Parazit Mikro / Nanoparçacık Hücre Mühendisliği mikroakışkan Tampon Değişim
10 Temmuz 2016
Bu protokol, bağlanmamış partiküllerin randımanlı bir şekilde azalması olan mikro / nanopartikül mühendislik hücrelerinin saflaştırılması için bir atalet Mikroakiskan tabanlı tampon değişimi stratejisi kullanımını tarif eder.
Bu prosedürün genel amacı, nanopartiküllerle hücre mühendisliğini takiben serbest nanopartikülleri hücrelerden ayırmak için uygun, verimli ve yüksek verimli bir mikroakışkan saflaştırma teknolojisi göstermektir. Bu teknolojinin en büyük amacı, bağlanmamış nanopartiküllerin hızlı ve verimli bir şekilde uzaklaştırılmasına izin vermektir. Hücre işleme prosedüründen sonra, tüm seslerimizi topluyoruz. Bu mikroakışkan hücre saflaştırma teknolojisi, spiral bir mikro cihazdaki hücrelerin ve nanopartiküllerin diferansiyel atalet odaklama etkileri nedeniyle verimli boyuta dayalı ayırma sağlar.
Rejeneratif tıp ve mandal hacmi hücre işleme için çok yararlı olan mil konsantrasyonu başına 10 milyon hücreyi işleyebilir. Bu teknoloji, görüntüleme amaçlı veya fonksiyon kontrolü için hücrelerde çalışmak için genellikle nanopartikül kullanan hücre mühendisliği alanı için yüksek arzu edilmektedir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Hui Min Tay ve Profesör Xi'nin laboratuvarından bir doktor sonrası araştırma görevlisi olan Doktor David Yeo olacak.
Mezenkimal kök hücreleri, hücreleri nanopartiküllerle etiketlemeden önce altı oyuklu bir plaka üzerinde% 80'den daha fazla birleşecek şekilde kültürleyin. Benzer şekilde, THP-1 hücrelerini mililitre başına bir milyon hücre yoğunluğuna kadar kültürleyin. Daha sonra, bir miligram silika nanopartikülleri bir mililitre iki yüz mikromolar kalsiyum boya çözeltisi ile çözün.
Ve parçacıkları gece boyunca karıştırın. Ayrıca, burada gösterilen referansta açıklanan yöntemleri kullanarak PLGA kalsiyum nanopartiküllerini üretin. Bir miligram PLGA kalsiyum nanopartiküllerini veya 150 mikrogram kalsiyum silika nanopartiküllerini% 01 poli-l-lizin çözeltisi içinde, çözeltiyi bir dakika boyunca yukarı ve aşağı pipetleyerek suda karıştırın.
Sonra oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika inkübe etmesine izin verin. Daha sonra nanopartikülleri santrifüjleyin. Fazla poli-l-lizin süpernatantını çıkarın ve nanopartikülleri, hücre tipinin etiketlenmesi için uygun kültür ortamının bir mililitresinde yeniden süspanse edin.
Kültürdeki her bir milyon hücre için bir mililitre ortama 1 miligram etiketli nanopartikül ekleyin. Hücrelerin, nanopartiküllerin ve ortamın karışımını bir dakika boyunca iyice pipetleyin. Ve sonra karışımı yaklaşık 24 saat inkübe edin.
Etiketlendikten sonra, kök hücreleri ayırın ve hasat edin ve mikroakışkan işleme için mililitre başına 100.000 ila 1.000.000 hücre arasında bir konsantrasyona yeniden askıya alın. Aynı konsantrasyonda etiketli THP-1 hücrelerini kullanın. Mikroakışkan spiral cihazı imal etmek için önce standart mikrofabrikasyon tekniklerini kullanarak bir silikon gofret ana kalıbı hazırlayın.
Daha sonra, 30 gram baz PDMS prepolimerini ve üç gram sertleştirici maddeyi bir tartı teknesinde iyice karıştırın. Hava kabarcıklarını gidermek için karışımı 60 dakika vakum altında gazdan arındırın. PDMS karışımını, spiral kanal tasarımı ile desenlendirilmiş ana kalıba dikkatlice beş ila 10 milimetre yüksekliğe kadar dökün.
Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için karışımı 60 dakika boyunca gazdan arındırın. Tüm baloncuklar ortadan kalkana kadar bu işlemi tekrarlayın. Ardından, gofreti bir fırına koyun ve sabit bir cihaz yüksekliği sağlamak için kürleme sırasında gofretin eğilmediğinden emin olun.
PDMS'yi iki saat boyunca 80 santigrat derecede sertleştirin. Soğuduktan sonra, bir neşter kullanarak PDMS spiral cihazını kesin ve PDMS levhasını ana kalıptan dikkatlice soyun. Ardından, yapıştırma için pürüzsüz bir yüzey sağlamak üzere cihazın kenarlarını düzeltmek için bir neşter kullanın.
