Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde Chlamydomonas reinhardtii

Prosedürün genel amacı, bu organizmadaki temel genleri ve yolları belirlemek için Chlamydomonas'taki sıcaklığa duyarlı ölümcül mutasyonların izolasyonunu kolaylaştırmak için robotik ve standartlaştırılmış tahliller kullanmaktır. Ökaryotlarda temel hücresel fonksiyonların hem korunması hem de farklılaşması ile ilgileniyoruz. Ve bunu incelemeyi sevdiğimiz yol, bu süreçlerdeki temel genleri bozan mutasyonlardır.

Bunun iyi çalışması için, gerçekten kapsamlı bir mutant koleksiyonuna ihtiyacınız var ve duyacağınız yöntemler, böyle bir koleksiyon oluşturma yöntemimizdir. Yeşil alg Chlamydomonas reinhardtii'de bitki krallığının bir temsilcisi olarak çalışıyoruz. Bu tekniğin ana avantajı, sıcaklığa duyarlı ölümcül mutasyonların muhtemelen her temel yolda bulunabilmesidir.

Yöntem, önceden bilgi veya hedeflenen mutajenez gerektirmez. Mutasyona uğramış genin moleküler işlevi, ölümcül fenotipten hemen önerildi. Bu, hücre döngüsü kontrolünün ötesinde çeşitli siala yollarını bozan ilginç mutasyonları seçmemize yardımcı olur.

UV mutajenez kültürü Chlamydomonas hücreleri, 100 mililitre Tris-Asetat-Fosfat veya TAP'ta 0.2 ila 0.5 OD 750'ye kadar, 25 santigrat derecede ışık altında ve 100 RPM'de çalkalayarak gerçekleştirmek için. UV mutajenez, metin protokolüne göre iki genetik arka planda bağımsız olarak gerçekleştirilir. Hücrelerin canlı olduğundan ve kontaminasyon olmadığından emin olmak için mikroskop altında her kültürün bir örneğini kontrol edin.

Daha sonra, kültürü 0.003'lük bir OD 750'ye seyreltin, ardından homojen yoğunluğu sağlamak için şişeyi alüminyum folyo ile sarın, çünkü gerinim modiktir ve ışığa tepki olarak yönlü olarak yüzer. Süspansiyonun yoğunluğunu metin protokolüne göre ayarladıktan sonra, bir sıvı dağıtıcıya uyan küçük bir tüp kaseti takın ve kontaminasyonu önlemek için üreticinin talimatlarına göre sterilizasyon için bir dizi yıkama gerçekleştirin. Sekiz şırıngalı bir sıvı dağıtıcı kaseti kullanarak, her biri iki mikrolitreden dört damla 96 damla kuru dikdörtgen plakalara dağıtın.

Tüm damlaların ince bir sıvı tabakasında birleşmesini sağlamak için plakanın kenarına hafifçe vurun ve ışığa maruz kalmasını önlemek için plakaları hemen kapatın. Kuruduğunda, plakaları, hayatta kalanlar arasında en uygun ts mutant verimini vermek için ampirik olarak belirlenen süreler boyunca antiseptik bir UV lambasının altına yerleştirin. Daha sonra, plakaları oda sıcaklığında sekiz ila 24 saat boyunca karanlığa aktarın.

Ardından plakaları aydınlatmalı 21 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Kolonilerin büyüdüğü ancak birleşmediği yaklaşık 10 günün ardından, plakaları robotik koloni toplama için kaynak olarak ilgili yığına yükleyin. Daha sonra dikdörtgen plakalar üzerinde 384 dizi için koloniler toplayın ve bunları yaklaşık bir hafta boyunca aydınlatma ile 21 santigrat derecede büyütün.

Bir replika kaplama robotu kullanarak, 384 diziyi bir 1536 diziye yoğunlaştırın ve plakaların 21 santigrat derece inkübatörde yaklaşık üç gün boyunca büyümesine izin verin. 1536 dizisini her biri iki plakaya çoğaltın ve birini 21 santigrat derece inkübatöre, diğerini 33 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. 33 santigrat derecede 24 saat sonra, plakaları 33 santigrat derece inkübatörden yeni bir önceden ısıtılmış plaka setine kopyalayın ve bunları 33 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.

33 santigrat derecede üç günlük büyümenin ve 21 santigrat derecede beş günlük büyümenin ardından, dokuz hizalama göstergesiyle işaretlenmiş bir ızgara plakasını fotoğraflamak için bir dijital kamera kullanın. Ardından, 21 santigrat derece plakaları ve ardından karşılık gelen 33 santigrat derece plakaları ve tam oryantasyonu korumak için tüm plakaları sabit bir çerçeveye yerleştirilmiş olarak fotoğraflayın. Arka planı ortadan kaldırmak ve görüntüleri 1536 diziye bölmek için eşleştirilmiş 21, 33 plaka görüntüsünü özel bir mat laboratuvar görüntü analiz yazılımıyla işleyin.

Program, tespit edilen biyo-kütleyi her pozisyonda toplam piksel yoğunluğu olarak belirleyecektir. Yazılım tarafından oluşturulan seçili kolonilerin listesini, tek koloni toplama robotiği için bir talimat dosyası olarak yükleyin. Daha sonra kaynak ve hedef plakaları robotik talimatlara göre hazırlayın ve robotun seçilen kolonileri bir diziye almasına izin verin.

