Yüksek throughput ve Çok parametrik Nicelik için iki Algoritmalar Drosophila Nöromusküler Junction Morfoloji

Bu prosedürün genel amacı, morfometrik yazılım makrolarını kullanarak Drosophila nöromüsküler kavşağının morfolojik özelliklerini otomatik olarak ölçmektir. Bu yöntem, nörobiyolojide önemli bir soru olan sinaps gelişiminin düzenleyicilerini tanımlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, çoklu NMJ özelliklerinin otomatik olarak ölçülmesidir.

Bu, NMJ morfolojisinin yüksek ila put'ta objektif analizine izin verir. NMJ morfolojisini çok sayıda hastalık modelinde araştırabilmek için bu metodolojiyi geliştirmeye karar verdik. Kişisel farklılıklarını nasıl önleyebileceğimizi ve nicelik belirleme sürecini nasıl önemli ölçüde hızlandırabileceğimizi düşündük.

Bu yöntemin görsel gösterimi çok faydalıdır. Uygun makro ayarları çok önemlidir ve özellikle VT yazılımına aşina olmayan yeni kullanıcılar için bazı adımlar zor olabilir. Bu protokol için, NMJ'lerin görüntü yığınlarını oluşturun ve bunları, birinci kanalın DLG1 boyamayı veya benzer bir işaretleyiciyi gösterdiği ve ikinci kanalın BRP boyamayı gösterdiği ayrı TIFF dosyaları olarak kaydedin.

Başlamak için, NMJ görüntü dosyalarının C projeksiyonlarını ve hiper yığınlarını oluşturun. Eklenti seçeneklerini açın ve Drosophila NMJ Morphometrics'i seçin. Şimdi, mikroskobun TIFF olarak kaydederken görüntü serisine atadığı benzersiz dosya dizesini tanımlayın.

Bu, resim adının sonunda olacaktır. En düşük düzleme ve kanal numarasına verilen dizeyi kopyalayıp benzersiz dosya dizesi ayar penceresine yapıştırın. Ardından, yığına dönüştür alt makrosunu seçin ve görüntülerin bulunduğu dizini veya klasörü seçin.

Her görüntü dosyası için, varsayılan yığın ve düz yığın adlarıyla iki yeni dosya oluşturulur ve ardından orijinal görüntü adı gelir. Depolama alanından tasarruf etmek için orijinal dosyalar daha sonra silinebilir. Ardından, Drosophila NMJ Morphometrics arayüzünden ROI alt makrosunu tanımla'yı seçin ve görüntü dosyası dizinini seçin.

İlk projeksiyon açıldığında serbest el seçimleri aracını seçin. Ardından, ilgilenilen tam bir NMJ terminali içeren bir bölge tanımlamak için fareyi kullanın. Seçildikten sonra, terminal tanımla penceresinde Tamam'a tıklayın.

NMJ terminalleri tüm projeksiyonlarda tanımlanana kadar bunu yapmaya devam edin. Makro işlemi otomatik olarak ilerletir. Her görüntü dosyası için, varsayılan adlar ROI ve ardından orijinal görüntü adıyla yeni bir dosya oluşturulur.

NMJ özelliklerini ölçmek için önce Drosophila NMJ Morphometrics arayüzüne gidin ve ölçeği ayarlayın. Örneğin, görüntüdeki bir piksel 0,72 mikrona karşılık geliyorsa, ölçek piksellerini bire ve ölçek mesafesini 0,072'ye ayarlayın. Ardından alt makro analizini seçin ve iki kanal görüntüsü varsa, ağırlığı da değiştirin.

Tamam'a basın ve istendiğinde görüntü dosyası dizinini seçin. İşlem süresi sinaps başına birkaç dakika olabilir. Analizden sonra, analiz edilen her sinaps için yeni görüntü dosyaları ebeveyn klasöründe saklanır ve kantitatif ölçümler sonuçlardır.

txt dosyası. Tüm resimleri inceleyin ve segmentasyon hataları olan resimleri hariç tutun. Örneğin, sinaptik terminalin parçaları sarı anahatta dahil edilmeyebilir.

