Parazit Mikro / Nanoparçacık Hücre Mühendisliği mikroakışkan Tampon Değişim

Bu prosedürün genel amacı, nanopartiküllerle hücre mühendisliği sonrası, serbest nanopartikülleri hücrelerden ayırmak için uygun, verimli ve yüksek kapasiteli bir mikroakışkan saflaştırma teknolojisini göstermektir. Bu teknolojinin temel amacı, hücre işleme prosedürünün ardından bağlanmamış nanopartiküllerin hızlı ve verimli bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlamaktır. Bu mikroakışkan hücre saflaştırma teknolojisi, spiral bir mikro cihaz içindeki hücrelerin ve nanopartiküllerin farklı atalet odaklama etkileri sayesinde boyut tabanlı etkili bir ayırma gerçekleştirir.

Bu cihaz, rejeneratif tıp ve yüksek hacimli hücre işleme süreçleri için oldukça yararlı olan, mil konsantrasyon başına 10 milyon hücreye kadar işleme kapasitesine sahiptir. Bu teknoloji, görüntüleme amaçlı veya fonksiyon kontrolü için hücreleri etiketlemede sıklıkla nanoparçacıkların kullanıldığı hücre mühendisliği alanı için oldukça talep görmektedir. Prosedürü, laboratuvarımdan araştırma asistanı Hui Min Tay ve Profesör Xi'nin laboratuvarından doktora sonrası araştırma görevlisi Doktor David Yeo uygulamalı olarak göstereceklerdir.

Nanopartiküllerle etiketleme yapmadan önce, mezenkimal kök hücreleri altı kuyucuklu bir plakada %80'den fazla konfluense ulaşana kadar kültürleyin. Benzer şekilde, THP-1 hücrelerini mililitre başına bir milyon hücre yoğunluğuna ulaşacak şekilde kültürleyin. Ardından, bir miligram silika nanopartikülü, bir mililitre iki yüz mikromolar kalsiyum boya çözeltisi ile çözün.

Ve partikülleri gece boyunca karıştırın. Ayrıca, burada gösterilen referansta açıklanan yöntemleri kullanarak PLGA kalsiyum AM nanopartikülleri hazırlayın. 1 mg PLGA kalsiyum AM nanopartikülünü veya 150 µg kalsiyum silika nanopartikülü, %0,1 poli-l-lizinli su çözeltisi içinde, çözeltiyi bir dakika boyunca pipetleyerek karıştırın.

Ardından oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika inkübe edin. Sonra nanopartikülleri santrifüjleyin. Fazla poly-l-lysine içeren süpernatanı uzaklaştırın ve nanopartikülleri, işaretlenecek hücre tipi için uygun olan 1 ml kültür ortamında yeniden süspande edin.

Kültürdeki her bir milyon hücre için bir mililitre besiyerine 1 milligrams işaretli nanoparçacık ekleyin. Hücre, nanoparçacık ve besiyeri karışımını bir dakika boyunca pipetleyerek iyice karıştırın. Ardından karışımı yaklaşık 24 saat boyunca inkübe edin.

Etiketleme işleminden sonra, kök hücreleri ayrıştırıp toplayın ve mikroakışkan işlem için mililitre başına 100.000 ile 1.000.000 hücre arasındaki bir konsantrasyonda yeniden süspande edin. Aynı konsantrasyonda etiketlenmiş THP-1 hücrelerini kullanın. Mikroakışkan spiral cihazı üretmek için öncelikle standart mikrofabrikasyon tekniklerini kullanarak bir silikon gofre ana kalıp hazırlayın.

Ardından, 30 gram baz PDMS prepolimerini ve üç gram kürleme ajanını bir tartım kabı içerisinde iyice karıştırın. Hava kabarcıklarını gidermek için karışımı vakum altında 60 dakika boyunca gazdan arındırın. PDMS karışımını, spiral kanal tasarımıyla desenlendirilmiş ana kalıbın üzerine, dikkatli bir şekilde beş ila 10 milimetre yüksekliğe ulaşacak şekilde dökün.

Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için karışımı 60 dakika boyunca degaze edin. Tüm kabarcıklar yok olana kadar bu işlemi tekrarlayın. Sonrasında, sabit bir cihaz yüksekliği sağlamak amacıyla, kürleme sırasında gofretin eğilmediğinden emin olarak gofreti bir fırına yerleştirin.

PDMS'yi 80 °C'de iki saat boyunca kürleyin. Soğuduktan sonra, PDMS spiral cihazı bir skalpel kullanarak kesin ve PDMS tabakasını ana kalıptan dikkatlice soyun. Ardından, yapıştırma işlemi için pürüzsüz bir yüzey sağlamak amacıyla cihazın kenarlarını skalpel ile düzeltin.

