanın. </li><li> oksijen plazma makineden PDMS kopyaları çıkartın. </li><li> Bir stereomikroskop altında elle bir üst (yakalama mikro içeren) ve (kültür mikro içeren) bir alt PDMS çoğaltma hizalayın ve temas getirmek. </li><li> Nihai cihaz oluşturmak PDMS yinelemeler arasında sürekli bir bağlantı sağlamak için 24 saat boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde hizalanmış PDMS yinelemeler yerleştirin. </li><li> deiyonize (Di) -su doldurulmuş kapta PDMS cihaz ıslatın ve PDMS cihazın mikrokanaldan havayı çıkarmak için 15 dakika boyunca vakum altında (-85 kPa) bir desikatör içinde kap yerleştirmek. </li><li> Bir doku kültürü kaputu DI su dolu PDMS cihaz yerleştirin ve UV ışığı (ışığın dalga boyu: 254 nm) kullanmak 30 mil için cihazın sterilize etmekn. </li><li> 1X PBS çözeltisi içinde% 5 sığır serum albumin (BSA) ile PDMS cihazında distile su yerine ve PDMS yüzeye yapışmasını engellemek için hücrelerin 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. BSA kaplama izole hücre transferi verimini artırmak için kritik yakalama oyuklu kültür oyuklu: edin. </li><li> sterilize 1x PBS çözeltisi ile PDMS cihazın% 5 BSA çözüm değiştirin. </li></ol> Tek hücreli Süspansiyon 3. hazırlanması <ol><li> Kültür Nöral hücre KT98 ve insan karsinoma hücre A549 ve MDA-MB-435, biz kök PDMS cihaz hücre deneyi için hücreler hazırlamak için geleneksel bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem) Petri kabındaki . </li><li> Çıkarın ve geçirilerek kültür ortamı 70 yetiştirilen hücreler kültür kabı (% 10 fetal bovin serumu ve% 1 antibiyotik ile birlikte DMEM bazal ortamı) iptal -% 80 birleşir. </li><li> Yavaşça sterilize PBS üç kez hücreleri yıkayın. &lt;/ Li&gt; <li> (Ayrıntılı bilgi için Malzeme Listesi bakınız) çıkarın ve PBS atmak ve proteolitik, kolajenolitik ve DNaz faaliyetleri ile rekombinant enzim karışımı 2 ml ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kültürü çanak inkübe ve daha sonra hücre ayrılması için kültür çanağı dokunun. </li><li> hücrelerin dağıtılması için steril PBS 4 ml ve sonra 15 ml konik bir tüp hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 3 dakika boyunca 300 xg&#39;de tüp Santrifüj ve süpernatant kaldırmak. </li><li> Yavaşça PBS sterilize 1 ml hücre pelletini ve standart Tripan Mavi dışlama yöntemi 13 kullanarak canlı hücre sayısını. Not: Bu yeniden süspansiyon haline adımı tek hücre izolasyon verimini artırmak için iyi ayrışmış tek hücre süspansiyonu hazırlamak için kritik önem taşır. </li></ol> 4. Tek hücreli İzolasyon ve klonal Kültür <ol><li> 2.5 x10 - 2.2 arasında bir konsantrasyonda Yük hücresi süspansiyonu 50 ul <subir el pipet ile cihazın çıkış deliğinden PDMS cihazın Mikrokanallı içine p&gt; 6 hücre / ml. Not: Hücre süspansiyonu yükleme pipet Mikrokanallı içine hava kabarcıkları almaktan kaçınması durdu ve ilk durağı konumunda düzenlenecek gerekmektedir. </li><li> eşit hücreleri ile tüm Mikrokanallı doldurmak için giriş delikten hücre süspansiyonu başka bir 50 ul yükleyin. </li><li> giriş ve çıkış delikleri damlacıklar gelen hidrostatik basınç ile uyarılan akışını önlemek için bir tıkaç (3 mm uzunluğunda, 1 mm çapında kesim naylon misina) ile çıkış deliği mühür. Not: Fişler kullanmadan önce bir doku kültürü kaput içinde sterilize UV ​​idi. </li><li> , Kültür ortamı ile 1 ml steril şırınga doldurun ondan hava kabarcıklarını çıkarmak ve bir şırınga pompası kurmak. </li><li> Bir 23 G, kör bir iğne ve bir poli-tetrafluoroethene (PTFE) boru ile PDMS cihazın giriş deliğine orta yüklü şırınga bağlayın. </li><li> çıkış deliği ve tüm prizden çıkarınow 2 dk zaman aralığı hücreleri yerçekimi kuvveti tarafından tek hücreli yakalama-kuyu içine yerleşmek için izin vermek. </li><li> şırınga pompası tarafından tahrik edilen 600 | il / dk&#39;lık bir akış oranında kültür ortamında 300 ul uncaptured hücreleri yıkamak. </li><li> Cihazı stabilize etmek 2 dakika bekleyin ve kapalı bir kültür sistemi oluşturmak için fişler ile giriş ve çıkış delikleri kapatın. </li><li> kültür mikro yakalanan tek hücreleri aktarmak için el cihazı çevirin. </li><li> 100 mm doku kültürü çanağı içinde PDMS cihaz yerleştirin ve mikrokanaldan kültür ortamı buharlaşmayı önlemek için cihaz etrafında steril 10 ml PBS ilave edin. </li><li> Tek hücrelerinin klonal kültürü için geleneksel bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem) kültür çanağı hareket. </li></ol> 5. Kültür Orta Yenileme <ol><li> kültür 1 gün sonra, hücre pr geliştirmek için taze ortam PDMS cihazında bir kültür ortamı yerineoliferation. </li><li> Bir sonraki adımı yaparken Mikrokanallı içine hava kabarcıkları almaktan kaçınması giriş ve çıkış delikleri alanların yakınında PDMS cihazın üstündeki kültür ortamının iki damlacıkları yerleştirin. </li><li> Bir giriş olarak, mikrokanalın iki ucunun yakınındaki PDMS cihazın üst ve mikrokanal için bir çıkışı iki delikler. Not: PDMS cihazın tam iki kat üzerinden yumruk etmeyin; Bunun yerine, sadece PDMS üst katmanı sayesinde yumruk. </li><li> Bir 23 G, kör bir iğne ve PTFE tüp vasıtasıyla girişe taze ortam ihtiva eden bir 1 ml&#39;lik plastik bir şırınga bağlayın. </li><li> eski orta yerine 5 dakika süreyle cihaza 120 ul taze orta akış. </li><li> giriş mühür ve delikler çıkış ve hücre kültürü inkübatör cihazı geri dönmek için iki fişleri takın. </li><li> 5.5 adımları 5.4 tekrarlayarak ardından sızdırmazlık tapaları, kaldırarak kültür ortamının kültürünün döneminde her 2 günde bir yenileyin. </li></ol>

