Name: Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde Chlamydomonas reinhardtii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Öğrenin Chlamydomonas reinhardtii'de yüksek verimli robotik destekli yöntemle sıcaklık duyarlı öldürücü mutant izolasyonunu. Bu teknik, ökaryotlarda temel hücresel işlevleri ve korunmuş genleri belirlemek için kapsamlı mutant koleksiyonları oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz tavsiye ve yararlı bir tartışma için Çapraz laboratuvar üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma PHS 5RO1-GM078153 tarafından ve tarafından desteklenen Michal Breker için Simons Vakfı Junior Fellow ödülü.

1. UV Mutajenez <ol><li> 9,10 orta Tris-Asetat-Fosfat (TAP) ile 200 dikdörtgen agar plaklarına - 100 toplu hazırlayın. Bir kaç gün kala bu tabak hazırlayın ve sonraki adımlarda asılı hücrelerin hızlı emilimini sağlamak için kuru bankta saklayın. </li><li> 25 ° C&#39;de ışık altında sıvı TAP, 100 ml ve 100 rpm&#39;de çalkalanarak, - kültür Chlamydomonas hücreleri kadar 0.2 ila 0.5 optik yoğunluk (~ 2 gün OD 750). Not: Mat- Hygro R (Higromisin B direnç veren) Mat + Paro R (paromomisin direnç kazandıran) UV mutagenez, iki genetik geçmişlerde, bağımsız olarak gerçekleştirilir. Antibiyotik seçimi iki çiftleşme tipleri tamamlayıcı ilaç dirençleri olması koşuluyla, keyfidir. </li><li> Hücreler uygun bir sağlıklı (yüzme ve bozulmamış) ve kirlenme olmadan sağlamak için mikroskop altında kültürlerin her birinin bir numunesi kontrol edin. NOT: Büyümüş kültürler &quot;çarpışma&quot; veFaz kontrast mikroskopi &quot;hayaletler&quot; olarak görünen, canlılığını kaybettiği. Onlar doygunluk ulaştıktan sonra giderek çalkalama kültürleri tutmayın. &quot;Hayalet&quot; fenomen adım 1.3 kolaylıkla saptanabilir. </li><li> 0.003 OD 750 kültür sulandırmak. suşu hareketli ve ışığa karşılık olarak yönlü olarak yüzer şekilde, homojen yoğunluk sağlamak için alüminyum folyo ile bir şişe sarın. <ol><li> 600 kurtulan koloniler plakalar (Şekil 1) oluşturacak - hücre öldürme için muhasebe, 200 böylece, planlı UV dozu dayalı süspansiyonun yoğunluğunu ayarlayın. UV ışınlarına maruz kalma süreleri ile ilgili bilgi için Tablo 1&#39;e bakınız. </li></ol></li><li> bulaşmasını önlemek için, üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir sıvı dozaj uygun bir küçük tüp kaseti takın ve sterilizasyon için bir dizi yıkama yapar. </li><li> Bir 8 x 12, sıvı dağıtıcı kullanarak, dikdörtgen plaka (Şekil 1 üzerine 2 ul, her 4 x 96 damla akıtın </strong&gt;). sıvı ince bir tabaka halinde tüm damlaların birleşmesini sağlamak ve hemen ışığa maruz kalmasını önlemek için plakaları kapsayacak şekilde plakanın kenarında hafif dokunun. <ol><li> Çok daha tek bir hücre yayılmasını sağlamak için, yukarıda belirtildiği gibi, kuru bir tabak kullanın ve hızlı bir şekilde ışığa karşılık olarak yüzme hücreleri bilmek plakaları kaplamak için. Tüm sıvı çekene kadar kapalı plakalar düzeyi ve karanlıkta saklayın. </li></ol></li><li> Hayatta kalanlar arasında TS-mutantların optimal verim elde deneysel olarak tespit zaman dönemleri için mikrop öldürücü, UV lambası (30 watt mikrop öldürücü UV tüp) altında tabak koyun. % 99.9 öldürme - 90 ile sonuçlandığı 50 cm - 40 arasında bir mesafede 1.5 dakika - Al, 0.5 kez kullanmak. 1000 UV kaynaklı nokta mutasyonları, bir ~% 10 değişmesi kodlama dizileri - Dul 100 içerir. <ol><li> Paketi hemen 11,12 bu aşamada karanlıkta çalışma tamir nedeniyle ışığa bağımlı DNA için bir çevirim UV ışıması maksimum etkisini temin etmek amacı ile,ışınlama sonrası bir siyah kutu içinde levha. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 24 saat - 8 karanlıkta plakaları tutun. </li><li> koloniler oluşturmak için aydınlatma ile 21 ° C inkübatör tabak koyun. Koloni oluşumu 10 gün ~ alır. Sıvı yoğunlaşmasını kadar örtecek plastik torba ile plakaları sarın ve iç emici kağıt eklemek emin olun. kirleticilerin plakaları girmek için buharlaşma ve yoğuşma döngüleri aksi sıvı film yolları sağlayabilir. </li><li> Robotik koloni toplama (Şekil 2) için kaynaklar gibi ilgili yığınlar halinde tabak yerleştirin. dikdörtgen plakalar üzerinde 384 dizileri için koloniler seçin ve aydınlatma (~ 1 hafta) ile 21 ° C&#39;de onları büyümek. </li><li> Bir 1.536-dizileri (4: 1) yoluyla 384 diziler yoğunlaşır çoğaltma kaplama robot kullanılarak (Şekil 3) ve plakalar, 21 ° C kuluçka makinesi içinde ~ 3 gün boyunca büyümeye izin verir. </li><li> Her iki plakalara 1536-diziler çoğaltmak ve (21 ° C inkübatör keyfi bir yersıcaklığı) ve 33 ° C inkübatör (kısıtlayıcı ısısında). 24 saat sonra, önceden ısıtılmış plakaları yeni bir dizi için 33 ° C plakaları çoğaltmak ve 33 ° C inkübatör koyun. NOT: Bu ikincil kaplama nedeni hücreleri kaplama sonrası ilk hücre döngüsünün tutuklandı olsa bile, o ölümcül mutantlar bazı durumlarda önemli biyokütle birikir içinde can ts olduğunu. İkincil çoğaltma bu sinyali ortadan kaldırır ve büyük ölçüde duyarlılığı artırır. </li><li> 33 ° C&#39;de büyüme 3 gün 21 ° C&#39;de büyüme 5 gün sonra, bir dijital kamera ile plakalar fotoğrafı. Sabit bir çerçeveye plakaları tutun. Kültür plakaları (Şekil 4) ile birlikte fotoğraflandı dokuz hizalama göstergeleri ile işaretlenmiş bir &quot;grid plaka&quot; kullanın. alternatif olarak fotoğraf kültür plakaları 21 ° C ve 33 ° C (21/33) görüntüleri eşleştirilmiş. NOT: vahşi tip önemli ölçüde büyür beri farklı inkübasyon süreleri büyümeyi dengelemek için kullanılırhızlı 33 ° C&#39;de 21 ° C de daha. </li></ol> ts Mutant Adayların 2. Kimlik: İlk Ekran <ol><li> Bir 1536-diziye arka plan ve segmente görüntüleri ortadan kaldırmak için özel bir Matlab görüntü analiz yazılımı ile eşleştirilmiş 21/33 plakalı görüntüleri işlemek. Program her pozisyon (Şekil 5) tespit biyokütle (toplam piksel yoğunluğu) belirleyecektir. NOT: (yönergelerle birlikte SI sağlanan) yazılımı kullanılan büyütme ve plaka şeklinde yayılıyor bir 1536-dizideki hücrelerin yerleri (bireysel girişleri) tespit etmek ve her hücrede toplam piksel yoğunluğunu hesaplamak için ızgara plakası resim kullanacağız . Mut (S (Mut 33) / S (WT 33) / S: Her mutant için bu değerler daha sonra ts + standart ve sıcaklık duyarlılık derecesi 21 ° C nispetle gerekli büyümeyi belirlemek için ayarlanabilir parametreleri ile karşılaştırılarak, olarak tanımlanır 21) / S (WT 21), S sinyali (piksel olduğuArka plan çıkarma sonra tensit), Mut bireysel mutant olduğunu ve &quot;WT&quot; rasgele seçilen olmayan ısıya duyarlı koloni ts + fenotip vardı (mutagenized suş) &#39;dir. 21 ° C de büyüme S (Mut 21) / S (WT 21) olarak tanımlanır. bu ilk ekranda, yalancı negatiflik oranı düşük tutmak için (21 ° C&#39;de