Ardından, girişler için iki delik ve çıkışlar için iki delik oluşturmak için 1,5 milimetrelik bir biyopsi zımbası kullanın. Kalıntıları temizlemek için cihazı izopropanol ile yıkayın. Ve cihazı 80 derecelik bir fırında beş dakika kurutun.
Ardından, PDMS cihazının alt yüzeyini ve bir cam sürgünün bir tarafını temizlemek için maskeleme bandı kullanın. Cam sürgüyü ve PDMS cihazını, temiz yüzeyleri açıkta kalacak şekilde bir plazma odasına dikkatlice yerleştirin. Plazma gücünü maksimuma getirin, haznenin rengi pembeye dönene kadar hazne basıncını düşürün ve bileşenleri 60 saniye boyunca maruz bırakın.
Ardından, sürgüyü ve PDMS cihazını hazneden çıkarın. Ve plazmaya maruz kalan yüzeyleri birbirine sıkıca bastırarak bunları birbirine bağlayın. İki yüzey arasında kabarcık sıkışmadığından emin olun.
Yapıştırılmış cihazı, bağı güçlendirmek için iki saat boyunca 80 santigrat dereceye ayarlanmış sıcak bir plaka üzerinde ısıtın. Girişler için 15 ila 20 santimetre uzunluğunda iki parça boru kesin ve her tüpün bir ucuna 23 gauge iğne takın. Ardından, çıkışlar için beş ila 10 santimetre uzunluğunda aynı borudan iki parça kesin ve bunları cihazın çıkış deliklerine takın.
Numuneyi çalıştırmadan önce, cihazı çıkış borusundan akana kadar %70 etanol içeren bir şırınga ile manuel olarak astarlayın. Etanolün sterilize edilmesi için cihazda en az 30 saniye kalmasına izin verin. Ardından, 60 mililitrelik bir şırıngaya %1 BSA ile 30 mililitre filtrelenmiş PBS yükleyin.
Ayrıca, üç mililitrelik etiketli hücreleri üç mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve her iki şırıngada da hava kabarcığı sıkışmadığını kontrol edin. Memeden birkaç damla sıvıyı nazikçe çıkararak hava kabarcıklarını çıkarın. Giriş şırınga uçlarını ve hortumunu şırıngalara bağlayın ve şırıngaları şırınga pompalarına sabitleyin.
Tüpleri cihazın ilgili girişlerine yerleştirin ve boru boyunca kabarcık olmadığından emin olun. Akışkanlar şimdi ayarlandıktan sonra, hücre sıralama işlemi sırasında gerçek zamanlı görüntüleme için cihazı ters çevrilmiş bir faz kontrast mikroskobuna monte edin. Mikroskop sahnesinde küçük bir atık kabı ve iki adet 15 mililitrelik tüpü cihaza yakın bir yere sabitleyin.
Cihazın her iki çıkışından gelen çıkış borusunu atık kabına yerleştirin. Şimdi, numune şırıngasının akış hızını dakikada 120 mikrolitreye ve kılıf şırıngasını dakikada 1.200 mikrolitreye ayarlayarak numunenin kılıf tamponuna akış oranını bir ila 10'a ayarlayın. Akış hızına denge şansı vermek için cihazı bir buçuk dakika çalıştırın.
Faz kontrastlı parlak alan altında kanal iç duvarının yakınında ataletsel olarak odaklanmış hücrelerin varlığını doğrulamak için yüksek hızlı bir kamera kullanın. Sabit durum akışı elde edildiğinde ve cihaz doğru şekilde çalıştığında, hücre çıkışından ve atık çıkışından ayrı eluentleri toplamak için çıkış tüplerini farklı şişelere yerleştirin. Bu cihaz, floresan silika nanopartiküllerden THP-1 monositik hücrelerin etiketli bir süspansiyonunu doğru bir şekilde sıralayabilir.