Arka planın bazı kısımları sinaptik terminale dahil edilebilir. Mavi bir iskelet hattı sinaptik terminalin ötesine uzanabilir. Çok fazla etkin bölge olabilir veya bazı etkin bölgeler algılanmamış olabilir.

Görüntülerin %5'inden fazlasında segmentasyon hataları varsa, görüntü işlemeyi iyileştirmek için farklı analiz algoritmalarını keşfedin. Sonraki video bölümlerinde, bu makro çözümleme ayarlarının birçoğunun nasıl tanımlanacağı açıklanmaktadır. Makro için yuvarlanan top yarıçapı değerini ayarlamak için, görüntü veri kümesini temsil eden üç NMJ Z projeksiyonu seçin.

Daha önce alt makro analizi tarafından oluşturulan sonuç res görüntü adını ve iki etkin bölge yığın görüntü adını silin. Seçilen her görüntü için yığın görüntüsü ad dosyalarını açın ve ardından araç çubuğundan Kanalları Böl'ü seçerek birinci kanalın görüntüsünü ve ikinci kanalın görüntüsünü oluşturun ve bu dosyaları kaydedin. Bu durumda DLG bir immün etiketlemeye karşılık gelen birinci kanala ait görüntüyü açın.

Şimdi, işlem sekmesinin altında bulunan filtre çıkarma arka planını çalıştırın. Yuvarlanan top yarıçapını, sinaps ve arka plan arasındaki kontrastı artıran bir değere ayarlayın. Projeksiyon türü maksimum yoğunluk olarak ayarlanmış bir Z projeksiyonu oluşturun ve görüntüyü kaydedin.

Ardından, tüm Z projeksiyonlarında yeni yuvarlanan top yarıçapı ile arka plan çıkarma algoritmasını çalıştırın ve sonuçları kaydedin. Makro için en iyi otomatik eşikleri belirlemek için, kaydedilen C projeksiyonlarını açın ve tümünü dene seçeneğiyle otomatik eşiği çalıştırın. Elde edilen görüntülerden, görüntüler için en uygun algoritmayı bulun ve daha fazla görüntü için makroyu çalıştırırken bu eşik ayarını kullanarak devam edin.

Farklı otomatik eşikleri tanımlamak, makro tarafından uygun görüntü segmentasyonu için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, tabela parametrelerinin sekizini doğru bir şekilde ölçmek için, yazılım tarafından sunulan 16 otomatik eşik seçeneğine aşina olmak önemlidir. Otomatik eşiğin sonuç görüntüsünü yakınlaştırmak için artı düğmesine basın.

Algoritma adları, her sonuç görüntüsünün altında bulunur. Bu örnekte, NMJ anahat eşiğini ayarlamak için en iyi otomatik eşik algoritması Huang'dır. İskelet eşiği için en iyi ayar Li'dir ve aktif bölge eşiği için en iyi ayar Huang'dır.

Makro için ince maksimum gürültü toleransı değerini tanımlamak için, orijinal temsili NMJ görüntülerine geri dönün. BRP kanalını açın. Açılır menüdeki eklentiler sekmesine gidin ve maksimum 3D'yi seçin.

Kısa bir süre sonra yeni bir görüntü görünecek ve ardından orijinal görüntüyü kapatacaktır. Ardından, minimum 3D komutunu kullanın. Ardından, en fazla C2 yığını bir görüntüyü kapatın, bir görüntüyü sinaps yapın ve yeni oluşturulan en az en fazla C2 yığını sinaps birini seçin.

Şimdi find maxima komutunu kullanın. Yeni pencerede önizleme noktası seçimini seçin ve gürültü toleransını 50 olarak ayarlayın. Maksimum noktalar daha sonra yalnızca sinaps aktif bölgelerini kapsaması gereken küçük çarpı işaretleriyle gösterilir.

