Sıvı olarak Genlik modülasyonu Atomik Kuvvet Mikroskobu ile alt nanometre Çözünürlüklü Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, kılavuz çekme modu olarak da bilinen ticari bir AFM ile çalıştırılan ve genlik modülasyonu ile sıvıda mümkün olan en yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi elde etmektir. Bu yöntem, yüksek çözünürlük için en iyi parametre kombinasyonunu kullanarak sıvıda standart AFM işleminin sınırını zorlamaya yardımcı olur. Bu tekniğin ana avantajı, çoğu ticari AFM ile kullanılabilmesidir ve bu nedenle herhangi bir özel ekipman gerektirmez.

Burada sunulan yöntem, halihazırda AFM hakkında bazı temel bilgilere sahip olan, ancak teknikten daha fazla yararlanmak isteyen bilim adamlarına ve teknisyenlere yöneliktir. Bu yöntem belirli bir numune türüne yönelik değildir ve fizik, biyoloji, kimya, malzeme ve hizmet bilimlerinden gelen numunelere geniş ölçüde uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler mücadele edecektir, çünkü belirli bir numune için en iyi parametreleri bulmak biraz sabır gerektirir.

Banyo aletleri sonikat ve substratı destekleyen diski ultra saf suda sonikleştirin. Ardından izopropanol ve yine ultra saf su, her biri 10 dakika. Yüksek çözünürlüğü hedeflerken, herhangi bir kontaminasyonun zararlı sonuçları olabilir.

Her zaman eldiven giyin ve numune, konsol veya AFM hücresi ile temas eden tüm yüzeylerin veya aletlerin iyice temizlendiğinden emin olun. Sonikasyondan sonra, aletlerin her birini ve örnek diski bir azot akışı altında kurutun. Tek emilen metal iyonlarını görüntülemek için mika desteği olarak çelik bir disk kullanın.

Sonikasyonla temizlenemeyen yüzeyleri, sırayla ultra saf su, izopropanol ve ultra saf suya batırılmış tek katlı düşük tiftikli dokularla silerek fiziksel olarak temizleyin. Yüzeyin 30 dakikaya kadar havada kurumasına izin verin. Daha sonra, reaktifleri iyice karıştırarak az miktarda epoksi yapıştırıcı hazırlayın ve temiz çelik numune diskine yaklaşık 10 mikrolitre epoksi yerleştirin.

Mika alt tabakayı epoksinin üzerine yerleştirin ve alt tabakaya baskı uygulayarak çelik diske yapıştırın. Epoksinin, üretici spesifikasyonlarına göre yüksek bir sıcaklıkta birkaç saat kürlenmesine izin verin. Ardından, 2,5 santimetre genişliğinde bir yapışkan bant parçasını alt tabakaya sıkıca bastırın, böylece tüm yüz kaplanır ve üst tabakayı düzgün bir şekilde soyun.

Mika göze tam olarak bakacak kadar pürüzsüz olana kadar bu işlemi iki ila üç kez tekrarlayın. Konsol çipini bir isapropanol banyosuna ve ardından her biri 60 dakika boyunca ultra saf suya daldırın. Ardından, stabil hidrasyon bölgelerinin oluşumunu desteklemek için ucu beş dakikaya kadar UV ışığına maruz bırakın.

Daha uzun aşırı pozlama süreleri uca zarar verebilir veya eğrilik yarıçapını artırabilir. Konsolu AFM'nin konsol tutucusuna yerleştirin ve yüzeyi önceden ıslatmak için 25 mikrolitre görüntüleme sıvısını konsol ve uca pipetleyin. Bu, numuneye yaklaşırken hava kabarcıklarının görünümünü azaltacaktır.

Numune diskini ve alt tabakayı numune tablası üzerine eritin ve numuneye bir damla görüntüleme sıvısı ekleyin. Ardından konsol tutucuyu AFM'ye bağlayın. Konsol ve s'yi getirinample, konsol ucundaki sıvılar ile numunedekiler arasında bir kılcal köprü oluşturacak şekilde yakınlaştırın.

Ölçüm lazerini konsolun uç ucuna yakın hizalamak için AFM yazılımını kullanın. Ardından, termal spektrumundaki ana zirveden konsolun kalma frekansını bulun. Konsolun sapması kalibre edilirse, konut tepe noktasının basit bir harmonik osilatör modeli ile takılması, konsolun yay sabitini verir.

Ardından, termal spektrumda tanımlanan rezonans frekansına yakın bir frekans aralığında harici olarak sürüldüğünde genlik tepkisini bularak konsolu ayarlayın. Sürüş genliğini, serbest salınım genliği yaklaşık beş nanometre olacak şekilde ayarlayın. Bu tipik olarak çoğu AFM'de 0.2-0.8 volta karşılık gelir.

Ardından, genlik ayar noktasını serbest genliğin yaklaşık %80'ine ayarlayın. Ardından, geri bildirim kazanımlarını nispeten yüksek ayarlayın. Herhangi bir kararsızlık veya çınlama olmadığından emin olduktan sonra, ilk tarama hızını yaklaşık bir hertz'e ve tarama boyutunu 10 nanometreye ayarlayın.