Ardından, girişler için iki delik ve çıkışlar için iki delik açmak üzere 1,5 mm'lik bir biyopsi pançı kullanın. Herhangi bir kalıntıyı temizlemek için cihazı izopropanol ile yıkayın. Ve cihazı 80 °C'lik bir fırında beş dakika boyunca kurutun.

Ardından, PDMS cihazının alt yüzeyini ve bir lam camının bir yüzeyini temizlemek için maskeleme bandı kullanın. Lam camını ve PDMS cihazını, temiz yüzeyleri dışarı bakacak şekilde dikkatlice bir plazma odasına yerleştirin. Plazma gücünü maksimuma getirin, oda pembe renge dönene kadar oda basıncını düşürün ve bileşenleri 60 saniye boyunca maruz bırakın.

Ardından, lamı ve PDMS cihazını odadan çıkarın. Plazmaya maruz kalan yüzeyleri birbirine sıkıca bastırarak bunları birbirine bağlayın. İki yüzey arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olun.

Bağlantıyı güçlendirmek için, bağlanmış cihazı 80 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı tabla üzerinde iki saat boyunca ısıtın. Girişler için 15 ila 20 cm uzunluğunda iki adet tüp parçası kesin ve her tüpün bir ucuna 23 gauge iğne takın. Ardından, çıkışlar için aynı tüpten 5 ila 10 cm uzunluğunda iki parça kesin ve bunları cihazın çıkış deliklerine takın.

Numuneyi çalıştırmadan önce, çıkış tüpünden akış başlayana kadar cihazı %70 etanol içeren bir şırınga ile manuel olarak hazırlayın. Sterilizasyon için etanolün cihazda en az 30 saniye boyunca kalmasını sağlayın. Ardından, 60 mL'lik bir şırıngaya %1 BSA içeren 30 mL filtrelenmiş PBS doldurun.

Ayrıca, üç mililitre etiketli hücreyi üç mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve her iki şırıngada da hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Nozülden birkaç damla sıvıyı nazikçe püskürterek varsa hava kabarcıklarını giderin. Giriş şırıngası uçlarını ve boruları şırıngalara bağlayın ve şırıngaları şırınga pompalarına sabitleyin.

Tüpleri cihazın ilgili girişlerine yerleştirin ve boru hattı boyunca hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Akışkan sistem kurulumu tamamlandıktan sonra, hücre ayıklama işlemi sırasında gerçek zamanlı görüntüleme yapmak için cihazı ters bir faz kontrast mikroskobuna monte edin. Mikroskop tablasında, cihazın yanına küçük bir atık beheri ve iki adet 15 mililitre tüp sabitleyin.

Cihazın her iki çıkışından gelen çıkış borularını atık beherin içine yerleştirin. Şimdi, örnek şırıngasının akış hızını 120 microliters per minute ve kılıf şırıngasının akış hızını 1, 200 microliters per minute olarak ayarlayarak, örnekten kılıf tamponuna olan akış oranını 1'e 10 olarak ayarlayın. Akış hızının stabilize olması için cihazı bir buçuk dakika boyunca çalıştırın.

Aydınlık alan faz kontrastı altında, kanal iç duvarı yakınında eylemsizle odaklanmış hücrelerin varlığını doğrulamak için yüksek hızlı bir kamera kullanın. Kararlı durum akışına ulaşıldığında ve cihaz doğru şekilde çalıştığında, hücre çıkışından ve atık çıkışından ayrı elüentler toplamak için çıkış tüplerini farklı tüplere yerleştirin. Bu cihaz, işaretlenmiş THP-1 monositik hücre süspansiyonunu floresan silika nanopartiküllerden doğru şekilde ayırabilmektedir.

Hem yüksek hızlı görüntüleme hem de akış sitometrisi analiziyle doğrulandığı üzere yüksek ayırma verimleri elde edilmiştir. Tek aşamalı saflaştırma stratejisi, santrifügasyona gerek kalmadan, taze tampon çözelti içinde süspansiyona alınmış işaretli süspansiyon ve yapışkan hücrelerin sürekli olarak geri kazanılmasını sağlar. Cihaz, hem silika hem de PLGA nanoparçacıkları ile yüksek verimli ayırma yapabilme kapasitesine sahiptir ve mililitre başına 10 milyon hücreye kadar aynı yüksek verimlilikle ayırabilmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin nanoparçacıklarla nasıl etiketleneceğini ve özel mikroakışkan cihazımız kullanılarak bağlanmamış fazla parçacıkların uzaklaştırılmasıyla etiketli hücrelerin nasıl saflaştırılacağını iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.