Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde

Bu prosedürün genel amacı, bu organizmadaki temel genleri ve yolakları belirlemek için Chlamydomonas'taki sıcaklığa duyarlı letal mutasyonların izolasyonunu kolaylaştırmak amacıyla robotik sistemler ve standardize edilmiş analizler kullanmaktır. Ökaryotlardaki temel hücresel fonksiyonların hem korunumuna hem de farklılaşmasına ilgi duyuyoruz. Bunu ise, bu süreçlerdeki temel genleri bozan mutasyonlar ile incelemeyi tercih ediyoruz.

Bunun iyi çalışabilmesi için gerçekten kapsamlı bir mutant koleksiyonuna ihtiyacınız vardır ve duyacağınız yöntemler, böyle bir koleksiyon oluşturma yolumuzu göstermektedir. Bitkiler alemesinin bir temsilcisi olarak yeşil alg Chlamydomonas reinhardtii üzerinde çalışıyoruz. Bu tekniğin temel avantajı, sıcaklığa duyarlı öldürücü mutasyonların muhtemelen her temel yolakta bulunabilmesidir.

Bu yöntem, ön bilgi veya hedeflenmiş mutajenez gerektirmez. Mutasyona uğramış genin moleküler fonksiyonu, letal fenotipten hemenca çıkarılabilir. Bu durum, hücre döngüsü kontrolünün ötesindeki çeşitli siala yolaklarını bozan ilginç mutasyonları seçmemize yardımcı olur.

UV mutajenezi gerçekleştirmek için Chlamydomonas hücrelerini, 25 °C sıcaklıkta, ışık altında ve 100 RPM sallama hızında, 100 mililitre Tris-Asetat-Fosfat veya TAP içerisinde OD 750 değeri 0,2 ile 0,5 arasına gelene kadar kültürleyin. UV mutajenezi, metin protokolüne uygun olarak iki farklı genetik arka planda bağımsız olarak yürütülür. Hücrelerin canlı olduğunu ve kontaminasyon bulunmadığını doğrulamak için her kültürden bir örneği mikroskop altında inceleyin.

Ardından kültürü 0,003 OD 750 değerine seyreltin; suş modal olduğu ve ışığa yanıt olarak yönlü şekilde yüzdüğü için homojen yoğunluğu sağlamak amacıyla şişeyi alüminyum folyo ile sarın. Süspansiyon yoğunluğunu metin protokolüne göre ayarladıktan sonra, sıvı dağıtıcıya uygun küçük bir tüp kaseti takın ve kontaminasyonu önlemek için üretici talimatlarına uygun olarak sterilizasyon için bir dizi yıkama işlemi gerçekleştirin. Sekiz şırıinglı bir sıvı dağıtıcı kaseti kullanarak, kuru dikdörtgen plakalar üzerine her biri 2 µL olan 96'şar damladan dört set kültür dağıtın.

Tüm damlaların ince bir sıvı tabakası halinde birleşmesini sağlamak için plağın kenine hafifçe vurun ve ışığa maruz kalmayı önlemek için plakları hemen kapatın. Kuruduğunda, sağ kalanlar arasında optimal ts mutant verimi sağlayacak, ampirik olarak belirlenmiş süreler boyunca plakları germisid bir UV lambası altına yerleştirin. Ardından, plakları oda sıcaklığında sekiz ila 24 saat boyunca karanlığa aktarın.

Ardından plakaları, aydınlatmalı 21 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Kolonilerin büyüdüğü ancak henüz birbirleriyle birleşmediği yaklaşık 10 günün ardından, plakaları robotik koloni toplama işlemi için kaynak olarak ilgili yığına yükleyin. Sonrasında dikdörtgen plakalar üzerindeki 384'lü diziler için kolonileri toplayın ve bunları yaklaşık bir hafta boyunca aydınlatmalı 21 °C'de büyütün.

Bir replika ekim robotu kullanarak, 384'lük dizileri 1536'lık bir diziye yoğunlaştırın ve plakaların 21 °C'lik inkübatörde yaklaşık üç gün boyunca büyümesine izin verin. 1536'lık dizileri her birini iki plakaya gelecek şekilde replike edin ve birini 21 °C'lik inkübatöre, diğerini ise 33 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. 33 °C'de 24 saat bekledikten sonra, 33 °C'lik inkübatördeki plakaları önceden ısıtılmış yeni bir plaka setine replike edin ve bunları 33 °C'lik inkübatöre yerleştirin.

33 °C'de üç gün ve 21 °C'de beş gün büyüme sağlandıktan sonra, dokuz hizalama göstergesiyle işaretlenmiş bir ızgara plakayı fotoğraflamak için dijital bir kamera kullanın. Ardından, kesin yönlendirmeyi korumak için tüm plakalar sabit bir çerçeveye yerleştirilerek, 21 °C plakaları ve ardından bunlarla eşleşen 33 °C plakaları sırasıyla fotoğraflayın. Eşleştirilmiş 21 ve 33 derece plaka görüntülerini, arka planı yok etmek ve görüntüleri 1536'lık bir diziye bölmek için özel bir matte lab görüntü analiz yazılımı ile işleyin.

Program, tespit edilen biyokütleyi her konumdaki toplam piksel yoğunluğu olarak belirleyecektir. Yazılım tarafından oluşturulan seçili kolonlar listesini, tekli kolon toplama robotu için bir talimat dosyası olarak yükleyin. Ardından, kaynak ve hedef plakaları robotik talimatlarına göre hazırlayın ve robotun seçilen kolonları bir diziye toplamasını sağlayın.

