Bir mikroakışkan Hassas Küçük hacimli Numune İşleme Platformu ve Akustik mikrocihazda Ayrı Biyolojik Parçacıklar Boyutu Kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, mikroakışkan fotik bir cihaz kullanarak otomatik küçük hacimli partikül ayrıştırmaları gerçekleştirmektir. Bu yöntem, biyoteknolojik tespit ve klinik araştırma uygulamaları için örneklerin sağlam bir şekilde işlenmesi ve ayrıştırılması da dahil olmak üzere, biyomedikal mühendisliği alanındaki temel prosedürlere olanak sağlayabilir. Bu tekniğin temel avantajları modülerlik, hassasiyet, dayanıklılık ve otomasyondur; bu özellikler onu yalnızca retiküler ayrıştırma için değil, çok çeşitli akışlı mikroakışkan ayrıştırma cihazları için de uyarlanabilir ve esnek hale getirir.

Öncelikle, analiz edilen maddenin önemli ölçüde seyreltilmesi veya kaybı olmadan, milimetre altı biyolojik örnek hacimlerinde rutin ve güvenilir bir şekilde ayırma işlemleri gerçekleştirebilme yeteneğine olan ihtiyaç belirlenmiştir. Örnek ölçümlemesinin ve kaynaktan toplama dosyalarına kadar olan otomatik yönlendirmenin, standart şırınga pompası işlemleriyle entegrasyonu, bu ölçekte başarılı bir şekilde çalışmak için kritik öneme sahiptir. Tasarıma başlamak için, beraberindeki metin protokolünün birinci bölümünde açıklandığı şekilde akustik retik cihazını ve iki fotoğraf maskesi için yerleşim planını tasarlayın.

Ardından, arka yüzey akışkan girişlerini çift tarafı parlatılmış 1 0 0 silikon gofret üzerine desenleyin. Standart pozitif rezist fotolitografi kullanarak, bu geometriyi derin reaktif iyon aşındırma ile 350 ila 400 mikrometre derinliğe kadar aşındırın. Sonra, gofreti ters çevirin ve ön yüzey akışkan kanalı geometrisini desenleyin.

Standart pozitif rezist fotolitografi yöntemini tekrar kullanarak, desenlenmiş gofreti ikinci bir boş silikon taşıyıcı gofrete monte edin. Fotorezist kullanarak, açıkta kalan kanalları 200 micrometers derinliğe kadar aşındırın. Derin reaktif iyon aşındırma yöntemini uygulayın ve ardından cihaz gofretini, boş silikon gofretten ayırmak için bir rezist sökme çözeltisinde bekletin.

Ardından, cihaz göferini ve özelliksiz 0,5 mm kalınlığındaki borosilikat cam göferi piranha çözeltisi kullanarak temizleyin. Temizleme işleminin ardından, burada gösterilen koşulları kullanarak cam ve silikon göferi iyonik olarak bağlayarak akış kanallarını mühürleyin. Son olarak, iki bileşenli düşük viskoziteli bir epoksi kiti ile dilimleme testeresi üzerindeki elmas bıçağı kullanarak münferit çipleri birbirinden kesin.

Her iki bileşenin önerilen oranlarını tartın ve iyice karıştırın. Ardından, kurşun zirkonat titanat veya PCT piezo seramiğini uygun bir sabitleme aparatına yerleştirin ve yaklaşık 10 µL epoksi karışımını, ince ve eşit bir tabaka oluşturacak şekilde üzerine yaymak için bir pipet kullanın. Sonrasında, çipi aparata yerleştirin ve piezo seramiğinin epoksi kaplı tarafını mikroakışkan çip ile hizalayın.

Hizalama sırasında çipi sabit tutmak için bantla tutturmak gerekebilir. Bileşenlerden herhangi birinin çatlamamasına dikkat ederek düzeneği bir mengeneye sabitleyin ve epoksi üreticisi tarafından önerilen sıcaklık ve sürede kürleyin. Epoksi kürlendikten sonra, piezo seramiğin her iki tarafına ince ayarlı tel uçlar bağlamak için ince uçlu bir havya kullanın.