<ol><li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , John Wiley & Sons. (2005).</li>
<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).</li>
<li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li>
<li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+single-cell+trapping+and+imaging+using+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays.</a> Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+fibrin+gels+promote+selection+and+growth+of+tumorigenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells.</a> Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).</li>
<li>Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+column%3A+microwell+arrays+for+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture.</a> Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).</li>
<li>Lindstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+microwell+chip+for+culture+and+analysis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e6997(2009).</li>
<li>Lin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+dual-well+device+for+high-throughput+single-cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture.</a> Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li>
<li>Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturization+of+biological+assays+-+Overview+on+microwell+devices+for+single-cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Gen+Subjects%22%5BJournal%5D)">Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses.</a> Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).</li>
<li>Lecault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+single+hematopoietic+stem+cell+proliferation+in+microfluidic+cell+culture+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays.</a> Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).</li>
<li>Park, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+trapping+in+larger+microwells+capable+of+supporting+cell+spreading+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation.</a> Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+an+overview+and+new+approaches+for+their+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization.</a> FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEMS+microwell+and+microcolumn+arrays%3A+novel+methods+for+high-throughput+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays.</a> Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).</li>
<li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Screening+Using+a+Library+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Reveals+Disease-Specific+Patterns+of+Cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Mikro-tabanlı bir aygıt sistemleri 6,14 örneğin 6 yakalama geniş çaplı tek bir hücre tek kök hücre çoğalması 15 gibi tek hücre manipülasyonu ve analiz için kullanılmıştır. De boyut, sayı ve şekil olsa da, özel uygulamalar için ayarlanabilmektedir kuyunun boyutu artar olduğunda tek hücre izolasyon verimi, her zaman ele almaktadır. 9,15 Mikro boyutu hücre yayılması ve büyümesi için izin vermek için büyütülür ise bu sınırlamayı aşmak için, Park ve...