nispeten düşük büyüme ve sıcaklık hassasiyeti nispeten düşük düzeyde izin) rahat seçim kriterlerini uygulamak. </li><li> (Tipik bir 384-diziye) robotik toplama tek koloni için bir talimat dosyası olarak yazılım tarafından oluşturulan seçilen kolonilerin listesini yükleyin. Robotik talimatlara göre kaynak ve hedef tabak hazırlayın ve diziye koloniler (Şekil 6) seçin. NOT: Geleneksel toplayıcılar gibi .csv, .txt veya .xls gibi bazı biçimde bir talimat dosyası gerektirir. Tüm toplayıcıları dosya odaklı olmak kapasitesine sahip olacak; farklı biçimleri MATLAB kodu (sağlanan kaynak kodu) küçük düzenleme gerektirir. </li&gt; <li> ~ 5 gün stok plaka büyümek için 21 ° C inkübatör hedef tabak yerleştirin. </li></ol> 3. ts Mutants belirlenmesi: İkinci Ekran <ol><li> Adımı yineleyin 2.1 picked koloniler yeniden test etmek. Genellikle 30 - UV mutagenezi kalan ilk koloniler göre% 5 ts öldürücü - kolonilerin% 50% 2&#39;lik bir verim için, net ts öldürücü tekrar test edecektir. </li><li> Tekrarlayın iki ekranlı ts öldürücü toplamak için adım 2.2, ancak 384 yoğunlukta dikdörtgen plakalar üzerinde 100 koloni bloklar halinde dizi koloniler için tasarlanmış bir modifiye talimat dosyası ile. Bu, sonraki aşamada uygun bir mikroskopik inceleme için. talimat dosya biçimi MATLAB kodu ile zamanında belirlenir. </li><li> Bir kontrol olarak birkaç WT koloniler dahil ve ~ 5 gün süreyle 21 ° C&#39;de plakaları yerleştirmek için emin olun. </li></ol> 4. İlk Fenotip belirlenmesi <ol><li> Aşama 3.2 dizilmiş 100 Plakaları, çoğaltma ve 21 ° C incu koyunbatör 2 ~ için gün taze büyüyen koloniler elde etmek. </li><li> üç nüsha 100-blok plakaları (4.1) yeni bir kopyasını çoğaltırlar. kontrol grubu olarak 33 ° C inkübatör bir 21 ° C inkübatör kopya ve bir koyun. </li><li> Bir robot kurulum üçüncü kopya ( &quot;plakaları tarama&quot;) koyun ve uzun iğneler steril su ile dokundu ile koloniler nokta. NOT: agar tutturulmuş Chlamydomonas hücreleri robot mikroskobik muayene için kullanılabilir birkaç tek hücreler ile hücre oldukça yoğun nokta olarak başlangıçta karaya eğilimindedir. Mikroskobik muayene için koloniler optimize bir damla su ile başlangıçta transfer hücreleri nokta (robotik uzun pimleri tarafından aktarılan suyun hacmi ~ 100 nl). Bu, pek çok izole edilmiş tek hücreler ile ilk sabitleme merkezi etrafında küçük bir yarıçap (~ 1 mm) hücre dispersiyon ile sonuçlanır. </li><li> 0 zamanda eleme plakalarının her nokta bir bölgenin fotomikrografları al (tek ise hala, bölünmemiş hücre) (Şekil 7) ve kuluçka 33 ° C&#39;de plakalar yerleştirin. 384 yoğunluklu dizinin 4.5 mm merkez-merkez aralığında durur vermek için ayarlanır değiştirilmiş dörtlü diseksiyon mikroskobu manuel kademe kontrol görüntü konumunu belirler. </li><li> 33 ° C inkübatör eleme tabakalarını çıkarın ve çeşitli zaman noktalarında, Aşama 4.4 gibi, (10 saat, 20 saat, 48 saat) fotomikrograflarıdır alır. sahne, plaka tutucu ve sahne denetleyicisi emin olun tam her zaman noktasında aynı hücrelerin görüntüleri almak için kalibre edilir. Hızlı fotomikrograf satın alma (~ 10 dk) gerçekleştirin. </li><li> ts fenotip doğrulamak ve görüntü alımı sırasında sıcaklık dalgalanmaları ts fenotip üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğundan emin olmak için 33 ° C inkübatör ikinci bir kopyasını kullanın. <ol><li> Mikroskobik görüntüleri analiz ve istenilen kriterlere göre mutantlar (Şekil 8) için seçin. 96-dizilmiş agar plaka final seçilen set nokta. Emin olun herplaka, aynı çiftleşme tipi ve ilaç direnci mutantlar içerir. </li><li> Her plaka için, son iki sütunu pozitif (sorgu mutasyon) ve tamamlama testi için negatif (WT) kontrol dahil edilmiştir. </li></ol></li></ol> Yeni Mutants 5. tamamlama ve Bağlantı Testi için &quot;Sık Flyers&quot; <ol><li> Azot içermeyen gamet indüksiyon ortamı 10 dizilmiş kolonilerin büyük miktarlarda 96 oyuklu (her koloninin yoğunluğu yaklaşık 0.2 OD olmalıdır) mikro. Gametogenezis izin ~ 5 saat - (20 W cıva ampul 13) ışık altında inkübe edin. Not: Bu adım, basit bir kaplama cihazı ile bir kopyalayan robot kurulum veya manuel ile ya yapılabilir. </li><li> Gametogenez için azot içermeyen gamet-indüksiyon ortamı 10 ile tüplere alternatif direnç kasetleri barındıran ters çiftleşme tipleri ile sorguları Askıya. </li><li> Bir eşleşme mikst bir hedef levha örnekleri karıştırın20 ul (Şekil 9) ve ure hacmi. Aşağıdaki ~ ışığı altında 10 dakika, her bir kuyunun iki spot 5 ul: Bir kez bağlantı testi için TAP plaka üzerinde ve bir kez tamamlama testi için TAP + 5 mcM Paro + 9 uM Higro üzerinde. </li><li> bir gecede 21 ° C inkübatör bağlantı plakaları inkübe ve ardından folyo ile sarın. zygospore oluşumuna izin vermek için 5 gün süreyle karanlıkta tutun. </li><li> 21 ° C de bir ışık 10 gün ~ için tamamlama testi inkübe edin. NOT: ilaç miktarları çifte heterozigot diploidlerin hayatta izin kalibre, ama onlar hala çiftleşme haploidler ortadan kaldırmak için yeterli olan. Bu miktarlar, bu özel projede kullanılan standart direnç kaset entegrasyonları için kalibre edildi; yeni entegrasyonlar ile, dozları tekrar kalibre edilmelidir. Çoğu biyokütle, akış sitometri (Şekil 9) tarafından diploitler olarak doğrulanmış olmasına rağmen muhtemelen mayoz ve iki kat dayanıklı büyümesinden haploidlerden (değişken düzeyiayırımlarındaki), genellikle de görülmektedir. </li><li> TS-fenotip tanımlaması için iki nüsha halinde tamamlama-test plakaları çoğaltırlar. ~ 5 gün boyunca 33 ° C&#39;de 21 ° C de bir kopya ve bir kopyasını koyun. </li><li> TS-fenotip için test koloniler, bu bölümde 2.1 (Şekil 5) tarif edilmiştir. sorgusu ile tamamlayan olmayan koloniler muhtemel sorgu (aynı gen mutasyonları için hetero-alelik diploidlerin) aynı genin allel temsil etmektedir. </li><li> bağlantı testi için adım 5.4 aşağıdaki ~ 7 gün boyunca mayoz ve haploid ayırımlarındaki ve büyümesine izin ışığa geri plakaları kaydırır. </li><li> (Kasetler bağlantısız olduğundan, haploid döl% 25&#39;i olarak tahmin) çift dayanıklı yavrularıyla için seçin ve bir hafta boyunca 21 ° C&#39;de inkübe TAP + 10 uM Paro ve 10 uM Higro için bağlantı test plakaları çoğaltırlar. NOT: iki kat dayanıklı haploidlerden ilaç dozunu artırın. </li><li> Deney koloniler TS-fenotip, in 2.1 adım. NOT: TS-fenotip sorgusu ile aynı tamamlama grubu mutantlar için beklenen (ve gözlemlenen gibi). Buna ek olarak, bağlantı deneyinde bir TS-fenotip, sorgu tamamlayan bir mutant için, sorgu ve yeni mutasyon arasındaki sıkı bağlantıyı yansıtabilir. Test sorguları tamamlayan mutantlar daha fenotipik analiz için sonuçta etken lezyonun biyoinformatik tanımlama için boru hattı girin ve olasıdır yeni genler bulunmaktadır. </li></ol>

