Bir mikroakışkan Hassas Küçük hacimli Numune İşleme Platformu ve Akustik mikrocihazda Ayrı Biyolojik Parçacıklar Boyutu Kullanımı
23 Kasım 2015
Bu protokol, bir mikroakışkan cihaz kullanarak otomatik küçük hacimli (0,15–1,5 ml) parçacık ayırma işlemleri gerçekleştirmek için bir sistem mimarisini tanımlar ve akustoakışkan cihaz performansını ve çalışmasını optimize etme yöntemlerini tartışır.
Bu prosedürün genel amacı, bir mikroakışkan fotik cihaz kullanarak otomatik küçük hacimli parçacık ayırma işlemlerini gerçekleştirmektir. Bu yöntem, biyomedikal mühendisliği alanında, biyo tespit ve klinik araştırma uygulamaları için numunelerin sağlam bir şekilde işlenmesi ve ayrılması dahil olmak üzere temel prosedürleri mümkün kılabilir. Bu tekniğin ana avantajları modülerlik, hassasiyet, sağlamlık ve otomasyondur, bu da onu yalnızca retik ayırma için değil, aynı zamanda mikroakışkan ayırma cihazlarından çok çeşitli akışlar için uyarlanabilir ve esnek hale getirir.
İlk olarak, bu yeteneğin, önemli bir seyreltme veya analit kaybı olmadan milimetre altı biyolojik numune hacimlerinde rutin ve güvenilir bir şekilde ayırma işlemi gerçekleştirme ihtiyacını fark ettik. Standart şırınga pompası işlemleriyle birlikte numune ölçümü ve kaynaktan toplama dosyalarına otomatik yönlendirmenin entegrasyonu, bu ölçekte başarılı bir şekilde çalışmak için kritik öneme sahiptir. Başlamak için, akustik retic cihazını ve iki fotoğraf maskesinin düzenini, eşlik eden metin protokolünün birinci bölümünde açıklandığı gibi tasarlayın.
Ardından, arka taraftaki sıvı portlarını çift tarafı cilalı 1 0 0 silikon gofret üzerine desenleyin. Standart pozitif dirençli fotolitografi kullanarak: 350 ila 400 mikrometre derinliğe kadar derin reaktif iyon aşındırma kullanarak bu geometriyi aşındırın. Ardından, gofreti ters çevirin ve ön taraf sıvı kanalı geometrisini desenleyin.
Yine, standart pozitif dirençli fotolitografi kullanarak, desenli gofreti ikinci bir boş silikon taşıyıcı gofrete monte edin. Şimdi foto direnci kullanarak, maruz kalan kanalları 200 mikrometre derinliğe kadar aşındırın. Derin reaksiyon iyon aşındırma kullanarak, daha sonra cihaz gofretini boş silikon gofretten ayırmak için dirençli bir sıyırma solüsyonuna batırın.
Ardından, cihaz gofretini ve özelliksiz 0,5 milimetre kalınlığında boro silikat cam gofreti piranha solüsyonu kullanarak temizleyin. Temizledikten sonra, burada gösterilen koşulları kullanarak cam ve silikon gofreti iyonik olarak yapıştıran sıvı kanallarını kapatın. Son olarak, iki bileşenli düşük viskoziteli bir epoksi kitinden bir kesme testeresi üzerinde bir elmas bıçakla tek tek talaşları kesin.
Her iki bileşenin önerilen oranını tartın ve iyice karıştırın. Daha sonra kurşun Zirkin sekiz titanat veya PCT piezo seramiği uygun bir aparata yerleştirin ve ince bir eşit tabaka oluşturmak için yaklaşık 10 mikrolitre epoksi karışımını eşit olarak yaymak için bir pipet kullanın. Ardından, çipi aparatın içine yerleştirin ve pizo seramiğin epoksi tarafını mikroakışkan çip ile hizalayın.
Hizalama sırasında yerinde tutmak için çipi bantla yapıştırmak gerekebilir. Bileşenlerden herhangi birini çatlatmamaya ve epoksi üreticisi tarafından önerilen sıcaklık ve süreyi kürlememeye dikkat ederek düzeneği bir mengeneye sıkıştırın. Epoksi sertleştikten sonra, pizo seramiğin her iki tarafına ince tel uçları takmak için ince uçlu bir havya kullanın.