AFM kontrol yazılımını kullanarak ucun yüzeye yaklaşmasını başlatın. Ayar noktası değerini biraz değiştirerek görüntünün başlamadan ucun yüzeye ulaşıp ulaşmadığını değerlendirin. Uç yüzeyde ise, ZPA bölgesinin uzaması üzerindeki etki ihmal edilebilir olmalıdır.

Uç yüzeye ulaştığında, ZPA bölgesini geri çekin ve konsolu yeniden ayarlayın. Rezonans frekansı, uç numune etkileşimleri nedeniyle muhtemelen daha düşük bir değere kaymış olacaktır. Şimdi, ayar noktasını yeni ayarlanmış serbest genliğin yaklaşık% 80'ine değiştirin ve görüntüleme parametrelerinin uygun olduğunu doğrulamak için genlik modülasyon modunda yüzeyin 10 x 10 nanometre kare taramasını yapmak için konsolu devreye sokun

İzleme ve yeniden izleme profillerinin üst üste binip binmediğini kontrol edin. Değilse, ayar noktasını daha da azaltın ve kazançları artırmayı deneyin. Görüntü gürültülü hale gelirse, kazançları düşürün.

İşlemi, mümkün olması koşuluyla, numunenin bir ila beş mikrometre karelik büyük bir bölgesi ile tekrarlayın. Yumuşak veya biyolojik numunelerde bu, ucun kontaminasyonuna neden olabilir. Tarama boyutunu, ilgilenilen özellikleri görselleştirmek için uygun bir değere düşürün.

Bu, 20 x 20 nanometre kadar düşük olabilir. Ardından, geri besleme döngüsünün ZPA bölgesini otomatik olarak geri çekmesi için konsolun tahrik genliğini azaltın, ucu yüzeyden güçlendirin. Konsol yüzeyden uzaktayken, sürücü genliğini, konsol genliği tepeden tepeye bir ila iki nanometre olacak şekilde ayarlayın.

ZPA bölgesi tekrar yüzeye doğru genişleyene ve orijinal görüntü kurtarılana kadar ayar noktasını küçük adımlarla kademeli olarak azaltın. Ayar noktası genliğini yeni serbest genliğin %75 ila %95'i arasında tutun. Ardından, kazançları yeniden ayarlayın, çünkü daha yüksek kazançlar, önemli bir gürültü oluşturmadan daha düşük genliklerde kullanılabilir.

Yüksek çözünürlük için en iyi serbest genlik, ayar noktası ve kazanç kombinasyonunu bulmak için sistemi optimize edin. Optimum sistem koşulları numuneye, sıvının ıslatma özelliklerine ve ayrıca kullanılan konsola bağlıdır. Solvofilik arayüzler için, yay sabiti metre başına 0,5 ila iki Newton olan konsollar kullanın.

Bu teknik kullanılarak, geniş bir numune yelpazesi üzerinde nanometre altı çözünürlüklü görüntüler elde edildi. Burada gösterilen yumuşak numuneler arasında bir lipid çift tabakası, halobacterium salinarum'dan mor zarlar, kendi kendine monte edilmiş bir amfofilik dimolekül tek tabakası ve bir sığır merceği zarından aquaporin kristalleri bulunur. Her durumda, ilgilenilen özellikler vurgulanır.

Küçük salınım genlikleri ve yüksek ayar noktaları, ucun numune üzerine uyguladığı kuvveti en aza indirerek, çift tabakadaki lipitlerin, doğal biyomembranlardaki proteinlerin ve amfofilik moleküllerin kırılgan kendi kendine montajlarının çözelti içinde hasar görmeden görüntülenmesine olanak tanır. Mika yüzeyinde emilen kalsit, stronsiyum titanit, silisyum karbür ve tek metal iyonları gibi daha sert kristal malzemeler bu yaklaşım kullanılarak görüntülenebilir, çünkü her durumda, kristalin kendisi değil, etkili bir şekilde görüntülenen arayüzey sıvısıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, hemen hemen her doğru şekilde gerçekleştirildiğinde sıvıda moleküler veya atomik düzeyde çözünürlük sağlar.

Bu prosedürü denerken, görüntülenenin arayüzey sıvısı olduğunu akılda tutmak önemlidir. Bu, yumuşak görüntüleme koşullarının kullanılması anlamına gelir. Ucun, numunenin veya sıvının kirlenmesi genellikle yüksek çözünürlük elde edememenin ana nedenidir.

Herhangi bir şüpheniz varsa, sıvıyla temas eden tüm yüzeyleri temizlemek ve görüntüleme solüsyonlarını yeniden kullanmak genellikle iyi bir fikirdir. Dış gürültü de yüksek çözünürlük için zararlıdır. Havalandırma kanalından uzakta, düşük titreşimli bir zemin daha iyidir.

Bu videoyu izledikten sonra, yüksek çözünürlüklü AFM elde etmek için görüntüleme parametrelerinizi nasıl optimize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Tabii ki, herhangi bir son teknoloji teknikte olduğu gibi, bir örneğin en iyi şekilde nasıl görüntüleneceğini anlamak birkaç deneme gerektirebilir, bu nedenle sabır çok önemlidir.