Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Bu protokolün genel amacı, yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve kültürüne olanak tanıyan bir mikroakışkan çipin üretimini ve çalıştırılmasını göstermektir. Bu yöntem, tek hücre izolasyonu ve kültüründen fayda sağlayacak her alan için kullanışlı bir araç sunar. Bu tekniğin temel avantajı, tek hücrelerin geniş mikro kuyu dizilerine yüklenmesinde oldukça verimli olmasıdır.

Ek olarak, hücre hasarını en aza indirmek için cihazı çalıştırmak amacıyla yalnızca hafif akış ve yerçekimi kuvveti kullanılır. Bu tekniğin amacı, hücresel heterojenliğin hücre yanıtını etkilediği kanser gibi insan hastalıklarının nihai teşhisine yöneliktir; limit dilüsyon yöntemi çok zaman alıcı ve verimsiz olduğu için mikrokuyu hücre hattını oluştururken bu yöntemi geliştirme fikrini ortaya attık. Artık bu yöntem, tekil hücre analizine dair içgörü sağlayabilmektedir.

Bu yöntem, tekil hücre seyri ve davranışının kurulması ve zamanla gözlemlenmesi gibi diğer uygulamalara da uyarlanabilir. Başlamak için, beraberindeki metin protokolünde açıklanan standart fotolitografi yöntemini kullanarak, hem tek hücre izolasyon katmanı hem de mikro kuyu kültür katmanı için silanize ana kalıplar hazırlayın. Her bir ana kalıp için, tek kullanımlık bir kapta 16 gram PDMS bazını 1,6 gram kürleme ajanıyla birleştirin ve karışımlar homojen hale gelene kadar karıştırın.

Ardından, ana kalıpları 150 milimetrelik petri kaplarına yerleştirin ve kalıpların üzerine PDMS dökün. PDMS'deki hava kabarcıklarını gidermek için petri kaplarını bir desikatöre yerleştirin ve bir saat boyunca vakum uygulayın. Bir saat sonra, kapları desikatörden çıkarın ve PDMS'nin kürlenmesi için 65 °C sıcaklıktaki geleneksel bir fırında üç ila altı saat bekletin.

Ardından, kapları fırından çıkarın ve oda sıcaklığına gelene kadar soğumaya bırakın. Soğuduktan sonra, kürlenmiş PDMS yakalama kuyucuğu dizisini ve mikro kuyu kültür dizisini ana kalıplardan soyun ve cihazları bir jilet kullanarak kesin. Sonrasında, yakalama kuyucuğu dizisi tabakasındaki mikro kanalın her iki ucuna birer delik açmak için 0,75 milimetrelik bir punch kullanın.

Cihazın iç yüzeyi olacak kısmı temizlemek için bant kullanın ve ardından iç yüzeyleri yukarı bakacak şekilde münferit katmanları kısa süreli bir oksijen plazma işlemi için plazma temizleyiciye yerleştirin. İşlem tamamlandığında, PDMS katmanlarını plazma temizleyiciden çıkarın ve cihazın üst ve alt katmanlarını hizalayıp birleştirmek için bir stereo mikroskop kullanın. PDMS katmanları arasında kalıcı bir bağ oluşturmak için hizalanmış cihazı 65 °C'deki bir fırında 24 saat boyunca bekletin.

Ardından, cihazın mikrokanalındaki havayı tahliye etmek için, yapıştırılmış PDMS cihazı deiyonize suyun içine yerleştirin ve kabı bir desikatörde 15 dakika boyunca vakuma tabi tutun. Cihazdaki tüm hava tahliye edildikten sonra, PDMS cihazını bir doku kültürü kabinine yerleştirin ve cihaz yüzeyini sterilize etmek için 30 dakika boyunca UV ışığı kullanın. Sonrasında, cihazdaki deiyonize suyu PBS içinde %5 bovine serum albumin ile değiştirin ve cihazı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.

Bu işlem yüzeyi bloke edecek ve izole edilen hücrelerin yakalama kuyucuklarından kültür kuyucuklarına aktarım verimliliğini artıracaktır. 30 dakika sonra, cihazdaki bloklama solüsyonunu steril PBS ile değiştirin. Mililitre başına 2,5 milyon hücre içeren tek hücre süspansiyonu hazırlayın ve bir pipete 50 µL süspansiyon yükleyin.