<ol><li>Tulin, F., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microbial+avenue+to+cell+cycle+control+in+the+plant+superkingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A microbial avenue to cell cycle control in the plant superkingdom.</a> Plant Cell. 26, 4019-4038 (2014).</li>
<li>Cross, F. R., Umen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas cell cycle.</a> Plant J. 82, 370-392 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Indexed%2C+Mapped+Mutant+Library+Enables+Reverse+Genetics+Studies+of+Biological+Processes+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Indexed, Mapped Mutant Library Enables Reverse Genetics Studies of Biological Processes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Cell. 28, 367-387 (2016).</li>
<li>Tulin, F., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-Dependent+Kinase+Regulation+of+Diurnal+Transcription+in+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclin-Dependent Kinase Regulation of Diurnal Transcription in Chlamydomonas.</a> Plant Cell. 27, 2727-2742 (2015).</li>
<li>Simchen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell cycle mutants.</a> Annu. Rev. Genet. 12, 161-191 (1978).</li>
<li>Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+the+cell-division+cycle+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Detection+of+mutants.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genetic control of the cell-division cycle in yeast.</a> I. Detection of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 66, 352-359 (1970).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat. Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li>
<li>Ben-Aroya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+temperature-sensitive+mutant+repository+of+the+essential+genes+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell. 30, 248-258 (2008).</li>
<li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarris%2C+E+%22The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+into+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%22">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction into Chlamydomonas and Its Laboratory Use</a>. , Elsevier Academic Press. (2008).</li>
<li>Dutcher, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+and+tetrad+analysis+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mating and tetrad analysis in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Methods Cell Biol. 47, 531-540 (1995).</li>
<li>Gill, S. S., Anjum, N. A., Gill, R., Jha, M., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+repair+in+plants+under+ultraviolet+and+ionizing+radiations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+World+J%22%5BJournal%5D)">DNA damage and repair in plants under ultraviolet and ionizing radiations.</a> Sci World J. 2015, 250158(2015).</li>
<li>Liu, Z., Wang, L., Zhong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+mechanisms+of+DNA+repair+by+photolyase%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Chem.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Dynamics and mechanisms of DNA repair by photolyase.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 11933-11949 (2015).</li>
<li>Francis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+and+plant+development.+Annual+Plant+Reviews%2C+Volume+32%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control and plant development. Annual Plant Reviews, Volume 32.</a> Ann. Bot. 101, 1049-1050 (2008).</li>
<li>Zachariae, W., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+end+is+destruction%3A+cell+division+and+the+anaphase-promoting+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex.</a> Genes Dev. 13, 2039-2058 (1999).</li>
<li>Merchant, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+genome+reveals+the+evolution+of+key+animal+and+plant+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions.</a> Science. 318, 245-250 (2007).</li>
<li>Ben-Aroya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+temperature-sensitive+mutant+repository+of+the+essential+genes+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. 30, 248-258 (2008).</li>
<li>Mnaimneh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+essential+gene+functions+via+titratable+promoter+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles.</a> Cell. 118, 31-44 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li>
<li>Jiang, W., Brueggeman, A. J., Horken, K. M., Plucinak, T. M., Weeks, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryot. Cell. 13, 1465-1469 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar önemli mali çıkarlarının beyan ederim.