Bir stok plakası yetiştirmek için hedef plakaları yaklaşık beş gün boyunca 21 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. İkinci bir biyokütle biriktirme tahlili gerçekleştirdikten ve metin protokolüne göre 100 blok plakayı çoğalttıktan sonra, 100 blok plakanın yeni kopyasını üç kopyaya çoğaltın. Robotta üçüncü plakanın kurulumunu ve kolonilerin tespit edilmesini takiben, tarama plakalarının her bir noktasının sıfır zamanlarında bir bölgenin foto-mikrograflarını çekin ve plakaları inkübasyon için 33 santigrat dereceye yerleştirin.

Tarama plakalarını 33 santigrat derece inkübatörden çıkardıktan sonra değişen zaman noktalarında, hızlı bir şekilde foto-mikrograflar çekin, plaka tutucunun ve sahne kontrolörünün her zaman noktasında aynı hücrelerin görüntülerini elde etmek için hassas bir şekilde kalibre edildiğinden emin olun. Mikroskobik görüntüleri analiz edin ve istenen kriterlere göre mutantları seçin. Seçilen son seti 96 dizili bir agar plakasında belirleyin ve her plakanın aynı çiftleşme tipine ve ilaç direncine sahip mutantlar içerdiğinden emin olun.

Dizilenmiş kolonilerin büyük miktarlarını 96 oyuklu mikroplakalar üzerinde Azotsuz gamet indüksiyon ortamına aktarın. Gametogeneze izin vermek için plakaları ışık altında yaklaşık beş saat inkübe edin. Gametogenez için Azot içermeyen gamet indüksiyon ortamı ile tüplere alternatif direnç kasetlerini barındıran zıt eşleşme tipleriyle sorguları askıya alın.

Numuneleri bir hedef plakadan 20 mikrolitrelik bir eşleşen karışım hacminde karıştırın. Işık altında yaklaşık 10 dakika sonra, her kuyucuktan iki kez beş mikrolitre tespit edin. Bir kez bağlantı testi için bir TAP plakasında ve bir kez bir TAP artı beş mikromol paro artı tamamlama testi için dokuz mikromol higro.

Tamamlama test plakalarını inkübe ettikten sonra, fenotip tanımlaması için plakaları iki kopyaya çoğaltın. Metin protokolüne göre ts fenotip için kolonileri test edin. Chlamydomonas'ın tek hücrelerinin radyasyonundan sonra, hücrelerin izin verilen bir sıcaklıkta on gün boyunca büyümesine izin verilir, daha sonra burada görüldüğü gibi dizili bir formatta toplanır.

384 biçiminde elde edilen plakalar bir 1536 dizisinde birleştirilir. Chlamydomonas ts mutantları oluşturmak için üç UV maruz kalma süresi test edildi. Ampirik olarak, 1.5 dakikalık maruz kalma süresi en fazla ts mutantını verdi.

Bununla birlikte, açık ara farkla, bir dakikalık maruz kalma süresi, hücre döngüsü adaylarının çoğunu verdi. Bu deneyde, iki ardışık ts fenotip testi yapıldı ve yaklaşık 3000 ts mutantı izole edildi ve hızlandırılmış mikroskopi ile fenotipik olarak karakterize edildi. Burada görüldüğü gibi, yüksek derecede tekrarlayan genleri aşağı akışlı boru hattından çıkarmak için, yeni toplanan adaylara karşı ikiden fazla alele sahip önceden karakterize edilmiş genlerle tamamlama ve bağlantı testi yapıldı.

Bu koloniler sorgu ile hiçbir tamamlayıcılık göstermez ve bu nedenle sorgulanan gen için yeni bir ts alelidir. Bunlar genellikle daha fazla karakterizasyondan hariç tutulur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yüksek verimle yapılabilir.

Binlerce ts mutantı sadece iki veya üç mutajenez turunda izole edilebilir. TS mutantlarının izolasyonundan sonraki önemli bir adım, daha fazla çalışma için bir alt küme seçmektir ve ölümcül fenotiplerin aralığını görmek çok ilginçtir. Fenotipleme, moleküler işleve dair ipuçları sağlar ve ayrıca daha fazla çalışma için mutantlara öncelik vermemize yardımcı olur.

Mutantların genomlarında yüzlerce veya binlerce mutasyon olabileceğini unutmayın. Genellikle sadece biri nedenseldir, ancak bazen ts fenotipi için iki mutasyon gerekir ve bu tetra analizi ile belirlenebilir. Bu prosedürü takiben, nedensel mutasyonlar, havuzlanmış yeni nesil dizileme analizi ile tanımlanabilir Tanımlanan genler bazen işlevi düşündüren mutasyonlara sahip olacaktır veya bunlar yeni, bilinmeyen diziler olabilir, bu da ilginç ve heyecan vericidir.

Chlamydomonas, bitkiler aleminde hücre biyolojisini incelemek için müthiş bir model sistem olmuştur. Duyduğunuz prosedürler, bu organizmanın nispeten incelenmemiş olan temel süreçler için incelenmesini sağlamalıdır ve sonuçların daha geniş bitki krallığı için de geçerli olacağını umuyoruz.