Çekirdek kabuğu Lanthanide katkılı Upconversion Nanocrystals hücresel uygulamalar için sentezi

Bu prosedürün genel amacı, yüksek sıcaklıkta birlikte çökeltme yaklaşımına dayalı olarak çekirdek-kabuk lantanit katkılı yukarı dönüşüm nanokristallerini sentezlemek ve daha fazla hücresel uygulamayı mümkün kılan biyouyumlu yüzey modifikasyonları gerçekleştirmektir. Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, laboratuvarımız, çok benzersiz optik özelliklere işaret eden, çok benzersiz optik özelliklere işaret eden nanokristallerin çok benzersiz bir lantanit katkılı yukarı dönüşümü geliştirdi, böylece uzun dalga boylu kızılötesi ışığı emebilir ve temel olarak bu ışığı kısa dalga boyu aralığında çok renkli emisyonlara dönüştürebilir, kızılötesi ışık pencereleri bile görülebilen UV dahil. Bu tür benzersiz nanokristal yapılar, biyomedikal uygulamalar için çok umut verici özelliklere işaret etti.

Bu yöntem, yakın kızılötesi ışık aydınlatması üzerine ışık kapısı membran kanalı protein regülasyonu için çekirdek-kabuk yukarı dönüşüm nanoyapılarının sentezlenmesi ve bunların biyouyumlu yüzey modifikasyon tekniği için uygun bir yaklaşım sağlar. Prosedüre başlamak için, metanol içinde nadir toprak asetat komplekslerinin stok çözeltilerini hazırlayın. Metanolde mililitre sodyum hidroksit ve amonyum florür çözeltileri başına 20 miligram hazırlayın.

Stok çözeltilerini dört santigrat derecede saklayın. Ardından, üç mililitre oleik asit ve yedi mililitre 1 oktadesen pipetini 50 mililitre, üç boyunlu, yuvarlak tabanlı bir şişeye pipetleyin. Buna 1.089 mililitre itriyum asetat çözeltisi, 0.608 mililitre iterbiyum asetat çözeltisi, 83.6 mikrolitre tulyum asetat çözeltisi ve 128.5 mikrolitre neodimyum asetat çözeltisi ekleyin.

Şişeyi bir karıştırma çubuğu ve bir termometre ile donatın. Metanol buharlaşana kadar karıştırırken şişeyi bir yağ banyosunda 100 santigrat dereceye ısıtın. Ardından, şişeyi bir Schlenk hattına bağlayın ve kalan metanolü çıkarmak için şişeyi iki ila üç dakika boyunca pompalayın.

Ardından, şişeyi bir nitrojen atmosferinin altına koyun. Reaksiyon karışımını 700 rpm'de karıştırırken bir saat boyunca 150 santigrat derecede ısıtın. Ardından karışımın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.

Daha sonra, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne iki mililitre sodyum hidroksit stok çözeltisi ve 2.965 mililitre amonyum florür stok çözeltisi yerleştirin. Tüpü sıkıca kapatın ve sodyum hidroksit ve amonyum florür karışımını beş saniye boyunca girdaplayın. Beş dakika boyunca, karıştırırken sodyum hidroksit-amonyum florür karışımını reaksiyon şişesine yavaşça eklemek için bir cam pipet kullanın.

Ardından, reaksiyon karışımını 50 santigrat dereceden fazla olmayacak şekilde ısıtın. Karışımı bu sıcaklıkta 30 dakika tutun. Ardından, metanolü buharlaştırmak için karışımı 100 santigrat dereceye ısıtın.

Şişeyi Schlenk hattına bağlayın ve kalan metanolü vakum altında iki ila üç dakika çıkarın. Şişeyi nitrojen gazı ile doldurun ve reaksiyon karışımını dakikada beş santigrat derecede 290 santigrat dereceye ısıtın. Karışımı 1,5 saat boyunca 290 santigrat derecede veya biraz üzerinde tutun.

