Sıvı olarak Genlik modülasyonu Atomik Kuvvet Mikroskobu ile alt nanometre Çözünürlüklü Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, genlik modülasyonu (vurma modu olarak da bilinir) ile çalıştırılan ticari bir AFM kullanarak sıvı ortamda mümkün olan en yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi elde etmektir. Bu yöntem, yüksek çözünürlük için en iyi parametre kombinasyonunu kullanarak sıvıdaki standart AFM çalışma sınırlarını zorlamaya yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, çoğu ticari AFM ile kullanılabilmesi ve bu nedenle herhangi bir uzmanlaşmış ekipman gerektirmemesidir.

Burada sunulan yöntem, AFM hakkında temel bilgiye sahip olan ancak bu teknikten daha fazla verim almak isteyen bilim insanlarına ve teknisyenlere yöneliktir. Bu yöntem belirli bir numune türünü hedeflememektedir ve fizik, biyoloji, kimya, malzeme ve servis bilimlerinden gelen numunelere geniş çapta uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniğe yeni başlayan kişiler zorluk yaşayabilirler; çünkü belirli bir numune için en iyi parametreleri bulmak sabır gerektirmektedir.

Enstrümanları ve substratı destekleyen diski ultra saf su içerisinde banyo sonikasyonuna tabi tutun. Ardından izopropanol ile ve tekrar ultra saf su ile, her biri 10 dakika boyunca işlemi tekrarlayın. Yüksek çözünürlük hedeflendiğinde, herhangi bir kontaminasyon yıkıcı sonuçlar doğurabilir.

Her zaman eldiven giyin ve numune, konsol veya AFM hücresi ile temas eden tüm yüzeylerin veya aletlerin iyice temizlendiğinden emin olun. Sonikasyondan sonra, aletlerin her birini ve numune diskini nitrojen akışı altında kurutun. Tekil olarak absorbe edilmiş metal iyonlarını görüntülemek için mika desteği olarak çelik bir disk kullanın.

Sonikasyonla temizlenemeyen yüzeyleri, sırasıyla ultra saf su, izopropanol ve ultra saf suya batırılmış tek katlı düşük havlı mendillerle silerek fiziksel olarak temizleyin. Yüzeyin 30 dakikaya kadar havada kurumasına izin verin. Ardından, reaktifleri iyice karıştırarak az miktarda epoksi yapıştırıcı hazırlayın ve temiz çelik numune diskine yaklaşık 10 µL epoksi yerleştirin.

Mika substratı epoksinin üzerine yerleştirin ve substrata basınç uygulayarak çelik diske sabitleyin. Epoksinin, üretici spesifikasyonlarına uygun olarak yüksek sıcaklıkta birkaç saat boyunca kürlenmesini bekleyin. Ardından, 2,5 santimetre genişliğinde bir yapışkan bandı, tüm yüzey kapanacak şekilde substratın üzerine sıkıca bastırın ve üst katmanı pürüzsüzce soyun.

Mika, gözle bakıldığında ayna pürüzsüzlüğüne erişene kadar bu işlemi iki ila üç kez tekrarlayın. Kantilever çipini önce 60 dakika boyunca izopropanol banyosuna, ardından 60 dakika boyunca ultra saf su banyosuna daldırın. Daha sonra, stabil hidratasyon bölgelerinin oluşumunu desteklemek için ucu beş dakikaya kadar UV ışığına maruz bırakın.

Daha uzun aşırı maruz kalma süreleri uca zarar verebilir veya eğrilik yarıçapını artırabilir. Kantileveri AFM'nin kantilever tutucusuna yerleştirin ve yüzeyi önceden ıslatmak için kantilever ile ucun üzerine 25 µL görüntüleme sıvısı pipetleyin. Bu işlem, numuneye yaklaşırken hava kabarcıklarının oluşumunu azaltacaktır.

Numune diskini ve alt tabakayı numune tablasına eriterek sabitleyin ve numuneye bir damla görüntüleme sıvısı ekleyin. Ardından, konsol tutucuyu AFM'ye bağlayın. Konsol ucu ile numune üzerindeki sıvılar arasında bir kapiler köprü oluşturacak şekilde, konsolu ve numuneyi birbirine yaklaştırın.

Ölçüm lazerini kantileverin uç kısmına yakın bir konuma hizalamak için AFM yazılımını kullanın. Ardından, kantileverin termal spektrumundaki ana tepeden rezonans frekansını belirleyin. Kantilever sapması kalibre edilmişse, rezonans tepesinin basit bir harmonik osilatör modeliyle fit edilmesi kantileverin yay sabitini verir.

Ardından, termal spektrumda belirlenen rezonans frekansına yakın bir frekans aralığında dışarıdan sürüldüğündeki genlik tepkisini bularak kantileveri ayarlayın. Serbest salınım genliği yaklaşık beş nanometre olacak şekilde sürme genliğini düzenleyin. Bu, çoğu AFM'de tipik olarak 0.2-0.8 volt'a karşılık gelir.

Ardından, genlik ayar noktasını serbest genliğin yaklaşık %80'ine ayarlayın. Sonrasında, geri besleme kazançlarını nispeten yüksek seviyeye getirin. Herhangi bir kararsızlık veya çınlama oluşmadığından emin olduktan sonra, başlangıç tarama hızını yaklaşık 1 Hz'e, tarama boyutunu ise 10 nm'ye ayarlayın.