Gerekirse, pizo yüzeyini hazırlamak için uygun akıyı kullanın. Termal olarak depolarize olmasını önlemek için pizo ile mümkün olan en kısa teması kurmaya özen gösterin. Çipi, sıkıştırma fikstürlerini kullanarak akışkan bir devre tahtasına takın.
Ayrıca, akustik deneyler sırasında sıcaklığı düzenlemek için devre tahtasına bir soğutma fanı takın. Ardından, çipi dünya konektörlerine vidalayın. Breadboard'u mikroskop tablasına monte edin ve giriş ve çıkışlardaki ek borulara konektörleri çiplemek için dünyaya katılın.
Standart çeyrek 28 dişli rakor kullanma. Bir adet 16. inç boru için, mikroakışkan çipi şırınga pompasına, bilgisayar kontrollü çok seçim valflerine, PC arayüzlü akış ölçerlere ve burada gösterildiği gibi ve beraberindeki metin protokolünün dördüncü bölümünde açıklandığı gibi boruya bağlayın. Ayırma işlemini çalıştırmadan önce, temizleme reaktifi rezervuarlarını doldurun ve karşılık gelen sıvı hatlarını doldurun.
Ayrıca, başlangıçta atık rezervuarlarına akacak şekilde talaş çıkışlarına üç ve dört vana yerleştirin. Ardından, soğutma fanını açın. Pizo seramik uçları güce bağlayın amplifier ve fonksiyon üretecini kullanılmakta olan akustik çip için rezonans frekansına ayarlayın.
Fonksiyon üreteci üzerindeki voltaj ayar noktasını, RF amplifikatörü istenen ayırma için uygun şekilde 12 ila 25 volt tepeden tepeye çıkış yapacak şekilde ayarlayın. Ardından uygun toplama şişelerini ve tampon giriş şişesini sisteme bağlayın. Ayrılacak hücrelere veya partiküllere uygun numune tamponunu veya ayırma işleminden sonra kullanılacak analiz tahlilinin gerektirdiği şekilde kullanın.
Ardından, kontrol yazılımını yükleyin ve tam otomatik doldurma ve ayırma rutinini gerçekleştirmek için valfleri, akış sensörlerini ve pompayı kontrol etmek için kullanın. Ayırma prosedürüne başlamadan hemen önce, çökelmiş olabilecek partikülleri yeniden süspanse etmek için numune şişesini kısa bir süre vorteksleyin. Alternatif olarak, girdap yoluyla hasara veya topaklanmaya daha duyarlı biyolojik numuneleri karıştırmak için numuneyi 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
Ardından numune şişesini giriş hattına takın ve gecikmeden hazırlama ve ayırma rutinini başlatın. Borunun sıvı içermediğinden emin olmak için birinci ve ikinci valflerin hava girişini doldurmak için yazılımı kullanarak başlayın. Tampon giriş şişesini ikinci valfe ve numune giriş şişesini birinci valfe bağlayan boruyu aynı anda doldurun.
Şırınga pompasının, boruları tamamen doldurmak ve bunları valflere bağlamak için her iki şişeden yaklaşık 15 mikrolitre çekmesini sağlayın. Son olarak, yükleme bobinine giren fazla sıvıyı veya havayı dışarı atmak için birinci ve ikinci valfleri boşa çıkarın. Ardından, önce dakikada 50 mikrolitre hızında 25 mikrolitre hava çekerek numune bobinini yükleyecek programı ayarlayın.
Daha sonra dakikada 200 mikrolitrede 250 mikrolitre numune yükleyin, ardından dakikada 200 mikrolitrede 35 mikrolitre önde gelen tampon ve son olarak dakikada 50 mikrolitrede 25 mikrolitre hava daha yükleyin. Ardından şırınga pompalarını, yüklü sıvı tapalarını dakikada 100 mikrolitre olarak infüze edecek şekilde ayarlayın ve akış sensörlerini kullanarak küçük ve büyük partikül çıkışlarındaki akış hızlarını izleyin. Uygun akış oranı, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi belirlenebilir.
Akış sensörleri, ilk hava boşluğunun geçişini gösteren akış hızında bir artış tespit ettiğinde, ilgili çıkış valfini atık şişeden bir numune toplama şişesine geçirin. Numune çipten geçerken akışın sabit olduğundan ve akış sensörü okumalarını gözlemleyerek ayrıldığından emin olun. Numune çipten geçerken, ayrılan fraksiyonlar çıkış vanalarında toplanır.