Şu anda bir kültür alanı ayrı ayrı tek hücre yerleştirilmesi genellikle sınırlayıcı seyreltme veya floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanılarak elde edilir. sadece kolayca elde edilebilir Bir pipet ve doku kültür plakaları, gereğine göre bir çok laboratuarlar için, sınırlayıcı seyreltme, uygun bir yöntemdir. Bu durumda, bir hücre süspansiyonu seri uygun bir hücre yoğunluğuna kadar seyreltilir ve daha sonra bir el ile bir pipet kullanarak kültür kuyu içine yerleştirilir. Bu bölmeli tek hücreler daha sonra, 1 ve koloni oluşumu 2 tarama genetik heterojenliğinin olarak, hücre analizi için kullanılmıştır. Sınırlayıcı seyreltme yöntemi Poisson dağılımı doğa% 37 3 maksimum olasılık tek hücreli olayları kısıtlar çünkü Ancak, bu yöntem yardım için bir robot kolu kullanarak olmadan düşük verimlilik ve emek-yoğun, olduğunu. entegre robot kol ile FACS makineleri doğru Plac tarafından Poisson dağılımının sınırlama üstesinden gelebilirBir anda 4 de hiç bir kültürde tek hücreli ing. Ancak, yüksek mekanik kayma gerilmesi 5 (böylece, hücre canlılığını indirdi) ve makine alım ve işletme maliyetleri çok laboratuvarda kullanımını sınırlıdır. Çok verimli bir mikro 6 içine tek hücreler yüklemek için yukarıdaki sınırlamaları aşmak için, mikro cihazlar geliştirilmiştir. Ancak, mikro-yüklü hücreler nedeniyle tek hücreli yükleme olasılığını maksimize etmek için tek bir hücre olduğu yakın microwell her boyutunu yapma ihtiyacı, çoğalmaya için yeterli alan vermeyin. Kültür deneyleri daha büyük mikro-birçok hücre bazlı uygulamalar (örneğin, klonojenik analiz 7), gerekli olduğu için (90 - 650 um çapında ya da yan uzunluğunda), aynı zamanda uzun bir hücre kültürleri için izin vermek için kullanılmıştır. Ancak, sınırlayıcı seyreltme yöntemi gibi, onlar da 10 arasında değişen, düşük tek hücre yükleme verimliliği sahip -.% 30 89 Daha önce, 10 cihazı poli-dimetilsiloksan (PDMS) ile yapıldı. Ayrı ayrı mikro tek hücrelerin izole edilmesi ve izole edilmiş hücrelerin klonojenik deneyde uygulanmasını göstermek için yüksek verimli mikroakışkan platformu geliştirilmiş ve mikro dizilerinin iki grup ihtiva eder adres büyük ölçüde olan boyutu kuyucuklarda tek bir hücreyi yüklenirken verimliliğini artırabilir farklı mikro boyutlarda olan hücrenin önemli ölçüde daha büyüktür. Özellikle, bu &quot;çift kuyu&quot; kavramı kültür alanının büyüklüğü esnek o basit farklı hücre tiplerini ve uygulamalarına uygun cihazın tasarımını ayarlamak için yapım, tek hücreli yakalama verimliliği etkilemeden ayarlanmasına imkan verir. Bu yüksek verimli bir yöntem, hücre heterojenite çalışmaları ve monoklonal hücre çizgisi oluşturulması için uzun vadeli bir hücre kültür deneyleri için yararlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD yazılımı</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Parça No. 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Silikon gofret;</td><td>Eltech kurumsal</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>Konvansiyonel fırın</td><td>YEONG-SHIN şirketi</td><td>OVP45</td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Tezgah Üstü Plazma İşlem Sistemi</td></tr><tr><td>SU-8 50 negatif fotorezist</td><td>MicroChem</td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 negatif fotorezist</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Spin kaplayıcı</td><td>Synrex Co., ve Tic. Ltd. Şti</td><td>SC-HMI 2 "~ 6"</td><td></td></tr> <tr><td>Ocak gözü</td><td>YOTEC şirketi</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak hizalayıcı</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 geliştirici</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Propilen glikol monometil eter asetat</td></tr><tr><td>Taramalı lazer profilometre</td><td>KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>Triklorosilan</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooktil. Tehlikeli. Solunum yollarını aşındırır, su ile şiddetli reaksiyona girer.</td></tr><tr><td>Kurutucu</td><td>Bel-Art Ürünleri</td><td>F42020-0000</td><td>Yer tasarrufu sağlayan vakumlu kurutucu 190&nbsp; mm beyaz baz</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS) kiti</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Harris Tek Çekirdekli zımba</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td>0,75 mm iç çaplı</td></tr><tr><td>Çıkarılabilir bant</td><td>3M Company</td><td>Scotch Çıkarılabilir Bant 811</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Bersing Technology</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bazal orta</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Thermo Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotikler</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamin-Penisilin-Streptomisin</td></tr><tr><td>Rekombinant enzim karışımı</td><td>Yenilikçi hücre teknolojisi</td><td>-105</td><td>Accumax</td></tr><tr><td>DiIC12(3) hücre zarı</td><td>boyası BD Biosciences</td><td></td><td>354218 Hücre izleyici olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Harvard Aparatı</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>Plastik şırınga (1 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>23 gauge künt iğneler</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TD21</td><td></td></tr><tr><td>Poli-tetrafloroeten (PTFE) boru</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>iç çap, 0.51&nbsp; Mm; Dış çap, 0.82&nbsp; Mm</td></tr></tbody></table>