ts öldürücü mutantların yüksek verim izolasyonu için burada açıklanan boru hattı Chlamydomonas genomunun muhtemelen tüm hücresel-temel yollar temsil edilmesini sağlar. Potansiyel hücre döngüsü genlerinin verimli bir şekilde toplanması ve tekrarlayan &quot;sık uçan&quot; allellerin ortadan kaldırılması için iki en kritik adımlar şunlardır: eksik hücre döngüsü ve 2) zaten tanımlanan karşı paralel tamamlama testi için tutuklama fenotip özelliklerinin 1) tutarlı tanım yeni izole olanlarla koleksiyonu büyütmek için genleri sorgular. Işık-karanlık döngüleri ile senkronize olduğunda, Chlamydomonas herhangi bir DNA replikasyonu veya hücre bölünmesi 13 olmadan gündüz saatleri ve hücre boyutu&gt; 10x artışlar sırasında fotosentetik büyür. Gece başlangıcından yaklaşık tesadüf hücreler daha sonra DNA replikasyonu, mitoz ve hücre bölünmesi (Şekil 8) alternatif defalarca tekrarlayabilir. Bu düzenleyici şematiktirE, öncelikle hücre büyümesi ve bütünlük ve hücre bölünmesi döngüsü için özel olarak gerekli olan genler için gerekli genler arasında doğal bir ayrım sağlar. Biz 10 saat ve 20 saatlik zaman noktaları bir başlangıç kaba fenotipik 1 kesmek için çok bilgilendirici bulundu. Bu görüntülere dayanan şu anda tanımak ts öldürücü mutantlar, geniş sınıfları 1 (Tulin ve Cross, 2014 SI bakınız) şunlardır: Notch, Popcorn, Yuvarlak, Küçük, Orta, erken lizis ve çoklu-çevrim (Şekil 8 ). Biz odaklanmak üç en alakalı kategoriler Notch, Patlamış mısır ve Yuvarlak vardır. &quot;Çentik&quot; ve &quot;patlamış mısır&quot; fenotipleri çoğu hücre döngüsü spesifik lezyonları için daha önce gösterilen (örn, mitotik sikline bağlı kinaz, DNA replikasyon makine ve topoizomeraz II); 1. biri (Notch) ya da çoklu görünüm (Popcorn) başlangıç ​​ama başarısız hücre bölünmesinin belirgin uçakları uygun bir morfolin olduğunuHücre döngüsü inisiyasyon ogical göstergesi. Bu mutantlar, genel olarak 10 saat gösterirken WT benzer hücre hacmindeki artışlar, çok az veya hiç bir büyüme kusurlar sergilerler. Notch ve Popcorn fenotipleri 10 saatte belirgindir ve tam 20 saat ile (sıklıkla hücre parçalama ile ilişkili) geliştirilmiştir. &quot;Yuvarlak&quot; hücreler, böylece büyük, yuvarlak tutuklandı hücreleri verimli, WT ama belirgin başlangıç ​​bölümü uçaklarının çok azaltılmış üretimi ile benzer büyür. Bu kategoride önceki mutantlar mikrotübül fonksiyonu (tübülin-katlama kofaktör, gama-tubulin halka kompleks) 1 için gerekli anafaz-teşvik 14 karmaşık ya da genlerin bileşenlerine düşmüş. Daha sonra zaman zaman, bu hücreler sıklıkla belirgin hücre parçalama sergilerler. &quot;Küçük&quot; ve &quot;Orta&quot; hücreleri WT (Orta) daha ihmal edilebilir (Küçük) ya da daha az ya da büyür. Bugüne kadar belirlenen bu mutantların birçok ek açıklamalar temel cellula rol önermek genlerdeki lezyonları varr büyüme süreçleri (çeviri veya zar biyogenezi). (:;: Azaltılmış Orta WT gibi Yuvarlak) Orta ve Yuvarlak arasındaki ana mikroskobik ayrımcılık 10 saatte büyüme miktarına dayanmaktadır. Küçük ve Orta Ölçekli kategoriler oldukça büyük ve muhtemelen hücresel yolların büyük bir aralıkta lezyonları yansıtan, çünkü biz bu kategorileri doyurmak için çalışırken değildir; Ancak, farklı yollardaki kaybı fenotipleri anlamak için sınıfın temsilcilerini belirlemek moleküler yönden istiyoruz. İki çalışılmamış kategoriler şunlardır: 1) Erken parçalama önce hücre büyümesinin çok az kanıt ve 2) çoklu döngüleri ile, 10 saat işareti ile yeşil renk (kaybı, refraktilitesi kaybı) bütünlüğünü kaybeder mutantlar. Hücreler, daha uzun vadeli bir proliferasyonunu gerçekleştirmek için tam bir yetersizlik sergiler ama, 10 ve 20 saat sonra ağırlıkla benzer çoğalır. Biz çoğunlukla, hem de küçük ve orta yuvarlak hücreler &quot;çentik&quot;, &quot;patlamış mısır&quot; ve &quot;yuvarlak&quot; karakterize ve dışarıda olanolarak sızdıran mutantlar bu tam kaç hücre bölünmeleri. Bu, büyüme ve membran bütünlüğünün, gibi temel hücresel özellikleri, fonksiyonel olmasını sağlamak ve bölünme ile ilgili genler için olasılığını zenginleştirmek için esas olduğunu. Bu yaklaşım, deneysel olarak etkili olduğu bulunmuştur; Ancak, bir hücre döngüsü gen gerçek bölünmeden önce, pleiotropik ve önceki G1 ek rolleri vardır olabilir. biz nadir olmasını bekliyoruz Bu gibi durumlarda, cevapsız. Daha genel olarak, biz yüksek olasılık tamamen işlevsiz proteindir nedeniyle bir etken mutasyon homojen tutuklama, hedefliyoruz. Bununla birlikte, aşağıda açıklanan aynı nedenden dolayı, çok sayıda tutuklama noktalar ve bu nedenle, bazı esnekliğin adayları seçmek tavsiye edilir. yeni tanımlanan genlerle koleksiyonunu zenginleştirmek amacıyla, seçilen adaylar tamamlama için deneye tabi tutulur. Biz pozitif kontrol negatif kontrol (sorgu mutasyon karşı sorgu) ve ts + TS-gerektirir (querWT karşı Y). sorguda aynı tamamlama grubu yeni mutantlar TS- vardır. Aynı tamamlama grubuna üyelik neredeyse kaçınılmaz aynı genin moleküler lezyon (bu test ettik her tür gen için böyle olmuştur) yansıtır. Bu nedenle, için &quot;sık sık el ilanları,&quot; Bu kriter daha karakterizasyon için dışlayıcı olduğunu. Test sorgular aynı tamamlama grupları değildi mutantlar yeni genlerin için aday olan ve daha fazla biyoinformatik ve deneysel araçları ile karakterizedir. Farklı tamamlama gruplarına TS-allellerinin yüksek değişkenliğe sahip kurtarma iyi bilinen bir olgudur-olan değişkenlik nedeniyle, farklı genler arasındaki TS- için mutability büyük içsel değişkenlik, Poisson gürültü belirgin derecede daha yüksektir olmasıdır. içsel thermolability farklılıkları içerebilir Nedenler; farklı protein boyutları; Büyük bir şekilde, karmaşık bir stabilize karşı bir monomer gibi bir proteinin varlığı; ve mutajenik sıcak noktalar. Bu neredeyse saf nuisa olduğununce. Ancak, bir ortaya çıkan olumlu sonuç &quot;sık uçan&quot; listesi (listenin en işgal yalnızca birkaç hedeflerle) uzun değil, bu yüzden emek-yoğun tamamlama testi projenin ileriki aşamalarında kadar büyük bir girişim değil olmasıdır. tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, biz bir bağlantı testi uygulandı. Bu deneyde, iki dayanıklı yavrularıyla seçilir ve TS- fenotipi için test edilir. Bir TS-fenotip beklenen (ve gözlenen) sorgusu ya da sıkıca bağlı mutasyonlar için aynı tamamlama grubu mutantlar için bir. Test edilen genlerin her biri için, bir WT döl genetik mesafeye bağlı olarak belli bir olasılık (ts + fenotip) çıkması bekleniyor. Biz bu noktalar her çiftleşme için yaklaşık 100 zygospores olduğunu tahmin ediyoruz. % 100 öz değişmesine ait başarı ile, bu durum, M bağlantısız ilaç direnci kasetleri yaklaşık 100 çift ilaca dirençli soyun (öz değişmesine ait döl% 25, ​​mayoz başına dört sonuçlanacaktırendelian miras). Bu aynı zamanda döllerinde% 25&#39;i çift mutant olacak TS- mutasyonlar için durumda olacağını ve sorgu ve test mutasyonları bağlantısız ise% 25 WT olacaktır. Bu nedenle, çift-ilaca dirençli döl üzerinden, ağırlıkça% 25 (yaklaşık 25 hücre) olacaktır. Bu tamamen bağlantısız mutasyonlar için de geçerlidir; Ancak, orta bağlantı (~ 20 cm, yaklaşık 2 Mb, ya da genom 115% 2 içinde) şiddetle azaltmak veya ts + sinyali ortadan kaldıracaktır. Antibiyotik kaseti test mutasyonun bağlanması durumunda, çift ilaca dirençli + haploids TS çok düşük miktarlarda mevcut bulunmaktadır. Bu, tüm mutantlar kaydetti kolayca bir anormal bir sonuç test tamamlayan rağmen, test edilen tüm mutantlar ile recombine açıkça başarısızlık olarak ortaya çıkar; Bu gibi durumlarda, geriye melezleme sorunu çözecektir. Önceki bilgileri ve dizi analizi, her ikisi de mo birlikte, Chlamydomonas hücre döngüsü genlerinin 500 genler 2 olmasını bekliyoruzst, ama muhtemelen hepsi değil, esastır. Biz başka bir mutasyon tur için gerekliliğini daha fazla mutantlar toplanır olarak ve doygunluk yükselir düzeyini değerlendirecek. Bu prosedür benzersiz temel biyolojik süreçleri ve bunları yürütmek genleri ve proteinleri çalışmak için tasarlanmıştır. Diğer yöntemler temel genlerdeki tedirginlikler var oluşturmak için (örneğin, rastgele mutagenized alellerin 16, koşullu transkripsiyonu alellerin 17 veya hypomorphic allellerin 18 dönüşüm). Bununla birlikte, tüm kuvvetli bitkisel Chlamydomonas bastırılır homolog rekombinasyonu gerektirir. Kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromic tekrar (CRISPR) / Cas9 sistem gen modifikasyonu 19 için güçlü bir araç olarak kurulmuştur; Ancak, Chlamydomonas 20 verimli çalışmasını henüz. Kritik, bu yöntemlerin hepsi hedefin ön bilgi gerektirir. Bu ciddi bir kısıtlama olduğunuyeni bir şeyler öğrenmek olanağına sahip olmak isterse! Bizim yaklaşım herhangi bir ön bilgi bağımsız temel genleri tanımlama mutasyonları verecektir. Bu nedenle, teknolojinin bugünkü düzeyinde, derin sıralama ile gen tanımlama ardından rastgele ts mutasyonların izolasyon bitki superkingdom mikrobiyal hücre biyolojisi içine hızlı bir giriş kazanmanın en etkili yöntem olabilir. neden olan mutasyonların tanımlanması bu yazının kapsamı dışındadır (kodlama-dizi-değişen her klon mutasyonlar 100 ~ arasından). Hacimli segregant havuzlar 1 derin sıralama etkili ama emek-yoğundur. suşu çok sayıda Tüm mutasyonlar belirlenmesi için bir birleştirici havuzu strateji, havuzları az sayıda sekanslanması sonra çok maliyet ve emek etkilidir. kombinatoryal bulked segregant dizileme için yeni bir strateji sim mutantlar onlarca yol açan mutasyonların belirlenmesi sağlayacak geliştirme aşamasındadır(Hazırlık aşamasında) tek bir sıralama vadede ultaneously. Bu verimlilik kritik gen tanımlama adımı burada anlatılan prosedürler ile mümkün olmaktadır mutantlar çok hızlı birikimi ayak uydurmak için izin için çok önemlidir.