Gerekirse, pizo yüzeyini hazırlamak için uygun lehim pastası kullanın. Termal depolarizasyonu önlemek için pizo ile mümkün olan en kısa süreli teması kurmaya özen gösterin. Çipi, sıkıştırma aparatları kullanarak akışkanlık deney tahtasına sabitleyin.

Ayrıca, akustik deneyler sırasında sıcaklığı düzenlemek için breadboard'a bir soğutma fanı takın. Ardından, çipi dünya konnektörlerine vidalayın. Breadboard'u mikroskop tablasına monte edin ve dünya-çip konnektörlerini giriş ve çıkışlardaki ek borulara bağlayın.

Standart quarter 28 dişli bağlantılar kullanılarak. 1/16 inçlik borularla, mikroakışkan çipi şırınga pompasına, bilgisayar kontrollü çok portlu seçim valflerine, PC arayüzlü akış ölçerlere ve borulara burada gösterildiği ve ekteki metin protokolünün dördüncü şeklinde açıklandığı şekilde bağlayın. Ayırmayı çalıştırmadan önce, temizleme reaktifi rezervuarlarını doldurun ve bunlara karşılık gelen sıvı hatlarını hazırlayın.

Ayrıca, çip çıkışlarındaki üç ve dört numaralı valfleri başlangıçta atık rezervuarlarına akacak şekilde ayarlayın. Ardından, soğutma fanını çalıştırın. Piezo seramik uçlarını güç amplifikatörüne bağlayın ve fonksiyon jeneratörünü kullanılan akustik çipin rezonans frekansına ayarlayın.

RF amplifikatörünün, istenen ayrıştırmaya uygun şekilde tepe değerden tepe değere 12 ile 25 volt arasında çıkış vermesi için fonksiyon jeneratöründeki voltaj ayar noktasını düzenleyin. Ardından, uygun toplama tüplerini ve tampon giriş tüpünü sisteme bağlayın. Ayrıştırılacak hücreler veya partiküller için uygun olan veya ayrıştırma sonrası kullanılacak analiz testi tarafından gerektirilen örnek tamponunu kullanın.

Ardından, kontrol yazılımını yükleyin ve tam otomatik hazırlama (prime) ve ayırma rutinini gerçekleştirmek için valfleri, akış sensörlerini ve pompayı kontrol etmek üzere bu yazılımı kullanın. Ayırma prosedürüne başlamadan hemen önce, çökmüş olabilecek partikülleri yeniden süspande etmek için numune şişesini kısa bir süre vorteksleyin. Alternatif olarak, vorteksleme ile hasar görmeye veya topaklanmaya daha yatkın olan biyolojik numuneleri karıştırmak için numuneyi pipetle 10 kez yukarı-aşağı çekin.

Ardından numune şişesini giriş hattına bağlayın ve vakit kaybetmeden hazırlama ve ayırma rutinini başlatın. Borularda sıvı bulunmadığından emin olmak için yazılımı kullanarak birinci ve ikinci valflerin hava girişlerini hazırlayarak başlayın. Eş zamanlı olarak, tampon giriş şişesini ikinci valfe ve numune giriş şişesini birinci valfe bağlayan boruları hazırlayın.

Şırınga pompasının, her iki şişeden yaklaşık 15 µL çekerek boru hattını tamamen doldurmasını sağlayın ve bunları valflere bağlayın. Son olarak, yükleme bobinine girmiş olabilecek fazla sıvıyı veya havayı tahliye etmek için bir ve iki numaralı valfleri atık konumuna getirin. Ardından, önce 50 µL/dk hızla 25 µL hava çekerek örnek bobinini dolduracak programı ayarlayın.

Ardından, 200 µL/dakika hızında 250 µL örnek, ardından 200 µL/dakika hızında 35 µL öncü tampon ve son olarak 50 µL/dakika hızında 25 µL hava yükleyin. Daha sonra şırınga pompalarını, yüklenen sıvı tıkaçlarını 100 µL/dakika hızında infüze edecek şekilde ayarlayın ve akış sensörlerini kullanarak küçük ve büyük partikül çıkışlarındaki akış hızlarını izleyin. Uygun akış oranı, ekteki metin protokolünde açıklandığı şekilde belirlenebilir.