yüksek verim tek hücreli İzolasyonu ve kültür mikroakışkan platformu

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Tek hücrelerin heterojenliğini incelemek birçok biyolojik soru için çok önemlidir, ancak teknik olarak zordur. Bu nedenle, tek hücreli kültür deneylerini gerçekleştirmek için basit ama yüksek verimli bir yönteme ihtiyaç vardır. Burada, yüksek verimli tek hücreli izolasyon (~% 77) için mikroakışkan çip tabanlı bir strateji rapor ediyoruz ve klonojenik test kullanarak uzun vadeli tek hücreli kültür (7 güne kadar) ve hücresel heterojenlik analizi gerçekleştirme yeteneğini gösteriyoruz. Bu uygulamalar KT98 fare nöral kök hücreleri ve A549 ve MDA-MB-435 insan kanser hücreleri ile gösterilmiştir. Yüksek tek hücreli izolasyon verimliliği ve uzun süreli kültür kabiliyeti, mikroakışkan kanalın üstünde ve altında farklı boyutlarda mikrokuyular kullanılarak elde edilir. Küçük mikro kuyu dizisi, tek hücreleri hassas bir şekilde izole etmek için tasarlanmıştır ve büyük mikro kuyu dizisi, mikroakışkan çipte tek hücreli klonal kültür için kullanılır. Bu mikroakışkan platform, izolasyon verimliliğini azaltmadan farklı kültür stratejileri için ayarlanabilir hücre kültürü alanlarının esnekliği nedeniyle tek hücreli kültür uygulamaları için çekici bir yaklaşım oluşturmaktadır.

Tek hücre izolasyonu ve kültürü için mikroakışkan platformu mikro dizileri iki set (Şekil 2A) ile bir mikrokanal (yükseklik 200 mm) içerir. Mikro dizilerin iki set yakalama oyuk (çapı 25 mm ve derinliği 27 mm), sırasıyla, tek hücreli izolasyonu ve kültürü için, kültür oyuk (çapı 285 mm ve derinlik 300 mm), ve her olarak adlandırılır üst görünümü (Şekil 2B) görüldüğü zaman yakalama-kuyu kültür-kuyu merkezinde konumlandırılmış. Cihaz işlemi (şematik işlem ...