AFM kontrol yazılımını kullanarak ucun yüzeye yaklaşmasını başlatın. Set point (ayar noktası) değerini hafifçe değiştirerek, görüntülemeye başlamadan ucun yüzeye ulaşıp ulaşmadığını değerlendirin. Eğer uç yüzeydeyse, ZPA bölgesinin uzaması üzerindeki etkisi ihmal edilebilir düzeyde olmalıdır.

Uç yüzeye ulaştığında, ZPA bölgesini geri çekin ve kantileveri yeniden ayarlayın. Uç-numune etkileşimleri nedeniyle rezonans frekansı muhtemelen daha düşük bir değere kaymış olacaktır. Şimdi, set noktasını yeni ayarlanan serbest genliğin yaklaşık %80'ine getirin ve görüntüleme parametrelerinin uygun olduğunu doğrulamak için genlik modülasyon modunda yüzeyin 10 x 10 nanometre karelik bir taramasını gerçekleştirmek üzere kantileveri devreye alın.

İleri ve geri tarama profillerinin üst üste bindiğini kontrol edin. Eğer binmiyorlarsa, set noktasını daha da düşürün ve kazançları artırmayı deneyin. Görüntü gürültülü hale gelirse, kazançları düşürün.

Mümkünse, işlemini numunenin büyük bir 1 ila 5 µm² bölgesinde tekrarlayın. Yumuşak veya biyolojik numunelerde bu durum, ucun kontamine olmasına neden olabilir. Tarama boyutunu, ilgilenilen özelliklerin görselleştirilmesine uygun bir değere düşürün.

Bu değer 20 x 20 nanometre kadar düşük olabilir. Ardından, geri besleme döngüsünün ZPA bölgesini otomatik olarak geri çekmesi ve ucu yüzeyden uzaklaştırması için kantileverin sürüş genliğini yeterince azaltın. Kantilever yüzeyden uzaktayken, kantilever genliği tepe değerden tepe değere bir ila iki nanometre olacak şekilde sürüş genliğini ayarlayın.

ZPA bölgesi tekrar yüzeye doğru genişleyene ve orijinal görüntü geri elde edilene kadar set noktasını küçük adımlarla kademeli olarak düşürün. Set noktası genliğini, yeni serbest genliğin %75 ile %95'i arasında tutun. Ardından, daha düşük genliklerde anlamlı bir gürültü oluşturmadan daha yüksek kazançlar kullanılabileceği için kazançları yeniden ayarlayın.

Yüksek çözünürlük için serbest genlik, set noktası ve kazancın en iyi kombinasyonunu bulmak üzere sistemi optimize edin. Optimum sistem koşulları; örneğe, sıvının ıslatma özelliklerine ve kullanılan kantilevere bağlıdır. Solvofilik ara yüzeyler için, yay sabiti 0.5 ile iki newton/metre arasında olan kantilevler kullanın.

Bu teknik kullanılarak, geniş bir numune yelpazesinde alt nanometre çözünürlüklü görüntüler elde edilmiştir. Burada gösterilen yumuşak numuneler arasında bir lipid çift katmanı, halobacterium salinarum'dan elde edilen mor membranlar, amfifilik dimoleküllerden oluşan kendi kendine organize olmuş bir tek tabaka ve sığır lens membranından elde edilen akuaporin kristalleri yer almaktadır. Her durumda, ilgilenilen özellikler vurgulanmıştır.

Küçük salınım genlikleri ve yüksek set noktaları, ucun numune üzerine uyguladığı kuvveti minimize ederek; çift tabakadaki lipidlerin, doğal biyomembranlardaki proteinlerin ve amfifilik moleküllerin oluşturduğu hassas kendi kendine düzenlenmiş yapıların, çözelti içinde hasar görmeden görüntülenmesine olanak tanır. Kalsit, stronsiyum titanit, silikon karbür gibi daha sert kristal malzemeler ve mika yüzeyine absorbe olmuş tekil metal iyonları da bu yaklaşımla görüntülenebilir; çünkü her durumda, etkili bir şekilde görüntülenen şey kristalin kendisi değil, ara yüzeydeki sıvıdır. Uzmanlaşıldığında bu teknik, doğru şekilde uygulandığı neredeyse her seferinde sıvı ortamda moleküler veya atomik düzeyde çözünürlük sağlar.

Bu prosedürü uygularken, görüntülenen kısmın ara yüzey sıvısı olduğunu akılda tutmak önemlidir. Bu durum, yumuşak görüntüleme koşullarının kullanılmasını gerektirir. Ucun, numunenin veya sıvının kontamine olması, genellikle yüksek çözünürlüğe ulaşılamamasının temel nedenidir.

Herhangi bir şüphe durumunda, sıvı ile temas eden tüm yüzeylerin temizlenmesi ve görüntüleme solüsyonlarının yeniden kullanılması genellikle iyi bir fikirdir. Dış gürültü de yüksek çözünürlük için zararlıdır. Havalandırma kanalından uzak, düşük titreşimli bir zemin daha uygundur.

Bu videoyu izledikten sonra, yüksek çözünürlüklü AFM elde etmek için görüntüleme parametrelerinizi nasıl optimize edeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Elbette, tüm ileri teknoloji tekniklerinde olduğu gibi, bir numuneyi en iyi nasıl görüntüleyeceğinizi belirlemek birkaç deneme gerektirebilir, bu nedenle sabır anahtar faktördür.