Hücre Hatlarından Küresel Üretim: Üç Boyutlu (3D) Bir Hücre Kültürü Yöntemi

İstenen hücre hattını yapışkan bir 2D tek katman olarak büyütün. Kültür ortamını çıkarın ve fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın. Ardından, tripsin ekleyin ve hücreler şişe yüzeyinden ayrılırken ve yuvarlak şekilli hale gelirken inkübe edin. Tripsini nötralize etmek ve hücreleri askıya almak için taze ortam ekleyin. Karışımı konik bir tüpe aktarın ve hücreleri peletlemek için bir santrifüj kullanın.

Süpernatanı taze ortamla değiştirin ve hücrenin peletini yeniden süspanse edin. Hücre sayılarını saymak ve çalışma konsantrasyonunu hesaplamak için bir hemositometre kullanın. Ardından, doğru miktarda hücre karışımını yuvarlak tabanlı ultra düşük yapışma özelliğine sahip bir kuyu plakasına aktarın ve inkübe edin. Hücreler dibe çöker ve toplanır. Sonunda birbirlerine bağlanacaklar ve kompakt bir 3D hücre düzeneği olan sferoid oluşturacaklar.

Örnek protokolde, bir kolon kanseri hücre hattından 3D sferoidlerin nasıl oluşturulacağını ve oluşumlarını izlemek için canlı görüntülemenin nasıl uygulandığını göreceğiz. İlgilenilen kolorektal kanser hücre hattını beş mililitre PBS ile yıkayarak ve hücreleri şişenin tabanından 0.5 mililitre tripsin ile 37 santigrat derecede beş dakika boyunca çıkararak başlayın. Mikroskop altında ayrılmayı onayladıktan sonra, hücre ayrışma enzimini 10 mililitre tam ortam ile nötralize edin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peletleri saymak için beş mililitre taze tam ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri mililitre konsantrasyonunda 1.5 kez 10 ila üçüncü hücrelerde yeniden süspanse edin.

Daha sonra, 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir plakanın her bir oyuğuna 20 mikrolitre hücre ekin ve plakayı% 5 CO2 ve% 95 nem ile 37 santigrat derece inkübatörün içindeki otomatik bir görüntüleme cihazına yerleştirin. Cihazın edinme yazılımına giriş yapın ve Almak İçin Planla, Gemi Ekle, Programa Göre Tara ve Yeni Gemi Oluştur'u seçin. Ardından, Tarama Türü, Küre'yi seçin ve ilgilendiğiniz uygun Brightfield ve Floresan kanallarını seçin. Büyütmeyi 10 kata ayarlayın ve plaka modelini ve görüntüleme cihazı çekmecesi içindeki konumunu seçin. Görüntülenecek kuyucukların konumunu seçin ve adı, hücre türü ve hücre sayısı dahil olmak üzere deneyin açıklamasını girin.

Analiz Kurulumu için Analizi Daha Sonraya Ertele'yi seçin, zaman çizelgesine sağ tıklayın ve Seçili Tarama Grubu Aralığını Ayarla'yı seçin ve Taramaları Her Kez Dört Saat'e ve Toplamda 24 Saat'e ayarlayın. Ardından, başlangıç zamanını otomatik görüntüleme cihazında inkübasyondan en az bir saat sonrasına ayarlayın. Sferoid büyümesinin ilerlemesini kontrol etmek için her iki günde bir görüntüleme yazılımında oturum açın ve Son Taramaları Görüntüle'yi seçin. İlgilendiğiniz deneyi çift tıklatın ve Görüntü Kanalları panelinde Parlak Alan'ı seçin. Ardından, sferoidlerin çapını ölçmek için Görüntü Özelliklerini Ölç aracını kullanın. Herhangi bir hayalet etkisi ortamını sınırlamak için dördüncü günde kuyu başına 50 mikrolitre tam ortam eklemek.