Burada, yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve uzun süreli klonal kültüre izin vermek için yeni bir mikro kuyu tasarım konseptini kullanan mikroakışkan bir platformla tek hücreleri izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Bu protokolün genel amacı, yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve kültürüne olanak tanıyan bir mikroakışkan çipin üretimini ve çalıştırılmasını göstermektir. Bu yöntem, tek hücre izolasyonu ve kültüründen fayda sağlayacak her alan için kullanışlı bir araç sunar. Bu tekniğin temel avantajı, tek hücrelerin geniş mikro kuyu dizilerine yüklenmesinde oldukça verimli olmasıdır.Ek olarak, hücre hasarını en aza indirmek için cihazı çalıştırmak amacıyla yalnızca hafif akış ve yerçekimi kuvveti kullanılır. Bu tekniğin amacı, hücresel heterojenliğin hücre yanıtını etkilediği kanser gibi insan hastalıklarının nihai teşhisine yöneliktir; limit dilüsyon yöntemi çok zaman alıcı ve verimsiz olduğu için mikrokuyu hücre hattını oluştururken bu yöntemi geliştirme fikrini ortaya attık. Artık bu yöntem, tekil hücre analizine dair içgörü sağlayabilmektedir.Bu yöntem, tekil hücre seyri ve davranışının kurulması ve zamanla gözlemlenmesi gibi diğer uygulamalara da uyarlanabilir. Başlamak için, beraberindeki metin protokolünde açıklanan standart fotolitografi yöntemini kullanarak, hem tek hücre izolasyon katmanı hem de mikro kuyu kültür katmanı için silanize ana kalıplar hazırlayın. Her bir ana kalıp için, tek kullanımlık bir kapta 16 gram PDMS bazını 1,6 gram kürleme ajanıyla birleştirin ve karışımlar homojen hale gelene kadar karıştırın.Ardından, ana kalıpları 150 milimetrelik petri kaplarına yerleştirin ve kalıpların üzerine PDMS dökün. PDMS'deki hava kabarcıklarını gidermek için petri kaplarını bir desikatöre yerleştirin ve bir saat boyunca vakum uygulayın. Bir saat sonra, kapları desikatörden çıkarın ve PDMS'nin kürlenmesi için 65 °C sıcaklıktaki geleneksel bir fırında üç ila altı saat bekletin.Ardından, kapları fırından çıkarın ve oda sıcaklığına gelene kadar soğumaya bırakın. Soğuduktan sonra, kürlenmiş PDMS yakalama kuyucuğu dizisini ve mikro kuyu kültür dizisini ana kalıplardan soyun ve cihazları bir jilet kullanarak kesin. Sonrasında, yakalama kuyucuğu dizisi tabakasındaki mikro kanalın her iki ucuna birer delik açmak için 0,75 milimetrelik bir punch kullanın.Cihazın iç yüzeyi olacak kısmı temizlemek için bant kullanın ve ardından iç yüzeyleri yukarı bakacak şekilde münferit katmanları kısa süreli bir oksijen plazma işlemi için plazma temizleyiciye yerleştirin. İşlem tamamlandığında, PDMS katmanlarını plazma temizleyiciden çıkarın ve cihazın üst ve alt katmanlarını hizalayıp birleştirmek için bir stereo mikroskop kullanın. PDMS katmanları arasında kalıcı bir bağ oluşturmak için hizalanmış cihazı 65 °C'deki bir fırında 24 saat boyunca bekletin.Ardından, cihazın mikrokanalındaki havayı tahliye etmek için, yapıştırılmış PDMS cihazı deiyonize suyun içine yerleştirin ve kabı bir desikatörde 15 dakika boyunca vakuma tabi tutun. Cihazdaki tüm hava tahliye edildikten sonra, PDMS cihazını bir doku kültürü kabinine yerleştirin ve cihaz yüzeyini sterilize etmek için 30 dakika boyunca UV ışığı kullanın. Sonrasında, cihazdaki deiyonize suyu PBS içinde %5 bovine serum albumin ile değiştirin ve cihazı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.Bu işlem yüzeyi bloke edecek ve izole edilen hücrelerin yakalama kuyucuklarından kültür kuyucuklarına aktarım verimliliğini artıracaktır. 