model organizmaların sistematik mutant koleksiyonları Fenotipik karakterizasyonu hücresel karmaşıklığı diseksiyon için kanıtlanmış bir yaklaşımdır. Haploid tek hücreli yeşil algler chlamydomonas reinhardtii bir bitki gibi gen kümesi vardır, ancak arazi bitki soyu 2 çoklu genom duplications önce kara bitkileri uzaklaşmıştır. Prensip olarak, gen çoğaltılması ve özellikle haploid yaşam döngüsü eksikliği büyük ölçüde zarar fonksiyon-genetik yaklaşımlar kolaylaştırır. Bununla birlikte, ilgi konusu gen, hedeflenen bozulma nedeniyle verimli homolog genomik entegrasyon eksikliği neredeyse imkansızdır. Bir rastgele sokma bozulması kütüphane bugüne kadar 1.562 genleri 3 temsil 1,935 eşlenen kesintileri bir dizilmiş bir dizi verimli kesintiye sitenin tanımlama ile birlikte yapım aşamasındadır. Bununla birlikte, (sıfır mutasyon üretmek için, genel olarak beklenen) bu yaklaşım elzem genlerine için geçerli değildir. Sıcaklığa duyarlı (ts) mutasyonlar recovere edilebilirtemel genlerdeki d ve son yöntemler mutasyona uğramış gen ve nedensel lezyonun etkin kimlik izin verir. yüksek sıcaklıkta Fenotipik analizi, daha sonra mutasyona uğramış genin fonksiyonu hakkında derhal bilgi verir. Biz hücre döngüsü ilerlemesinde rol oynayan genlerin özellikle odaklanarak, Chlamydomonas ~ 70 temel genlerdeki ts ölümcül mutasyonlar izolasyonu ve karakterizasyonu üzerine rapor ve 1,4 kontrol eder. Ts öldürücü ekranlar yıllardır 5,6 mikroorganizmaların genetik analizlerin bir dayanak olmuştur. Prensip olarak, arzu edilen bir özellik, ölümcül TS mutasyona yeteneğine sahip tüm genlerin tam bir analiz sağlayan en az bir mutant tarafından tanımlanan olduğu anlamına gelen &quot;doygunluğu,&quot; yaklaşım sağlamaktır. Bununla birlikte, uygulamada, çeşitli faktörler doygunluk yaklaşım sınırlar. Hemen hemen tüm genlerin yüksek sıcaklıkta aktivite kaybına uğramış olabilir İlk olarak, bu tür mutant geri kazanım veriminin en az göre değişirbüyüklüğü 7,8 bir düzen. Bu nedenle, rastgele bir ekran doygunluk yaklaştı uzun zaman önce &quot;sık sık el ilanları&quot; tekrarlayan hit almak için başlar. ts mutasyonlar genellikle fonksiyonunun azalmasına neden olurken İkincisi, onlar gerçek bir kısıtlayıcı sıcaklıkta nulls olmayabilir (ve tersi, sık sık bir keyfi sıcaklıkta tamamen işlevsel değildir). Bu sorun, birden allelleri karşılaştırarak bir ölçüde ele alınabilir; hepsi ortak bir fenotip paylaşan, bu genin basit inaktivasyonu sonucu yansıtmak için daha olasıdır. Çoklu alleller da etken lezyon 1 kesin moleküler tanımlanması için çok faydalıdır. Ancak, &quot;sık uçan&quot; sorunu nadiren vurmak genlerdeki birden alleller kurtarmak için zor olabilir anlamına gelir. Bu nedenlerden dolayı, izole etmek ve fenotipik TS mutantlar karakterize için geliştirilmiş boru hattı geliştirilmektedir. Biz i bugüne kadar 3.000&#39;in üzerinde ts mutantlar topladık200, yeni bir aday hücre döngüsü mutasyonlar ncluding. Zaten muhtemelen çoğu veya tüm hücre gerekli yollar mutasyonlar içeren bu koleksiyonda, Moleküler ve fenotipik analizi, bitki hücre biyolojisinde yeni anlayışlar ve hipotezleri sağlamalıdır. Önemli olarak, bu boru hattının verimli, Ts mutantı koleksiyonları oluşturmak için agarı üzerinde yetişen herhangi bir mikroorganizma uygulanabilir. ekipman ile ilgili bir not: İki robot bu prosedür (bir koloni toplayıcı ve bir arada kopya plater / kiraz seçici) verimlilik açısından çok önemlidir. Toplayıcıları tipik olarak metal işaretçilerine var. Çekilen koloniler (modele bağlı olarak, saniyeler dakika) belli bir süre için bu iğneler üzerinde havada yapılır. Chlamydomonas havada metal pim üzerinde yaklaşık 20 saniye içinde ölür. Bu organizma modeli seçimi kısıtlar. Doğruluk önemlidir. Bizim koloni seçici makul doğru; Ancak, onun eylem biraz şiddet ve sprey bazlı çapraz kontaminasyon için bazı olasılığı vardır. Yüksek de kullanılmazer daha 384 yoğunluğu (4.5 mm merkez merkez boşluk); Bu yoğunlukta, doğruluk tamamen kabul edilebilir. çoğaltma kaplama / kiraz toplama robotu (bu uygulamalar için kullanılan farklı ekleri) toplama çok daha yavaştır, ancak (6144 bile bu çok doğru robot için bir meydan okumadır 1536 yoğunluğu için yeterli doğrudur, biz bu yoğunluk değerlendirildi ancak seçtiler ) nedeniyle çeşitli zorluklar kullanmak için. Levha vb, dengesiz yüklenen ise robot iyi çalışmaz. Doğru şeyler oluyor emin olmak için nokta-kontrol etmek önemlidir; Elbette, robot gözetimsiz çalışacak ve genel olarak tüm ilk birkaç tabak doğruydu de eğer gidecek.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Ekipman: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hudson RapidPick koloni seçici</td><td>Hudson Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiDrop Combi Reaktif Dispenseri</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Küçük tüp metal uçlu kaset</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Singer RotoR replika kaplama robotu</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Süreç için çok önemli. Daha düşük ölçekli taramalar için, şirket içi bir manuel araç olan</td></tr><tr><td>Singer tek kolonili toplama ataşmanı kullanabilirsiniz (' iğne')</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>manuel olarak seçilebilir, ancak büyük ölçekler için neredeyse imkansızdır</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Materials:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Yeşil Nükleik Asit Lekesi</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>S7020</td><td></td></tr></tbody></table>

sıcaklık duyarlı Öldürücü mutants yüksek verim robotik destekli İzolasyonu içinde<em&gt; chlamydomonas reinhardtii</em

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Genetik bozulmaların sistematik olarak tanımlanması ve karakterizasyonunun, gen fonksiyonunu ve hücresel yolları deşifre etmek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, kalıcı gen delesyonunun geleneksel yaklaşımları temel genlere uygulanamaz. Tek hücreli yeşil algler Chlamydomonas reinhardtii1'de hücre döngüsü düzenlemesini incelemek için ~ 70 sıcaklığa duyarlı (ts) ölümcül mutanttan oluşan benzersiz bir koleksiyona öncülük ettik. Bu mutasyonlar, temel genleri tanımlar ve ts alelleri, sıcaklık kayması ile koşullu olarak etkisiz hale getirilebilir, bu da temel işlevleri tanımlamak ve analiz etmek için değerli araçlar sağlar. Mutant koleksiyonları, kapsamlı olmaya yakınlarsa çok daha değerlidir, çünkü dağınık koleksiyonlar önemli bileşenleri gözden kaçırabilir. Bununla birlikte, bu, özellikle geniş hedefli bir ekranda çok sayıda mutantın verimli bir şekilde toplanmasını gerektirir. Burada, ölümcül mutantlar üretmek ve fenotiplerini Chlamydomonas'ta analiz etmek için robotik tabanlı bir boru hattını açıklıyoruz. Bu teknik, agarda yetişen herhangi bir mikroorganizmaya uygulanabilir. Yaklaşık 200 yeni aday hücre döngüsü mutasyonu da dahil olmak üzere, muhtemelen hücre için gerekli yolakların çoğunda veya tümünde mutasyonlar dahil olmak üzere 3000'den fazla ts mutantı topladık. Bu mutantların müteakip moleküler ve hücresel karakterizasyonu, bitki hücre biyolojisinde yeni anlayışlar sağlamalıdır; Kapsamlı bir mutant koleksiyonu, çok çeşitli biyolojik yolların kapsanmasını sağlamak için temel bir ön koşuldur. Bu yöntemler, bu makalenin kapsamı dışında kalan nedensel mutasyonların verimli bir şekilde haritalanması ve tanımlanması için aşağı akış genetik ve biyoinformatik prosedürlerle entegre edilmiştir.