Numune tapasının sonunda, akış sensörünü gözlemleyin, ikinci hava boşluğunu tespit edin. Bu noktada, çıkış valflerini tekrar boşa çıkarın. Tam hacim dağıtıldıktan sonra, şırınga pompası infüzyonunu durdurun ve otomasyon rutinini sonlandırın.
Ayırma deneyi tamamlandıktan sonra, küçük ve büyük partikül numune toplama şişelerinin bağlantısını kesin ve sonraki analizler için uygun şekilde saklayın. Tüplerden akıtılacak fazla temizleme solüsyonlarını toplamak için numune alma tüpünü boş şişelere sabitleyin. Ardından, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi otomatik sistem temizleme rutinini başlatın.
Bu işlem sırasında program, tutma bobinini temizleme reaktifleri ile sırayla yüklemek ve bunları sistemden geçirmek için valfleri ve şırınga pompasını kontrol edecektir. Otomatik temizleme ve dekontaminasyon işlemi tamamlandıktan sonra, biyolojik veya kimyasal atıkların işlenmesi için uygun prosedürleri izleyerek fazla yıkama solüsyonlarını ve toplandıkları şişeleri atın. Burada, iyi bağlanmış bir pizo ve mikroakışkan cihazdan temsili bir frekans taraması gösterilmektedir.
Pizo ve mikroakışkan cihaz arasındaki bağlantı iyi olduğunda, parçacıklar rezonans frekansına sıkıca odaklanır, bu da floresan yoğunluğunda net bir tepe noktası ve beklenen odaklama konumuna geçiş ile sonuçlanır. Buna karşılık, zayıf bağlantı parçacıklarının olduğu yerlerde iyi odaklanma olmaz ve gerekli uygulama için yüksek kaliteli odaklama veya hızlı akış kritik olduğunda cihaz uygun değildir. Bu grafikteki her çizgi, çeşitli polistiren partikül boyutları ve pizo sürüş voltajları kullanılarak yapılan ayırma sonuçlarını temsil eder.
Genel olarak, daha küçük parçacıkları çıkarmak için daha yüksek voltajlar gerekir. Bununla birlikte, daha fazla ısı dağılımı ve akustik akışın artan etkileri nedeniyle kuru voltajlar süresiz olarak artırılamaz. Bu platformun biyolojik parçacık ayrımı için faydasını göstermek için, ortalama sekiz ila 10 mikrometre çapındaki insan raji hücreleri, yaklaşık 50 nanometre çapa sahip dang virüsü ile çivilendi ve daha sonra akustik mikroakışkan cihaz kullanılarak ayrıldı.
Böyle bir sistem monte edildikten ve programlandıktan sonra, ayırma işlemleri rutin olarak yaklaşık beş dakika içinde gerçekleştirilebilir. Numuneler arasında tam temizlik ve dekontaminasyon ile saatte yaklaşık üç numune işlenebilir. Bu prosedürü takiben, ayırmanın saflığını doğrulamak ve biyolojik önemi aydınlatmak için hücre sayımı, western blotlama veya yeni nesil dizileme gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.
Bu videoyu izledikten sonra, tipik bir mikroakışkan ayırma cihazının nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Donanımla arayüz oluşturmak ve hassas ve sağlam bir şekilde otomatik bir ayırma prosedürü çalıştırmak için bağlantıları çiplemek için dünyayı kullanın. Bulaşıcı materyallerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve yalnızca biyolojik güvenlik için kurumsal olarak öngörülen uygun ekipman ve prosedürleri kullanan uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.
Genel Bakış
Bu protokol, bir mikroakışkan cihaz kullanarak küçük hacimli parçacık ayırmaların otomatikleştirilmesi için bir sistem mimarisini taslak halinde sunmaktadır. Akustofluidik cihazların performansını ve çalışmasını artırma yöntemlerini vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyomedikal Mühendisliği
- Mikroakışkanlar
- Parçacık Ayırma Teknikleri
Arka Plan
- Sub-milimetrik biyolojik örneklerin güvenilir şekilde ayrılması ihtiyacı.
- Seyreltme ve analit kaybının en aza indirilmesinin önemi.
- Numune ölçümü ve otomatik yönlendirmenin entegrasyonu.
- Verimlilik için standart şırınga pompası işlemlerinin kullanımı.
Çalışmanın Amacı
- Otomatik parçacık ayırmaları için bir yöntem geliştirmek.