30 dakika sonra, cihazdaki bloklama solüsyonunu steril PBS ile değiştirin. Mililitre başına 2,5 milyon hücre içeren tek hücre süspansiyonu hazırlayın ve bir pipete 50 µL süspansiyon yükleyin.Ardından, hücreleri cihazın çıkış deliği aracılığıyla cihaza aktarın. Tüm mikrokanalı hücrelerle eşit şekilde doldurmak için 50 µL daha hücre süspansiyonu yükleyin ve bunu giriş deliği aracılığıyla cihaza aktarın. Yükleme tamamlandıktan sonra, cihazın çıkış deliğini kapatmak için bir milimetre çapında naylon olta misinasından yapılmış steril bir tıpa kullanın.Ardından, bir mililitrelik steril bir şırıngayı kültür ortamı ile doldurun, kalan hava kabarcıklarını dışarı atın ve şırınga pompasına yerleştirin. Şırıngaya 23 gauge küt uçlu bir iğne takın ve iğneyi cihazın girişine bağlamak için politetrafloroetilen tüp kullanın. Tüpü bağladıktan sonra, çıkış deliğindeki tıpayı çıkarın ve hücrelerin yerçekimi kuvvetiyle tek hücre yakalama kuyucuklarına yerleşmesi için iki dakika bekleyin.Ardından, şırınga pompasını dakikada 600 microliters olarak ayarlayın. Çıkış tapasını çıkarın ve yakalanmamış hücreleri 30 saniye boyunca yıkayarak uzaklaştırın. Basıncın stabilize olması için iki dakika bekleyin.Ardından tüpü cihazın girişinden çıkarın ve kapalı bir kültür sistemi oluşturmak için hem giriş hem de çıkış deliklerini tıpalarla kapatın. Şimdi, yakalanan tek hücreleri cihazın diğer tarafındaki kültür mikrokovucuklarına aktarmak için cihazı elinizle ters çevirin. Daha sonra, cihazı 100 milimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin, cihazın etrafına 10 mililitre sterilize edilmiş PBS ekleyin ve kabı bir inkübatöre yerleştirin.Kültür ortamını değiştirmek için, mikrokanala hava kabarcığı girmesini önlemek amacıyla önce PDMS cihazının üst kısmına, giriş ve çıkışın yakınına iki damla kültür ortamı yerleştirin. Ardından, 0,75 milimetrelik bir biyopsi puncher'ı kullanarak mikrokanalın uçlarının yakınından PDMS cihazının üst kısmında iki delik açın. Sadece cihazın üst katmanını deldiğinizden emin olun.Ardından, taze ve önceden ısıtılmış besiyeri içeren bir mililitrelik plastik bir şırıngayı doldurun; 23 gauge küt uçlu bir iğne ve PTFE boru kullanarak şırıngayı yeni oluşturulan giriş portuna bağlayın. Eski besiyerini değiştirmek için yaklaşık 120 µL taze besiyerini beş dakika boyunca yavaşça cihazın içine akıtın. İşlem tamamlandığında, giriş ve çıkış portlarını iki tıpa kullanarak mühürleyin ve cihazı hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin.Yakalama kuyucuklarına giren hücrelerin sayısı, hücre tipine bağlı olarak yaklaşık %68 ile %85 arasında değişmektedir. Ayrıca, her üç hücre tipi için de yakalama kuyucuklarının çoğunda yalnızca tek bir hücre bulunmaktadır. Yakalanan KT98 hücrelerinin kültür kuyucuklarına aktarılmasını takiben, kuyucukların yaklaşık %77'sinde yalnızca tek bir hücre, %16'sında hiç hücre, %6'sında iki hücre ve %1'inden daha azında üç veya daha fazla hücre bulunmuştur.Yedi gün boyunca, izole edilmiş tek hücreler heterojen büyüme modelleri sergilemiştir. Bazı hücreler çoğalırken, diğerleri çoğalmamıştır. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem doğru şekilde yürütülürse yaklaşık 20 dakikada tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, tek hücreli deneylerinizin verimliliğini artırmak için bu yüksek kapasiteli tek hücre izolasyonu endokrinal kültür platformunun nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, mikrokanala hava kabarcıklarının girmesinden kaçınmayı ve zaman geçtikçe hücrelerin birbirleriyle agregasyon oluşturmasını önlemeyi unutmamak önemlidir.