Biz Chlamydomonas ts mutantlar izole etmek için hızlandırılmış bir boru hattı göstermektedir. Hücreler, agar plakaları üzerinde dağıtılır ve kısa bir süre tek hücre yoğunluğu mikroskop altında pratik doğrulama sonra plakalar, UV radyasyona tabi (Şekil 1). Tipik ışınlanmış koloniler tespit ve bir keyfi sıcaklıkta (Şekil 2) büyüme 10 gün sonra bir dizilmiş biçime toplanır. 384 biçiminde bileşke plakalar 1536 dizi (Şekil 3) ile birleştirilir. ışınlanmış koloniler toplama bu ilk adımlarından itibaren, şimdiye kadar ~ 200.000 koloniler dizilmiş var. 600 kurtulan koloniler plakalar üzerinde oluşturacak - süspansiyon yoğunluğu, ölümü için muhasebe, 200 böylece planlanan UV dozu dayalı ayarlanır. Üç UV ışınlarına maruz kalma süresi (1.5 dakika, 1 dakika ve 0.5 dakika) ve üç yoğunlukları buna uygun olarak (Tablo 1) test edilmiştir. Ampirik, 1.5 dakika maruz kalma süresi ts en vermiştir- Mutantlar (~% 50); Ancak, bugüne kadar, 1 dak hücre döngüsü adayların çoğu vermiştir. Bu nedenle, gelecek UV mutagenez mermi sadece 1 dakika ile yapıldı. Önemli bir sorun, ilk toplama ve (özellikle yüksek yoğunluklu formatlarda) çapraz kontaminasyon sırasında sıçraması olduğunu. Bu iki çoğaltma ve aynı mutantının daha fenotipleme neden olabilir. Böyle bir senaryo için olasılığını en aza indirmek için, en uygun boyutta koloniler toplamak için özen ve komşu koloniler ilk deneyde aldı olmadığından emin olun. Sonra, iki sıralı TS-fenotip deneyleri (Şekil 5) yapıldı ve yaklaşık 3.000 TS-mutantları izole edilmiştir ve fenotipik zaman atlamalı mikroskobu (Şekil 8) tarafından karakterize edilir. Nedeniyle belirli ölçütlere uyan fenotipleri ilgi hücre döngüsünü okuyan biyolojik odak, biz gen her hedef ikiden fazla alleli toplama ilgilenmiyore. Bu nedenle, biz aşağı boru hattı (Şekil 9) dan son derece tekrarlayan genleri kaldırmak için yeni toplanan adaylara karşı ikiden fazla allel (Sorgu) zaten karakterize genlerle tamamlanmasını ve bağlantı testi uygulandı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig1.jpg" /> Şekil 1: Düzgün mutajenize Hücreleri ve UV Mutajenesisin Yayılma. (a) 384 x 2 ul damla Reaktif dağıtıcı kullanarak bir agar plaka üzerine dağıtılır. (b) Rastgele plakaları tek hücreli yoğunluğu doğrulamak için mikroskop altında test edilmiş ve 1 dk maruziyet ile ışınlanmış UV vardır vardır. Ölçek çubuğu 50 mikron =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54831 / 54831fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2. UV mutagenized Koloniler 384 diziler için aldı. (a), UV-ışınlanmış tek hücre görünür koloniler halinde 10 gün ~ için yetiştirilir. Ölçek çubuğu = 2 cm. (b) Görüntü analiz programı belli parametrelere göre ayrılabilir kolonilerini tanır ve robot 384 tabak içine diziler. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54831/54831fig3.jpg" /> 1536-dizi 3. birleştirme Şekil. Dört 384 format plakaları tek 1.536-plakaya birleştirilir; bir kez yetiştirilen, onlar TS-fenotip test etmek için tekrar çoğaltılır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig3large.jpg" target="_blank">Bir görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonu. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54831/54831fig4.jpg" /> Niceleme 4. Görüntüleme Şekil. Bir serideki tüm plakaları aynı büyütme ve konumlandırma fotoğraflanan böylece (a) Levhalar belge fotoğraf standı altında bir çerçeve içinde tutulur. (b) birinci köşe görüntü ve orta noktaları yerleştirilmiş kırmızı noktalar ile 1536 oyuklu mikrotitre plakasının taşımaktadır. Bu &quot;ızgara plakalı&quot; görüntü dizinin konumunu tanımlar. (c) inkübasyonun ardından 1.536-dizi Örnek. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54831/54831fig5.jpg" /> Yarı tarafından TS-fenotip Şekil 5. Kimlik-Otomatik görüntü analizi. Plaka görüntüleri (SI sağlanan) özel MATLAB yazılımı tarafından analiz edilir. görüntüsü otomatik hücre dizileri (96, 384, ya da 1536) içine bölümlere ve her hücrede sinyali ölçülür. 21 ° C&#39;de büyüme mavi işaretlenir ve 33 ° C&#39;de büyüme sarı işaretlenir. 33 ° C ile karşılaştırıldığında 21 ° C&#39;de önemli ölçüde daha yüksek bir büyüme sergileyen koloniler seçilir ve yeşil bir nokta ile siyah kareler işaretlenmiştir (ts + standardize). Bu seçimler elle düzenlenebilir. Nihai seçimleri koloni toplama robotu tarafından kullanılan bir dosyaya aktarılır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54831/54831fig6.jpg" /> İlk yuvarlaklık ts Lethal Adayları Şekil 6. Robotik Toplama. kiraz-picking robotu yeni bir dizi için adayların almak için adım 2.1 açıklandığı gibi oluşturulan bir dosyadan talimatları izler. Üst panelde steril pim yüklenmesini gösterir. alt panel kaynak plakası belli bir koloniden kesin toplama gösterir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/54831/54831fig7.jpg" /> Ts Ölümcül fenotipleri İlk Sıralama için Şekil 7. Time-lapse Taraması. Şekil 5&#39;te gösterilen tarama protokolü iki tur geçirilir klonlar tek tek hücreler mikroskobik olarak çözülebilir şekilde bir hücre yoğunluğunda plakalara çoğaltılır. Değiştirilmiş bir tetrad mikroskopu fotomikrograflarıdır 0 saat, 10 saat ve 20 saat inkubasyon bir süre sonra alındığı pozisyonları tanımlamak için kullanılır<html> t 33 ° C. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/54831/54831fig8.jpg" /> Şekil 8: Time-Lapse Mikroskopi tarafından Belirlenen Chlamydomonas Hücre Döngüsü Mutantlar. (a) Chlamydomonas benzersiz hücre döngüsünün İllüstrasyon yenidoğan kızı hücrelerinin kuluçka ile sona fisyon SM döngüleri, ardından hücresel büyüme ile karakterize uzun G1 fazı, açıklanır. (b) Mikroskobik görüntüler hücre döngüsü ve mitoz tamamlamak için başarısız tipik hücre döngüsü mutantlar belirlenmesi sırasında WT hücreleri göstermektedir. Ölçek çubuğu 50 mikron =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 1 &quot;&gt;:&quot; keep-together.within sayfa = fo &quot;ent <img alt="Şekil 9," src="/files/ftp_upload/54831/54831fig9.jpg" /> Şekil 9: tamamlama ve Bağlantı Testi. (a) sık sık tekrarlanan mutasyona uğramış gen ile bir antibiyotik dirençli (örneğin, Hygro) sorgu (örneğin, Puro) ikinci bir antibiyotik direnç kasetini liman karşı eşleşme Çeşidi mutantlarının bir dizi 96 oyuklu bir plaka içerisinde çaprazlanır. (A sol alt panel) nükleik asit boyama ve analiz flow sitometri de gösterildiği gibi tümleme plakaları diploidlerin yüksek kısmını verir. (b) çiftleşme karışımı diploidlerin içinde tamamlama ve çift dayanıklı mayotik döl içinde bağlantı için hem test edilir. Pozitif kontrol zıt eşleşme türü sorgu kendisi ve negatif kontrol WT ve ts + fenotipini gösterir ise, beklendiği gibi, 33 ° C&#39;de TS-fenotipi gösterir. daire koloniler sorgu ile hiçbir tamamlanmasını göstermek ve bu nedenle nSorgu geni için ew TS-alleller. Sadece &quot;sık sık el ilanları&quot; tamamlama testi seti olduğundan Bunlar genellikle, daha fazla karakterizasyon dışındadır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Zaman </td><td> OD </td><td> Koloniler aldı (#) </td><td> TS-fenotip </td><td> Hücre döngüsü adayları </td></tr><tr><td> 1.5 &#39; </td><td> 0.012 </td><td> 6000 (Ort = ~ 200) </td><td> 200 (% 3.3) </td><td> 7 (% 3.5) </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 &#39; </td><td rowspan="2"> 0.003 </td><td> 11.000 </td><td rowspan="2"> 131 (1.19%) </td><td rowspan="2"> 15 (% 11.4) </td></tr><tr><td> (Ort = ~ 360) </td></tr><tr> &lt;td rowspan = &quot;2&quot;&gt; 0.5 &#39; </td><td rowspan="2"> 6E-04 </td><td> 9000 </td><td rowspan="2"> 40 (% 0.45) </td><td rowspan="2"> 1 (% 2.5) </td></tr><tr><td> (Ort = ~ 300) </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Işınlama Times Kalibrasyon Hücre Döngüsü Mutant Adayları Verim maksimize etmek. Üç ışınlama süreleri kalan koloni sayıları (- 600 200) sağlamak için ODS tekabül eden (30 plakaları her biri) test edildi.