Ardından, hücreleri cihazın çıkış deliği aracılığıyla cihaza aktarın. Tüm mikrokanalı hücrelerle eşit şekilde doldurmak için 50 µL daha hücre süspansiyonu yükleyin ve bunu giriş deliği aracılığıyla cihaza aktarın. Yükleme tamamlandıktan sonra, cihazın çıkış deliğini kapatmak için bir milimetre çapında naylon olta misinasından yapılmış steril bir tıpa kullanın.

Ardından, bir mililitrelik steril bir şırıngayı kültür ortamı ile doldurun, kalan hava kabarcıklarını dışarı atın ve şırınga pompasına yerleştirin. Şırıngaya 23 gauge küt uçlu bir iğne takın ve iğneyi cihazın girişine bağlamak için politetrafloroetilen tüp kullanın. Tüpü bağladıktan sonra, çıkış deliğindeki tıpayı çıkarın ve hücrelerin yerçekimi kuvvetiyle tek hücre yakalama kuyucuklarına yerleşmesi için iki dakika bekleyin.

Ardından, şırınga pompasını dakikada 600 microliters olarak ayarlayın. Çıkış tapasını çıkarın ve yakalanmamış hücreleri 30 saniye boyunca yıkayarak uzaklaştırın. Basıncın stabilize olması için iki dakika bekleyin.

Ardından tüpü cihazın girişinden çıkarın ve kapalı bir kültür sistemi oluşturmak için hem giriş hem de çıkış deliklerini tıpalarla kapatın. Şimdi, yakalanan tek hücreleri cihazın diğer tarafındaki kültür mikrokovucuklarına aktarmak için cihazı elinizle ters çevirin. Daha sonra, cihazı 100 milimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin, cihazın etrafına 10 mililitre sterilize edilmiş PBS ekleyin ve kabı bir inkübatöre yerleştirin.

Kültür ortamını değiştirmek için, mikrokanala hava kabarcığı girmesini önlemek amacıyla önce PDMS cihazının üst kısmına, giriş ve çıkışın yakınına iki damla kültür ortamı yerleştirin. Ardından, 0,75 milimetrelik bir biyopsi puncher'ı kullanarak mikrokanalın uçlarının yakınından PDMS cihazının üst kısmında iki delik açın. Sadece cihazın üst katmanını deldiğinizden emin olun.

Ardından, taze ve önceden ısıtılmış besiyeri içeren bir mililitrelik plastik bir şırıngayı doldurun; 23 gauge küt uçlu bir iğne ve PTFE boru kullanarak şırıngayı yeni oluşturulan giriş portuna bağlayın. Eski besiyerini değiştirmek için yaklaşık 120 µL taze besiyerini beş dakika boyunca yavaşça cihazın içine akıtın. İşlem tamamlandığında, giriş ve çıkış portlarını iki tıpa kullanarak mühürleyin ve cihazı hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin.

Yakalama kuyucuklarına giren hücrelerin sayısı, hücre tipine bağlı olarak yaklaşık %68 ile %85 arasında değişmektedir. Ayrıca, her üç hücre tipi için de yakalama kuyucuklarının çoğunda yalnızca tek bir hücre bulunmaktadır. Yakalanan KT98 hücrelerinin kültür kuyucuklarına aktarılmasını takiben, kuyucukların yaklaşık %77'sinde yalnızca tek bir hücre, %16'sında hiç hücre, %6'sında iki hücre ve %1'inden daha azında üç veya daha fazla hücre bulunmuştur.

Yedi gün boyunca, izole edilmiş tek hücreler heterojen büyüme modelleri sergilemiştir. Bazı hücreler çoğalırken, diğerleri çoğalmamıştır. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem doğru şekilde yürütülürse yaklaşık 20 dakikada tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, tek hücreli deneylerinizin verimliliğini artırmak için bu yüksek kapasiteli tek hücre izolasyonu endokrinal kültür platformunun nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, mikrokanala hava kabarcıklarının girmesinden kaçınmayı ve zaman geçtikçe hücrelerin birbirleriyle agregasyon oluşturmasını önlemeyi unutmamak önemlidir.