Ardından, karıştırırken karışımın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Ürün karışımını 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Kalıntıyı 30 mililitre etanol ile tüpe durulayın.

Karışımı oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 4.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve katıları iki dakika boyunca sonikasyon ile 10 mililitre heksanlarda dağıtın. Dispersiyona 30 mililitre etanol ekleyin, karışımı aynı koşullar altında tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Katıları beş mililitre heksanlarda dağıtın ve dispersiyonu dört santigrat derecede saklayın. Karanlıkta 808 nanometre lazer ışınlaması üzerine çekirdek kabuk UCNs çözeltisinin yukarı dönüştürülmüş emisyonunu kontrol edin. DBCO ile modifiye edilmiş UCN'leri hazırlamaya başlamak için, hazırlanan çekirdek kabuk nanokristallerini santrifüjleme ile 30 mililitre etanol içinde yıkayın.

Süpernatanı atın ve 10 mililitre pH dört sulu hidroklorik asit çözeltisi ekleyin. Katıları çözmek için karışımı 30 dakika boyunca sonikleştirin. Karışımı bir cam şişeye aktarın ve iki saat boyunca kuvvetlice karıştırın.

Ardından, karışımı dört adet 30 mililitrelik dietil eter ile yıkayın. Eter fraksiyonlarını birleştirin ve yıkanmış sulu tabakayı bir kenara koyun. Eter katmanlarından eser miktarda ligand içermeyen UCN'leri 10 mililitre deiyonize su ile geri kazanın ve sulu katmanları birleştirin.

Birleştirilmiş sulu katmanlara 20 mililitre aseton ekleyin ve karışımı beş saniye boyunca girdaplayın. Karışımı 10 dakika boyunca 35.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve ligandsız UCN'lerin bir çözeltisini elde etmek için çökeltiyi iki mililitre deiyonize su içinde çözün.

Daha sonra, 20 miligram poliakrilik asidi 20 mililitre deiyonize su içinde 20 dakika boyunca sonikasyon ile çözün. Buna, kuvvetlice karıştırırken ligand içermeyen UCN'lerin çözeltisini ekleyin. Karışımın pH'ını bir molar sodyum hidroksit çözeltisi ile 7.4'e ayarlayın.

Karışımı 30 dakika boyunca sonikate edin ve karışımı oda sıcaklığında 24 saat boyunca karıştırın. Daha sonra, karışımı 10 dakika boyunca 35.000 kez g'de santrifüjleyin. Katıları 10 mililitre deiyonize suda dört kez santrifüjleme ile yıkayın.

Polimer modifiye UCN'lerin mililitre başına 10 miligramlık bir çözeltisi elde etmek için yıkanmış katıları sekiz mililitre deiyonize su içinde dağıtın. Polimerle modifiye edilmiş UCN'lerin bir miligramını 10 dakika boyunca 35.000 kez g'de santrifüjleyin. Kalan çözeltiyi dört santigrat derecede saklayın.

Katıları, bir mililitrelik kuru DMF'de üç kez santrifüjleme ile yıkayın. Daha sonra çökeltiyi 200 mikrolitre kuru DMF'de çözün. Bu çözeltiye 12.2 miligram HOBT, 14 miligram EDC, beş miligram DBCO-amin ve 16 mikrolitre DIPEA ekleyin.

Karışımı oda sıcaklığında 24 saat karıştırın. Daha sonra, karışımı 35.000 kez g'de 10 dakika santrifüjleyin. Katıları, DMSO'nun bir mililitrelik kısımlarında santrifüjleme ile dört kez yıkayın.

DBCO ile modifiye edilmiş UCN'leri 0.2 mililitre DMSO'da dağıtın ve dispersiyonu dört santigrat derecede saklayın. İlk olarak, 12 oyuklu bir plakada beşinci HEK293 hücrelerini bir kez 10 kez tohumlayın ve hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, bir mikrosantrifüj tüpünde, seçilen plazmitin bir mikrogramını 100 mikrolitre MEM'de iki mikrolitre P3000 transfeksiyon ajanı ile birleştirin.

