Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bu protokolün genel amacı, filamentli hifler üzerinde bakteriyel biyofilm oluşumunu analiz etmek için mikroskopi kullanmaktır. Bu yöntem, mikrobiyoloji alanındaki bakteriyel biyofilmin hifler üzerinde nasıl oluştuğu, ne kadar spesifik oldukları ve neyden yapıldıkları gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mantar hifleri üzerinde bakteriyel biyofilm oluşumunun nanometreden santimetre aralıklarına kadar çoklu ölçeklerde araştırılmasına izin vermesidir.

Prosedürün gösterilmesi laboratuvarımdan Cora Miquel Guennoc ve INRA PTEF Platformundan elektron mikroskobu mühendisi Christophe Rose tarafından yapılacak. Başlamak için, Petri kapları ile aynı çapta selofan zarları hazırlayın, ardından bunları 30 dakika kaynar EDTA'ya koyun. Daha sonra tabakaları durulamak için deiyonize su kullanın ve iki kez otoklavlayın.

Mantar ön kültürlerini hazırlamak için, mantarı EDTA ön işleme tabi tutulmuş bir selofan zarı ile kaplanmış agar ortamına aşılayın. Yaklaşık bir santimetre çapında koloniler elde etmek için kültürleri optimum sıcaklıkta inkübe edin. Ön kültürden, bir ön kültür kolonisinin dış alanını nazikçe çizmek için bir neşter kullanarak EDTA selofan zarı ile kaplanmış uygun agar ortamındaki bir Petri kabını aşılayın ve ardından hifleri agar plakasına aktarın.

Kolonilerin çapı yaklaşık bir santimetre olana kadar plakaları optimum sıcaklıkta inkübe edin. P.fluorescens BBc6 gibi bakteri kültürleri hazırlamak için, agar ortamından iki ila üç ayrı bakteri kolonisi toplamak için steril bir halka kullanın ve 25 mililitre LB aşılayın. Kültürü gece boyunca optimum sıcaklıkta inkübe edin. Bakterileri gece boyunca büyüttükten sonra, kültürü üç dakika boyunca 5.000 kez g'de santrifüjleyin.

Ve sonra peleti 25 mililitre steril 0.1 molar potasyum fosfat tamponu içinde askıya alın. Santrifüjlemeyi tekrarladıktan sonra, nihai bakteri konsantrasyonunu mililitre başına 10 ila dokuzuncu hücreye ayarlamak için aynı tamponu kullanın. Altı oyuklu bir mikroplakayı beş mililitre bakteri süspansiyonu ile doldurun.

Mantar kültürünün selofan zarını, her zarda tek bir koloni olacak şekilde kareler halinde kesmek için steril bir tıraş bıçağı kullanın. Daha sonra, forseps ile, hif içeren selofan karelerini katı ortamdan dikkatlice çıkarın ve bunları bakteri süspansiyonunun ayrı ayrı kuyucuklarına aktarın. Mantar kolonileri selofandan ayrılana kadar mikroplakayı hafifçe sallayın.

Daha sonra selofan tabakalarını çıkarın ve mantar kolonilerini plakada bırakın. Mikroplakayı, kullanılan suşlara ve analiz edilecek aşamaya bağlı olarak bir süre 20 santigrat derecede hafif çalkalama ile inkübe edin. P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor için, erken evre biyofilmler elde etmek için kültürleri 30 dakika ve olgun biyofilmler için 16 saate kadar inkübe edin.

Planktonik bakterileri ve hiflere elektrostatik olarak bağlı bakterileri uzaklaştırmak için, mantarı güçlü tuz çözeltisi ile doldurulmuş yeni bir altı oyuklu mikroplakaya aktararak durulayın. Plakayı bir dakika boyunca hafifçe sallayın. Mantarı, beş mililitre steril 0.1 molar potasyum fosfat tamponu içeren altı oyuklu yeni bir mikroplakaya aktarın.

Plakayı iki dakika boyunca hafifçe çalkalayın ve ardından mantarı taze tampona aktarın. Mantar kolonisini tamponda tutarken, koloniyi yaklaşık olarak ikiye kesmek için bir neşter kullanın. Boyanacak koloninin yarısını, Alexa Fluor 633'e konjuge buğday tohumu aglütinini gibi mantar ağını görselleştirmek için uygun bir floresan boya ile desteklenmiş bir mililitre steril su içeren bir Petri kabına aktarın.