Hem yüksek hızlı görüntüleme hem de akış sitometrisi analizi ile doğrulandığı gibi yüksek ayırma verimlilikleri elde edildi. Tek adımlı saflaştırma stratejisi, santrifüjlemeye gerek kalmadan taze tampon çözeltisi içinde süspanse edilen etiketli bir süspansiyonun ve yapışkan hücrelerin sürekli olarak geri kazanılmasını sağlar. Cihaz, hem silika hem de PLGA nanopartikülleri ile yüksek verimli ayırma yeteneğine sahiptir ve aynı yüksek verimlilikle mililitrede 10 milyona kadar hücreyi ayırabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, hücreleri nanopartiküllerle nasıl etiketleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Ve özel mikroakışkan cihazımızı kullanarak fazla bağlanmamış parçacıkları çıkararak etiketli hücrelerin nasıl saflaştırılacağı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, mühendislik yapılmış hücrelerden serbest nanopartikülleri verimli bir şekilde ayırmak için tasarlanmış bir mikroakışkan arıtma teknolojisini açıklar. Yöntem, boyut esaslı ayırma sağlamak için eylemsiz mikroakışkan kullanır ve bu da onu rejeneratif tıpta özellikle yararlı kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikroakışkan
- Hücre Mühendisliği
- Nanopartikül Arıtma
Arka Plan
- Hücre mühendisliği genellikle nanopartikül kullanımını içerir.
- Bağlı olmayan nanopartiküllerin verimli bir şekilde çıkarılması, doğru sonuçlar için çok önemlidir.
- Bu teknoloji, hücrelerin yüksek verimli işlenmesine olanak tanır.
- Mikrolitre başına 10 milyon hücreye kadar konsantrasyonları işleyebilir.
Çalışmanın Amacı
- Rahat ve verimli bir arıtma yöntemi göstermek.
- Mühendislik yapılmış hücrelerin bağlı olmayan nanopartiküllerden ayrılmasını artırmak.
- Rejeneratif tıpta ilerlemeleri desteklemek.
Kullanılan Yöntemler
- Boyut esaslı ayırma için eylemsiz mikroakışkan.
- Diferansiyel eylemsiz odaklama için spiral mikro-cihaz.
- Yüksek verimli işleme kapasiteleri.
- Bağlı laboratuvarlardan araştırma personeli tarafından gösterildi.
Ana Sonuçlar
- Serbest nanopartiküllerden mühendislik yapılmış hücrelerin başarılı bir şekilde arıtılması.
- Büyük hücre hacimlerini işlemede verimlilik gösterildi.
- Mikroakışkan teknolojisinin etkinliği doğrulandı.
- Rejeneratif tıp ve hücre mühendisliğinde potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Mikroakışkan arıtma yöntemi etkili ve verimlidir.
- Bu teknoloji, hücre mühendisliği uygulamalarına önemli ölçüde yardımcı olabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, çeşitli biyomedikal alanlarda kullanımını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Unbound nanoparticles after cell labeling introduce background noise and off-target effects that compromise data integrity and therapeutic safety in nanoparticle-based cell engineering workflows. This microfluidic buffer exchange strategy enables high-throughput, size-based separation of labeled cells from free nanoparticles, supporting interference-free applications in regenerative medicine and cell therapy development. The approach addresses a critical purification bottleneck, improving predictive confidence in downstream functional assays and imaging applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of nanoparticle-labeled cells by removing confounding signals from unbound particles.
- Operational Value: Provides a centrifugation-free method for rapid purification of engineered cell populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers purified cell suspensions in fresh buffer for consistent, low-noise readouts in phenotypic and functional screening.
- Operational Value: Supports high-throughput processing at 106 cells/min, enabling scalable assay preparation for large-volume studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains phenotypic integrity of engineered THP-1 and MSCs during purification, supporting reliable preclinical evaluation.
- Operational Value: Facilitates transition from discovery to preclinical workflows by providing interference-free cell products for biodistribution and efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the nanoparticle cell engineering workflow post-labeling and pre-analysis, enabling clean transition to functional validation, imaging, or therapeutic testing stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by eliminating nanoparticle-derived background that could obscure true cellular responses.
- Screening: Ensures assay readiness through reproducible removal of unbound silica and PLGA nanoparticles (>95% depletion).
- Analytics: Enables quantitative flow cytometry and imaging with reduced false-positive signals from free dye or dye-loaded nanoparticles.
- Translational Research: Promotes continuity by delivering cells in fresh buffer suitable for in vivo tracking or mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Reusable spiral microfluidic device design allows standardization across cell types and nanoparticle formulations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by minimizing nanoparticle-induced artifacts in neighboring non-target cells.
- Operational Value: Achieves >90% cell recovery and >95% nanoparticle depletion in a single step, improving workflow efficiency.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling high-volume processing without multiple centrifugation cycles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by improving data reliability in lead identification and candidate selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication and operation, including PDMS bonding and syringe pump setup.
- Depends on access to spiral microchannel fabrication tools and high-speed imaging for validation.
- Necessitates standardization of flow rates (1:10 sample:sheath ratio) across teams for reproducible separation.
- Adaptation may be needed for varying cell sizes or nanoparticle types beyond silica and PLGA.
- Practical limitation: Device clogging risk at very high cell concentrations or with aggregates, requiring pre-filtration.