Başka bir mikrosantrifüj tüpünde, 1.5 mikrolitre transfeksiyon reaktifini 100 mikrolitre MEM ile birleştirin. Her iki karışımı da oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra karışımları birleştirin ve 400 mikrolitre düşük serumlu MEM ekleyin.

Daha sonra, inkübe edilmiş hücreleri iki kez bir mililitrelik serumsuz DMEM kısımları ile yıkayın. 600 mikrolitrelik transfeksiyon karışımını 12 oyuklu plakanın kuyucuklarına dağıtın. Hücreleri dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri iki kez bir mililitrelik DMEM parçalarıyla yıkayın. DMEM'de oyuklar arasında bir mililitre tetra-asetillenmiş N-azidoasetil-mannozamin çözeltisi dağıtın. Hücreleri iki gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ardından, hücreleri gece boyunca konfokal bir kapta yıkayın, deneyin ve yeniden kültürleyin. Daha sonra, ortamı, mililitre DBCO-UCN çözeltisi başına 50 miligramlık iki mikrolitre içeren bir mililitre taze DMEM ile değiştirin. Hücreleri iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve hücreleri DMEM ile iki kez yıkayın.

Çeker ocak ışığını kapatın ve kalsiyum görüntüleme için hücrelere uygun dien tampon çözeltilerini ekleyin ve hücreleri karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Hücreleri serumsuz DMEM ile yıkayın. Hücreleri, santimetre kare başına 0,8 watt sağlayan 808 nanometre, yakın kızılötesi ışıkla ışınlayın.

Hücreler 20 dakika boyunca ışınlanana kadar beş dakikalık aralıklarla beş dakikalık ışınlamayı değiştirin. Hücreleri konfokal mikroskopla görüntüleyin. Çekirdek ve çekirdek kabuğu UCN'lerinin transmisyon elektron mikroskobu, yaklaşık beş nanometre kabuk kalınlığına sahip küresel yapılar gösterdi.

Yüksek çözünürlüklü TEM, yüksek oranda kristalleşmiş nanoyapılarla tutarlı d-aralığı gösterdi. Yüzey modifikasyonunu takiben, UCN'ler kolayca tampon çözeltisine dağıtıldı. Dinamik ışık saçılımı, sulu çözeltideki DBCO-UCN'lerin hidrodinamik çapının yaklaşık 96 nanometre olduğunu gösterdi.

PAA ve DBCO ile modifiye edilmiş UCN'lerin zeta potansiyelleri, sulu tampon çözeltilerinde çözünürlük ve stabilite ile tutarlı olan negatif yüklü yüzeyleri gösterir. Yukarı dönüştürülmüş emisyon testleri, PAA ve DBCO ile modifiye edilmiş UCN'lerin, 808 nanometre ışıkla ışınlandığında temel çekirdek kabuk UCN'leri ile aynı emisyon modellerine sahip olduğunu gösterdi. DBCO-UCN'lerin biyouygulamalarını test etmek için ışık kapılı kanal proteinlerini eksprese eden azid etiketli HEK293 hücreleri kullanıldı.

UCN'lerin azid etiketlerindeki lokalizasyonu, DBCO gruplarının azid içeren bir boya ile boyanmasına bağlandı. Bu hücreler IR'ye yakın ışığa maruz kaldığında, DBCO-UCN'ler, bir floresan kalsiyum indikatörü ile konfokal görüntüleme ve akış sitometrisi ile gösterildiği gibi, hücre zarı boyunca kalsiyum iyonlarının akışını kolaylaştırdı. Bu videoyu izledikten sonra, bu prosedürü izleyerek canlı hücrelerde ışık kapılı iyon kanalını aktive etmek için biyouyumlu yüzey modifikasyonu ile çekirdek-kabuk yukarı dönüşüm nanokristallerinin nasıl hazırlanacağını ve bunların diğer biyo uygulamalarını iyi anlamış olmalısınız.