Sıcaklığa duyarlı (ts) ölümcül mutantlar, temel işlevleri tanımlamak ve analiz etmek için değerli araçlardır. Burada, yüksek verimde ölümcül mutantları üretme ve sınıflandırma yöntemlerini açıklıyoruz.

Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Bu prosedürün genel amacı, bu organizmadaki temel genleri ve yolakları belirlemek için Chlamydomonas'taki sıcaklığa duyarlı letal mutasyonların izolasyonunu kolaylaştırmak amacıyla robotik sistemler ve standardize edilmiş analizler kullanmaktır. Ökaryotlardaki temel hücresel fonksiyonların hem korunumuna hem de farklılaşmasına ilgi duyuyoruz. Bunu ise, bu süreçlerdeki temel genleri bozan mutasyonlar ile incelemeyi tercih ediyoruz.Bunun iyi çalışabilmesi için gerçekten kapsamlı bir mutant koleksiyonuna ihtiyacınız vardır ve duyacağınız yöntemler, böyle bir koleksiyon oluşturma yolumuzu göstermektedir. Bitkiler alemesinin bir temsilcisi olarak yeşil alg Chlamydomonas reinhardtii üzerinde çalışıyoruz. Bu tekniğin temel avantajı, sıcaklığa duyarlı öldürücü mutasyonların muhtemelen her temel yolakta bulunabilmesidir.Bu yöntem, ön bilgi veya hedeflenmiş mutajenez gerektirmez. Mutasyona uğramış genin moleküler fonksiyonu, letal fenotipten hemenca çıkarılabilir. Bu durum, hücre döngüsü kontrolünün ötesindeki çeşitli siala yolaklarını bozan ilginç mutasyonları seçmemize yardımcı olur.UV mutajenezi gerçekleştirmek için Chlamydomonas hücrelerini, 25 °C sıcaklıkta, ışık altında ve 100 RPM sallama hızında, 100 mililitre Tris-Asetat-Fosfat veya TAP içerisinde OD 750 değeri 0,2 ile 0,5 arasına gelene kadar kültürleyin. UV mutajenezi, metin protokolüne uygun olarak iki farklı genetik arka planda bağımsız olarak yürütülür. Hücrelerin canlı olduğunu ve kontaminasyon bulunmadığını doğrulamak için her kültürden bir örneği mikroskop altında inceleyin.Ardından kültürü 0,003 OD 750 değerine seyreltin; suş modal olduğu ve ışığa yanıt olarak yönlü şekilde yüzdüğü için homojen yoğunluğu sağlamak amacıyla şişeyi alüminyum folyo ile sarın. Süspansiyon yoğunluğunu metin protokolüne göre ayarladıktan sonra, sıvı dağıtıcıya uygun küçük bir tüp kaseti takın ve kontaminasyonu önlemek için üretici talimatlarına uygun olarak sterilizasyon için bir dizi yıkama işlemi gerçekleştirin. Sekiz şırıinglı bir sıvı dağıtıcı kaseti kullanarak, kuru dikdörtgen plakalar üzerine her biri 2 µL olan 96'şar damladan dört set kültür dağıtın.Tüm damlaların ince bir sıvı tabakası halinde birleşmesini sağlamak için plağın kenine hafifçe vurun ve ışığa maruz kalmayı önlemek için plakları hemen kapatın. Kuruduğunda, sağ kalanlar arasında optimal ts mutant verimi sağlayacak, ampirik olarak belirlenmiş süreler boyunca plakları germisid bir UV lambası altına yerleştirin. Ardından, plakları oda sıcaklığında sekiz ila 24 saat boyunca karanlığa aktarın.Ardından plakaları, aydınlatmalı 21 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Kolonilerin büyüdüğü ancak henüz birbirleriyle birleşmediği yaklaşık 10 günün ardından, plakaları robotik koloni toplama işlemi için kaynak olarak ilgili yığına yükleyin. Sonrasında dikdörtgen plakalar üzerindeki 384'lü diziler için kolonileri toplayın ve bunları yaklaşık bir hafta boyunca aydınlatmalı 21 °C'de büyütün.Bir replika ekim robotu kullanarak, 384'lük dizileri 1536'lık bir diziye yoğunlaştırın ve plakaların 21 °C'lik inkübatörde yaklaşık üç gün boyunca büyümesine izin verin. 1536'lık dizileri her birini iki plakaya gelecek şekilde replike edin ve birini 21 °C'lik inkübatöre, diğerini ise 33 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. 33 °C'de 24 saat bekledikten sonra, 33 °C'lik inkübatördeki plakaları önceden ısıtılmış yeni bir plaka setine replike edin ve bunları 33 °C'lik inkübatöre yerleştirin.33 °C'de üç gün ve 21 °C'de beş gün büyüme sağlandıktan sonra, dokuz hizalama göstergesiyle işaretlenmiş bir ızgara plakayı fotoğraflamak için dijital bir kamera kullanın. Ardından, kesin yönlendirmeyi korumak için tüm plakalar sabit bir çerçeveye yerleştirilerek, 21 °C plakaları ve ardından bunlarla eşleşen 33 °C plakaları sırasıyla fotoğraflayın. Eşleştirilmiş 21 ve 33 derece plaka görüntülerini, arka planı yok etmek ve görüntüleri 1536'lık bir diziye bölmek için özel bir matte lab görüntü analiz yazılımı ile işleyin.Program, tespit edilen biyokütleyi her konumdaki toplam piksel yoğunluğu olarak belirleyecektir. Yazılım tarafından oluşturulan seçili kolonlar listesini, tekli kolon toplama robotu için bir talimat dosyası olarak yükleyin. Ardından, kaynak ve hedef plakaları robotik talimatlarına göre hazırlayın ve robotun seçilen kolonları bir diziye toplamasını sağlayın.Stok plak oluşturmak için hedef plakları yaklaşık beş gün boyunca 21 °C'lik inkübatöre yerleştirin. İkinci bir biyokütle birikim analizi gerçekleştirip metin protokolüne uygun olarak 100 blok plak replikasyonu yaptıktan sonra, 100 blok plakların taze kopyasını üç kopyaya çoğaltın. Robotta üçüncü plağın kurulumu ve kolonların noktalanmasının ardından, tarama plaklarındaki her noktanın bir bölgesinin sıfırıncı zamandaki foto-mikrograflarını çekin ve plakları inkübasyon için 33 °C'ye yerleştirin.Tarama plakalarının 37 °C'lik inkübatörden çıkarılmasının ardından, farklı zaman noktalarında, her zaman noktasında aynı hücrelerin görüntülerini elde etmek için plaka tutucunun ve tabla kontrolcüsünün hassas bir şekilde kalibre edildiğinden emin olarak hızlıca foto-mikrograflar çekin. Mikroskobik görüntüleri analiz edin ve istenen kriterlere göre mutantları seçin. Her bir plakanın aynı çiftleşme tipine ve ilaç direncine sahip mutantları içerdiğinden emin olarak, seçilen final setini 96'lı dizili agar plaka üzerine noktalar halinde ekleyin.Dizili kolonilerin büyük miktarlarını, 96 kuyucuklu mikroplakalarda azotsuz gamet indüksiyon ortamına aktarın. Gametogenezin gerçekleşmesi için plakaları yaklaşık beş saat boyunca ışık altında inkübe edin. Alternatif direnç kasetlerini taşıyan karşı çiftleşme tipindeki sorguları, gametogenez için azotsuz gamet indüksiyon ortamı içeren tüplere süspanse edin.Hedef plaka üzerindeki örnekleri 20 µL'lik bir çiftleşme karışımı hacminde karıştırın. Işık altında yaklaşık 10 dakika bekledikten sonra, her kuyucuktan beş mikrolitreyi iki kez damlatın. Bir kez bağlantı testi için TAP plakasına, bir kez de komplementasyon testi için beş µM paro ve dokuz µM hygro içeren TAP plakasına damlatın.Komplementasyon testi plaklarını inkübe ettikten sonra, ts fenotip tanımlaması için plakaları iki kopya halinde çoğaltın. Kolonileri metin protokolüne göre ts fenotipi açısından test edin. Chlamydomonas tek hücrelerinin ışınlanmasının ardından, hücrelerin izinlebilir bir sıcaklıkta on gün boyunca büyümesine izin verilir, ardından burada görüldüğü gibi dizili bir formatta seçilirler.384 formatındaki sonuç plakaları, 1536'lık bir dizide birleştirilmiştir. Chlamydomonas ts mutantları oluşturmak için üç farklı UV maruziyet süresi test edilmiştir. Ampirik olarak, 1,5 dakikalık maruziyet süresi en fazla sayıda ts mutantını sağlamıştır.Buna karşın, açık ara en fazla hücre döngüsü adayı bir dakikalık pozlama süresiyle elde edilmiştir. Bu deneyde, birbirini izleyen iki sıcaklık duyarlı (ts) fenotip analizi gerçekleştirilmiş ve yaklaşık 3000 ts mutanı izole edilerek zaman ayarlı mikroskopi ile fenotipik olarak karakterize edilmiştir. Burada görüldüğü üzere, sonraki aşamalarda tekrarlayan genleri ayıklamak için, yeni toplanan adaylar üzerinde, iki veya daha fazla alele sahip önceden karakterize edilmiş genlerle komplementasyon ve bağlantı testleri yapılmıştır.Bu koloniler sorgulanan suş ile komplementasyon göstermez ve dolayısıyla sorgulanan gen için yeni ts alelleridir. Bunlar genellikle daha ileri karakterizasyon işlemlerinin dışında tutulur. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem yüksek kapasiteli bir şekilde gerçekleştirilebilir.Sadece iki veya üç mutajenez turunda binlerce ts mutantı izole edilebilir. ts mutantlarının izolasyonundan sonraki kilit adım, daha ileri çalışmalar için bir alt küme seçmektir ve letal fenotiplerin çeşitliliğini görmek oldukça ilgi çekicidir. Fenotipleme, moleküler işleve dair ipuçları sağlar ve ayrıca mutantları ileri çalışmalar için önceliklendirmemize yardımcı olur.Mutantların genomlarında yüzlerce veya binlerce mutasyon olabileceğini unutmayın. Genellikle sadece biri nedenseldir, ancak bazen ts fenotipi için iki mutasyon gerekir ve bu durum tetra analizi ile belirlenebilir. Bu prosedürü takiben, havuzlanmış örneklerin yeni nesil dizileme analizi ile nedensel mutasyonlar tanımlanabilir. Tanımlanan genlerin bazen işleve işaret eden mutasyonları olacaktır veya bunlar yeni, bilinmeyen diziler olabilir ki bu durum ilgi çekici ve heyecan vericidir.Chlamydomonas, bitkiler aleminde hücre biyolojisini çalışmak için mükemmel bir model sistem olmuştur. Bahsettiğiniz prosedürler, bu organizmanın nispeten daha az incelenmiş olan temel süreçlerinin araştırılmasına olanak sağlayacaktır ve sonuçların daha geniş bitkiler alemi için de geçerli olacağını umuyoruz.