a-microfluidic-platform-for-high-throughput-single-cell-isolation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokolde, prokaryotik mikroorganizmaların tek hücreli analizi için bir mikroakışkan pikolitre biyoreaktörün (PLBR) üretimi, kurulumu ve temel çalışması tanıtılmaktadır. Endüstriyel olarak ilgili mikroorganizmalar, geleneksel yöntemlerle neredeyse imkansız olan, belirli zaman dilimlerinde büyüme hızı, morfoloji ve fenotipik heterojenlik hakkında bilgi sahibi olmaya izin veren ilke kanıtı olarak analiz edildi.

Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması

Biz mikro ölçekli hücre stimülasyonu deneyler için otomatik bir hücre kültürü ve sorgulama platformu geliştirdik. Platform yetiştirilmesi ve hücrelerin küçük nüfus uyarıcı ve moleküler analizler için lizatları kurtarma, basit, çok yönlü ve hassas kontrol sağlar. Platform de değerli hücreleri ve / veya reaktif kullanmak çalışmalar için uygundur.

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Burada, birincil hücreleri, doku modellerini ve punch biyopsilerini 28 güne kadar mikroakışkan çok organlı bir çipte kokültür yapmak için bir protokol sunuyoruz. İnsan dermal mikrovasküler endotel hücreleri, karaciğer agregatları ve deri biyopsileri ortak bir besiyeri dolaşımında başarılı bir şekilde birleştirildi.

Çok organ Chip - Uzun vadeli Çok doku kokültürü için mikroakışkan Platformu

Bu protokol, bir mikroakışkan cihaz kullanarak otomatik küçük hacimli (0,15–1,5 ml) parçacık ayırma işlemleri gerçekleştirmek için bir sistem mimarisini tanımlar ve akustoakışkan cihaz performansını ve çalışmasını optimize etme yöntemlerini tartışır.

Bir mikroakışkan Hassas Küçük hacimli Numune İşleme Platformu ve Akustik mikrocihazda Ayrı Biyolojik Parçacıklar Boyutu Kullanımı

Tek hücreli sıralama genotypic heterojenlik biyolojik sistemlerde ortaya çıkarır, ama daha fazla işlem hacmi derin topluluk kompozisyon ve işlev profil oluşturma için gerekli güncel teknolojileri eksikliği. Burada, biz bir mikrosıvısal iş akışı sıralama için tarif &gt; 50.000 tek hücreli genleri farklı popülasyonlar hücre.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Bu rapor, birden fazla hücrenin yüksek verimli eşleştirme ve mikroskobik analizinin sağlanabileceği tek bir hücre kültürü deneyi kurmak için mikroakışkan çip tabanlı bir yöntem tanımlanmaktadır.

Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması

1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için mikroakışkan bir sistem sunuyoruz. Mikroakışkan çip, vivodaki son derece karmaşık ve dinamik mikro çevresel koşulların analizini sağlar.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Klinik mikroakışkan çip, klinik hasta kan numunesinin ön işlenmesini basitleştiren ve çip üzerinde yerinde dolaşan tümör hücrelerini (CTC'ler) yerinde boyayarak tek bir CTC'nin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve tanımlanmasını sağlayan önemli bir biyomedikal analiz tekniğidir.

Çok Yönlü Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İzolasyonu için Klinik Mikroakışkan Çip Platformu

Bu protokol, mikrobiyal monoklonal izolasyon, yetiştirme ve toplama işlemlerini gerçekleştirmek için Tek hücreli Mikrolitre damlacık Kültür Omik Sisteminin (MISS hücresi) nasıl kullanılacağını açıklar. MISS hücresi, mükemmel damlacık monodispersisitesi, yüksek paralel yetiştirme ve yüksek verimli biyokütle tespiti sunan damlacık mikroakışkan teknolojisine dayalı entegre bir iş akışı sağlar.

Tek Hücreli Mikrolitre Damlacık Kültürü Omik Sistemini Kullanarak Otomatik ve Yüksek Verimli Mikrobiyal Monoklonal Yetiştirme ve Toplama

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler), kanserin ilerlemesi ve metastazının incelenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, CTC zenginleştirme ve tek CTC dizilimi için yüksek verimli, entegre bir protokol sunmakta, kontaminasyon ve dizileme maliyetlerini azaltırken yakalama verimliliğini ve CTC saflığını artırmakta, böylece hassas onkoloji araştırmalarını ve klinik uygulamaları ilerletmektedir.

Mikroakışkan Tabanlı Yüksek Verimli Dolaşımdaki Tümör Hücresi Sıralama ve Tek Hücre Dizileme Teknolojisi

Öğrenin mikroakışkan çip kullanarak yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve kültür yöntemini. Hücre hasarını en aza indiren bu teknik, kanser araştırmaları ve hücresel heterojenite çalışmaları için değerli bir araçtır.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Daha fazla video keşfet