Stok plak oluşturmak için hedef plakları yaklaşık beş gün boyunca 21 °C'lik inkübatöre yerleştirin. İkinci bir biyokütle birikim analizi gerçekleştirip metin protokolüne uygun olarak 100 blok plak replikasyonu yaptıktan sonra, 100 blok plakların taze kopyasını üç kopyaya çoğaltın. Robotta üçüncü plağın kurulumu ve kolonların noktalanmasının ardından, tarama plaklarındaki her noktanın bir bölgesinin sıfırıncı zamandaki foto-mikrograflarını çekin ve plakları inkübasyon için 33 °C'ye yerleştirin.

Tarama plakalarının 37 °C'lik inkübatörden çıkarılmasının ardından, farklı zaman noktalarında, her zaman noktasında aynı hücrelerin görüntülerini elde etmek için plaka tutucunun ve tabla kontrolcüsünün hassas bir şekilde kalibre edildiğinden emin olarak hızlıca foto-mikrograflar çekin. Mikroskobik görüntüleri analiz edin ve istenen kriterlere göre mutantları seçin. Her bir plakanın aynı çiftleşme tipine ve ilaç direncine sahip mutantları içerdiğinden emin olarak, seçilen final setini 96'lı dizili agar plaka üzerine noktalar halinde ekleyin.

Dizili kolonilerin büyük miktarlarını, 96 kuyucuklu mikroplakalarda azotsuz gamet indüksiyon ortamına aktarın. Gametogenezin gerçekleşmesi için plakaları yaklaşık beş saat boyunca ışık altında inkübe edin. Alternatif direnç kasetlerini taşıyan karşı çiftleşme tipindeki sorguları, gametogenez için azotsuz gamet indüksiyon ortamı içeren tüplere süspanse edin.

Hedef plaka üzerindeki örnekleri 20 µL'lik bir çiftleşme karışımı hacminde karıştırın. Işık altında yaklaşık 10 dakika bekledikten sonra, her kuyucuktan beş mikrolitreyi iki kez damlatın. Bir kez bağlantı testi için TAP plakasına, bir kez de komplementasyon testi için beş µM paro ve dokuz µM hygro içeren TAP plakasına damlatın.

Komplementasyon testi plaklarını inkübe ettikten sonra, ts fenotip tanımlaması için plakaları iki kopya halinde çoğaltın. Kolonileri metin protokolüne göre ts fenotipi açısından test edin. Chlamydomonas tek hücrelerinin ışınlanmasının ardından, hücrelerin izinlebilir bir sıcaklıkta on gün boyunca büyümesine izin verilir, ardından burada görüldüğü gibi dizili bir formatta seçilirler.

384 formatındaki sonuç plakaları, 1536'lık bir dizide birleştirilmiştir. Chlamydomonas ts mutantları oluşturmak için üç farklı UV maruziyet süresi test edilmiştir. Ampirik olarak, 1,5 dakikalık maruziyet süresi en fazla sayıda ts mutantını sağlamıştır.

Buna karşın, açık ara en fazla hücre döngüsü adayı bir dakikalık pozlama süresiyle elde edilmiştir. Bu deneyde, birbirini izleyen iki sıcaklık duyarlı (ts) fenotip analizi gerçekleştirilmiş ve yaklaşık 3000 ts mutanı izole edilerek zaman ayarlı mikroskopi ile fenotipik olarak karakterize edilmiştir. Burada görüldüğü üzere, sonraki aşamalarda tekrarlayan genleri ayıklamak için, yeni toplanan adaylar üzerinde, iki veya daha fazla alele sahip önceden karakterize edilmiş genlerle komplementasyon ve bağlantı testleri yapılmıştır.

Bu koloniler sorgulanan suş ile komplementasyon göstermez ve dolayısıyla sorgulanan gen için yeni ts alelleridir. Bunlar genellikle daha ileri karakterizasyon işlemlerinin dışında tutulur. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem yüksek kapasiteli bir şekilde gerçekleştirilebilir.

Sadece iki veya üç mutajenez turunda binlerce ts mutantı izole edilebilir. ts mutantlarının izolasyonundan sonraki kilit adım, daha ileri çalışmalar için bir alt küme seçmektir ve letal fenotiplerin çeşitliliğini görmek oldukça ilgi çekicidir. Fenotipleme, moleküler işleve dair ipuçları sağlar ve ayrıca mutantları ileri çalışmalar için önceliklendirmemize yardımcı olur.

Mutantların genomlarında yüzlerce veya binlerce mutasyon olabileceğini unutmayın. Genellikle sadece biri nedenseldir, ancak bazen ts fenotipi için iki mutasyon gerekir ve bu durum tetra analizi ile belirlenebilir. Bu prosedürü takiben, havuzlanmış örneklerin yeni nesil dizileme analizi ile nedensel mutasyonlar tanımlanabilir. Tanımlanan genlerin bazen işleve işaret eden mutasyonları olacaktır veya bunlar yeni, bilinmeyen diziler olabilir ki bu durum ilgi çekici ve heyecan vericidir.

Chlamydomonas, bitkiler aleminde hücre biyolojisini çalışmak için mükemmel bir model sistem olmuştur. Bahsettiğiniz prosedürler, bu organizmanın nispeten daha az incelenmiş olan temel süreçlerinin araştırılmasına olanak sağlayacaktır ve sonuçların daha geniş bitkiler alemi için de geçerli olacağını umuyoruz.