high-throughput-robotically-assisted-isolation-temperature-sensitive

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Biz kimyasal mutagenez ve tüm genom dizileme dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif. Buna ek olarak, enfekte olmuş hücrelerde DNA'nın değişimi için bir sistem genetik haritalama için kullanılabilir olduğu tarif edilmektedir. Bu yöntem dönüşüm sistemleri ve moleküler genetik araçları eksik mikrobiyal sistemlerine geniş uygulanabilir.

Ileri Genetik Yaklaşımlar<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Elektroporasyon dönüşüm olarak bilinen bir süreç içinde bakteri DNA'nın verilmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Elektro-hücrelerinin hazırlanması için geleneksel protokoller zaman alıcı ve emek yoğundur. Bu makalede, bir alternatif, hızlı ve şu anda bazı laboratuarlarda tarafından kullanılan elektro-hücrelerinin hazırlanması için etkili bir yöntem tarif eder.

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ve<em&gt; Vibrio cholerae</em

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Arındırmak ve centrioles farklı yönelimleri Süper çözünürlük mikroskobu ve tek-parçacık ortalama için mükellef içinde çok sayıda resim için bir strateji geliştirdik.

Yalıtım ve floresan görüntüleme Chlamydomonas Centrioles tek-parçacık yeniden inşası için

Çoklu biyomoleküllerin sistem çapında analiz biyolojik süreçlere işlevsel ve mekanik anlayışlar elde etmek için çok önemlidir. Bu konuda geniş bir protokol, senkronize Chlamydomonas kültüründen toplanan tek bir örnekten lipidler, metabolitler, proteinler ve nişasta yüksek verimlilik ekstraksiyonu için tanımlanmıştır.

Yeşil Alga Chlamydomonas reinhardtii eşitlenmiş kültürlerin derinlemesine analizi için Multi-Omics ekstraksiyon yöntemi

Burada tanımlanan floksed kaset allelic değişim mutagenezi, FLAEM kullanarak Chlamydia trachomatis hedefli, markerless gen delemesi için bir yöntemdir.

Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion

Bu protokol, Klamidya trachomatisgelişimsel mutantları tanımlamak ve izole etmek için yönlendirilmiş ileri genetik yaklaşımda floresan organizatör-muhabirler, canlı hücre mikroskobu ve bireysel dahil çıkarma kullanır.

Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım

Hareketli hücrelerin in vitro reaktivasyonu, hücre hareketliliğinin mekanizmalarını anlamada çok önemli bir deneydir. Protokol, kirpikler / flagella'yı incelemek için bir model organizma olan Chlamydomonas reinhardtii'nin demembrane edilmiş hücre modellerinin yeniden aktive edilmesini açıklar.

Chlamydomonas reinhardtii'de Demembrane Hücre Modellerinin Reaktivasyonu

Çoğu yüzme fotoototrofik organizması, foto-kaynaklı davranış değişiklikleri (fotodavranış) gösterir. Mevcut protokol, Chlamydomonas reinhardtii model organizmasında söz konusu fotodavranışı gözlemlemektedir.

Chlamydomonas reinhardtii'de Fotodavranışın Gözlemlenmesi

Burada, inkübatör olarak düşük maliyetli, enerji verimli tezgah üstü termomikserler kullanan termofillerde adaptasyon için deneysel bir evrim protokolü sunuyoruz. Teknik, 75 °C'lik optimum büyüme sıcaklığına sahip bir arkeon olan Sulfolobus acidocaldarius'ta sıcaklık adaptasyonunun karakterizasyonu yoluyla gösterilmiştir.

Yaşamın Uç Noktalarında Adaptasyon: Ekstremofil Archaeon Sulfolobus acidocaldarius ile Deneysel Evrim

Bu protokol, ısı şoku proteini 70'in (Hsp70) şaperon aktivitesini gösterir. E. coli dnaK756 hücreleri, doğal, işlevsel olarak bozulmuş bir Hsp70 barındırdıkları için test için bir model görevi görür ve bu da onları ısı stresine duyarlı hale getirir. Fonksiyonel Hsp70'in heterolog girişi, hücrelerin büyüme eksikliğini kurtarır.

Isı Şoku Proteininin Şaperon Fonksiyonunu İncelemek için Escherichia coli Bazlı Tamamlama Testi 70

Öğrenin Chlamydomonas reinhardtii'de yüksek verimli robotik destekli yöntemle sıcaklık duyarlı öldürücü mutant izolasyonunu. Bu teknik, ökaryotlarda temel hücresel işlevleri ve korunmuş genleri belirlemek için kapsamlı mutant koleksiyonları oluşturur.

Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde

Daha fazla video keşfet