Çok fazla çarpı işareti yapılırsa, gürültü tolerans değerini artırın. Etkin bölgelerden bazılarına açıklama eklenmemişse, gürültü toleransı değerini azaltın. Makronun maksimum gürültü toleransını bul alanı için türetilmiş eşik değerini kullanın.

Maksimum gürültü toleransı değerini seçerken, aktif bölgelerin sayısını doğru bir şekilde ölçmek önemlidir. Bazen doğru olanı tanımlamak için farklı değerler denemek gerekir. Şimdi, makro arayüzündeki eşik algoritmalarında türetilmiş tüm değerleri ayarlayın ve başlangıçta makro ayarlarını tanımlamak için kullanılan temsili görüntüler üzerinde alt makro analizini çalıştırın.

Beyaz noktalarla gösterilen aktif bölgelere sahip yeni bir dosya oluşturulacaktır. Bu dosyayı araç çubuğuna sürükleyip bırakarak ve bazı dilimler olarak bir projeksiyon türüne sahip Z projesini seçerek açın. Böylece bir projeksiyon dosyası yapılmış olur.

Bir sonraki adım, eşiği ayarlamaktır. Yeni eşik penceresinde, istenen tüm odakların okunduğu bir eşik değeri seçmek için üst çubuğu kaydırın. Bunlar BRP'nin pozitif noktalarıdır.

Bu değeri BRP puncta alt eşiği olarak kullanın. Şimdi, önceden tanımlanmış değerleri, algoritmaları ve ardından yeni BRP puncta alt eşik değerini kullanarak orijinal temsili NMJ görüntüleri üzerinde analizi yeniden çalıştırın. Ortaya çıkan görüntüler kritik analiz kriterlerini karşılamalıdır.

Şimdi, makroyu aynı koşullar altında elde edilen tüm NMJ görüntülerinde çalıştırmak için tanımlama ayarlarını kullanın. Drosophila NMJ morfometrik makrosu, üç mutant genotipte bilinen farklı sinaptik kusurları doğrulamak için kullanıldı. Ankyrin'in iki mutantının kaynaşmış butonlara ve daha küçük NMJ'lere sahip olduğu bilinmektedir.

Makro kullanılarak, panuronil ve quirin'in alanı ve çevresi, iki RNAI knock down NMJ'leri ölçüldü ve kontrollerden önemli ölçüde daha küçük olduğu bulundu. GTPase Rab3, uygun bruckpila dağılımı için gereklidir. Bozulduğunda daha az aktif bölge vardır.

Makro panuronil Rab 3 knock down sinekleri, kontrollerde tespit edilen 290'a kıyasla NMJ terminali başına ortalama 138 aktif bölgeye sahipti. Yüksek tel, NMJ büyümesinin önemli bir düzenleyicisidir ve mutasyona uğradığında NMJ'ler terminallerinde dallanmayı uzatır. Makro panuronil yüksek telli RNAI yıkma hatlarını kullanarak, NMJ'lerinde toplam uzunluk, en uzun dal uzunluğu, dal sayısı ve dallanma noktası sayısı dahil olmak üzere çeşitli iskeletten türetilmiş parametrelerde önemli artışlar gösterdi.

Bu videoyu izledikten sonra, Drosophila NMJ morfometri makrosunun nasıl çalıştırılacağını ve ayarlarının nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, 50 sinapsın analizi bir saat içinde yapılabilir. Bu, sinaps başına yaklaşık 15 dakikalık niceleme süresi tasarrufu sağlar.

NMJ'nin kaliteli görüntülerini elde etmek önemlidir. Görüntüler ne kadar iyi olursa, makro o kadar iyi performans gösterir. Bu teknik, nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların Drosophila NMJ'nin morfolojik parametrelerini verimli bir şekilde ölçmelerine yardımcı olacaktır.