Daha sonra numuneyi karanlıkta inkübe edin. Boyamadan sonra, numuneyi 10 mililitre steril 0.1 molar potasyum fosfat tamponu içeren bir Petri kabı kapağına aktararak durulayın ve bir dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Petri kabı kapağına bir sürgünü yarıya batırın ve kesilen bölümü sürgünün üzerinde yüzecek şekilde hassas bir şekilde konumlandırın.

Ardından, slaytı tampon çözeltisinden yavaşça kaldırın ve numunenin lam üzerine nazikçe yerleşmesine izin verin. En hassas yönü, numunenin slayt üzerindeki konumlandırılmasıdır. Biyofilm tanımından kaçınmak için, numune konumlandırılırken numune ve lam daldırılmalı ve görüntülemeden önce numune daha fazla hareket ettirilmemelidir.

Son olarak, numuneye 10 mikrolitre solma önleyici montaj ortamı ekleyin ve üzerini bir cam kapak kayma ile kapatın. Slaytları 10x veya 40x objektifli konfokal lazer mikroskobu altında inceleyin. Mantar kolonisinin ve biyofilmlerin küresel, 3D görünümlerini elde etmek için döşeme taraması ve Z-yığını işlevlerinin bir kombinasyonunu kullanın.

Elektron mikroskobu yapmak için, mantarı daha önce olduğu gibi güçlü tuz çözeltisinde duruladıktan sonra, dehidrasyon aşaması sırasında tuz kristallerinin oluşumunu önlemek için mantarı tampon yerine steril suya aktarın. Biyofilmleri bir numune tutucuya aktarın ve fazla suyu alın. Ardından, numuneleri değişken basınçlı taramalı elektron mikroskobunun odasına aktarın.

Bir Peltier soğutma aşamasında, numuneyi eksi 50 santigrat dereceye kadar dondurun ve 15 saat boyunca ayarlanmış 100 Paskal değişken basınçla doğrudan SEM odasında yavaşça donarak kurumasına izin verin. Numuneyi alın ve yüksek vakumlu bir film biriktirme sistemine aktarın. Daha sonra numuneyi argon plazma altında iki nanometre platin ile kaplayın.

Kaplanmış numuneyi bir taramalı elektron mikroskobu ile, yüksek çözünürlüklü lens içi dedektörü kullanan bir alan emisyon tabancası ve bir kilovoltluk elektronik yüksek gerilim ile gözlemleyin. Biyofilmlerin bu mezo ölçekli analizi, P.fluorescens BBc6'nın biyofilminin, kırmızı ile gösterilen L.bicolor S238N'nin hifleri üzerinde yeşil renkteki heterojen dağılımını göstermektedir. Analiz ayrıca, kırmızı ile gösterilen hiflere yalnızca bazı GFP etiketli bakterilerin bağlandığı erken adımlardan kalın, olgun bir biyofilm oluşumuna kadar zaman içinde biyofilm oluşumunun izlenmesini de mümkün kılmıştır.

Burada gösterildiği gibi, yüksek çözünürlüklü mezo ölçekli görüntüler, koloni mimarileri elde etmek için mikro ölçekli analizler yapmak için de kullanıldı. Ek olarak, bu yüksek çözünürlükte, 3D konfokal bir görüntünün 2D maksimum yoğunluk projeksiyonu, kırmızı ile gösterilen SYPRO Ruby ile özel etiketleme, GFP etiketli BBc6 bakterileri ve koyu yeşil renkte FUN-1 etiketli mantar ile matristeki proteinlerin varlığını gösterir. Aynı numunenin dehidrasyonu ve kodlanmasından sonra, SEM görüntüleme ile biyofilm yapısının daha fazla detayı elde edildi.

Yeşil ok uçları biyofilmdeki bakteri hücrelerine, sarı ok uçları ise mantar hiflerine işaret eder. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, biyofilm oluşumu ve mikroorganizma kültürü için inkübasyon süresini saymadan, bir numune için yaklaşık iki buçuk saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, yöntemin başarısının büyük ölçüde sadece birkaç kat hifden oluşan çok ince mantar kolonileri elde etme yeteneğine bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, mutajenez veya in situ hibridizasyon gibi diğer yöntemler, biyofilmin fonksiyonel veya kimyasal karakterizasyonu gibi ek soruları yanıtlamak veya çok türlü biyofilmleri incelemek için kullanılabilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, tıp, çevre bilimi, gıda endüstrisi ve benzeri birçok alandan araştırmacıların mantar bakteri etkileşimleri sırasında biyofilm oluşumunu keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, mantar hifleri üzerinde bakteriyel biyofilm oluşumunun nasıl büyütüleceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.