Akış sensörleri, ilk hava boşluğunun geçişini belirten bir akış hızı artışı tespit ettiğinde, ilgili çıkış valfini atık tüpünden numune toplama tüpüne çevirin. Numune çip üzerinden geçerken ve ayrıştırılırken akışın stabil olduğundan akış sensörü okumalarını gözlemleyerek emin olun. Numune çipten geçerken, ayrıştırılan fraksiyonlar çıkış valflerinde toplanır.

Numune tıpasının sonunda akış sensörünü gözlemleyin ve ikinci hava boşluğunu tespit edin. Bu noktada, çıkış valflerini tekrar atık konumuna getirin. Tüm hacim boşaltıldıktan sonra, şırınga pompası infüzyonunu durdurun ve otomasyon rutini sonlandırın.

Ayırma deneyi tamamlandıktan sonra, küçük ve büyük partikül numune toplama tüplerini ayırın ve sonraki analizler için uygun şekilde saklayın. Tüplerden akıtılacak fazla temizleme çözeltilerini toplamak için numune alma tüpünü boş tüplere sabitleyin. Ardından, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde otomatik sistem temizleme rutinini başlatın.

Bu işlem sırasında program, tutma bobinine temizleme reaktiflerini sırayla yüklemek ve bunları sistem boyunca akıtmak için vanaları ve şırınga pompasını kontrol edecektir. Otomatik temizleme ve dekontaminasyon işlemi tamamlandığında, fazla yıkama solüsyonlarını ve bunların toplandığı vialleri, biyolojik veya kimyasal atıkların yönetimine ilişkin uygun prosedürleri izleyerek atın. Burada, iyi kenetlenmiş bir pizo ve mikroakışkan cihazdan alınan temsili bir frekans taraması gösterilmektedir.

Piezo ile mikroakışkan cihaz arasındaki kuplaj iyi olduğunda, parçacıklar rezonans frekansında sıkı bir şekilde odaklanır; bu da floresan yoğunluğunda net bir pike ve beklenen odaklama konumuna göçle sonuçlanır. Buna karşın, kuplajın zayıf olduğu durumlarda parçacıklar iyi odaklanmaz ve yüksek kaliteli odaklamanın veya hızlı akışın gerekli uygulama için kritik olduğu durumlarda cihaz uygun değildir. Bu grafikteki her bir çizgi, çeşitli polistiren parçacık boyutları ve piezo sürme voltajları kullanılarak elde edilen ayırma sonuçlarını temsil etmektedir.

Genel olarak, daha küçük parçacıkları ayırmak için daha yüksek voltajlar gereklidir. Ancak, daha fazla ısı yayılımı ve akustik akışın artan etkileri nedeniyle kuru voltajlar süresiz olarak artırılamaz. Bu platformun biyolojik parçacık ayırmadaki kullanışlılığını göstermek için, ortalama çapı 8 ila 10 µm olan insan raji hücrelerine yaklaşık 50 nm çapındaki dengue virüsü eklenmiş ve ardından akustik mikroakışkan cihaz kullanılarak ayrıştırılmıştır.

Bu tür bir sistem kurulup programlandığında, ayırmalar rutin olarak yaklaşık beş dakika içinde gerçekleştirilebilir. Örnekler arasında tam temizlik ve dekontaminasyon yapılarak saatte yaklaşık üç örnek işlenebilir. Ayrımın saflığını doğrulamak ve biyolojik önemi aydınlatmak için bu prosedürün ardından hücre sayımı, western blotting veya yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, tipik bir mikroakışkan ayırma cihazının nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Donanımla ara yüz oluşturmak için dünya-çip bağlantılarını kullanın ve otomatik bir ayırma prosedürünü hassas ve sağlam bir şekilde yürütün. Bulaşıcı materyallerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bunun yalnızca uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından, biyolojik güvenlik için kurum tarafından belirlenmiş uygun ekipman ve prosedürler kullanılarak gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.