- Mikroakışkan cihazların sağlamlığını ve hassasiyetini artırmak.
- Gelişmiş numune işleme yoluyla klinik araştırma uygulamalarını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Bir akustik retik cihazın tasarımı ve üretimi.
- Kanal geometrisi desenleme için fotolitografi.
- Akustik manipülasyon için piezo seramik entegrasyonu.
- Numune ayırma için sıvı sistemlerin otomatik kontrolü.
Ana Sonuçlar
- Otomatik parçacık ayırmasının başarılı uygulanması.
- Cihaz işlemindeki modülerliğin ve hassasiyetin gösterilmesi.
- Küçük numune hacimlerinin kayıpsız etkili şekilde işlenmesi.
- Yöntemin çeşitli mikroakışkan uygulamaları için doğrulanması.
Sonuçlar
- Geliştirilmiş protokol, parçacık ayırmalarının verimliliğini artırmaktadır.
- Akustofluidik cihazlar çeşitli uygulamalar için optimize edilebilir.
- Bu yöntem biyomedikal araştırmalarda ilerlemeyi destekler.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform enables precise, automated processing of small-volume biological samples (0.15–1.5 mL), reducing reagent waste and preserving precious analytes in early discovery workflows. By integrating modular device design with closed-loop fluid handling, it supports robust, reproducible particle separation—critical for target validation and assay development where sample integrity directly impacts data quality. The system’s adaptability to various microfluidic devices, including acoustofluidic chips, allows seamless integration into discovery pipelines requiring high-confidence, low-input separations for mechanistic de-risking and lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating specific biological particles (e.g., cells, viruses) from complex mixtures without significant dilution or loss.
- Operational Value: Supports functional target validation through precise size-based separation, clarifying pathway involvement and reducing mechanistic ambiguity in early-stage targets.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating reliable separation data that informs go/no-go decisions based on particle purity and yield.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological subsystems for downstream assays by concentrating target particles and removing interferents, improving signal-to-noise in detection assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via automated, closed-loop sample processing, priming, and cleaning cycles that minimize variability between runs.
- Scalability: Facilitates screening readiness through modular chip exchange and consistent world-to-chip connections, enabling platform reuse across multiple separation targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains sample integrity from discovery through preclinical validation by enabling concentration of rare biological particles (e.g., circulating cells, viral particles) for biomarker analysis.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports data-driven decisions by providing quantitative, reproducible separation outputs that correlate with biological relevance and reduce false positives in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: When applied to disease-relevant systems, helps isolate pathogenic particles to clarify mechanism of action and de-risk translational candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The platform integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical studies, particularly where low-volume, high-purity particle separation is required for downstream analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise isolation of biological particles (e.g., Raji cells, dengue virus) from heterogeneous samples.
- Screening: Delivers assay-ready samples through automated, reproducible fluid handling that ensures consistent particle separation and collection.
- Analytics: Generates quantitative outputs (e.g., flow rate spikes, particle fractionation) monitored via integrated flow sensors, enabling objective comparison of separation conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by concentrating low-abundance biological particles (e.g., viral particles spiked into cells) for subsequent validation via cell counting, Western blotting, or sequencing.
- Enterprise Reuse: Designed as a reusable capability—modular architecture allows rapid device exchange and standardized operation across teams and projects without re-optimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through precise, size-based particle separation.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability via automated priming, separation, and cleaning routines that ensure consistent performance across runs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling reliable, low-input separations that de-risk biological targets early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating high-fidelity separation data that informs advancement decisions based on particle purity and yield.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, photolithography, and acoustic transducer integration.
- Depends on instrumentation including syringe pumps, multiport valves, flow sensors, function generators, power amplifiers, and temperature control (cooling fan).
- Necessitates cross-team standardization of world-to-chip connections, fluidic tubing, and valve programming for reproducible operation.
- Involves adaptation considerations when applying to different biological systems (e.g., cell types, particle sizes) due to varying acoustic properties and optimal driving voltages.
- Practical limitations include thermal management during prolonged acoustic operation and the need for careful handling of piezo ceramics to avoid depolarization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Cleanroom Fabrication of Microfluidic Chips for Acoustophoresis
2:32
Piezo Transducer Attachement
3:51
Separation Procedure
8:26
Automated Cleaning and Decontamination
9:08
Results: Size Separation of Biological Particles Using an Acoustic Microdevice
10:24
Conclusion
