Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen spesifik karaciğer hücresi popülasyonlarının saflaştırılmasını kolaylaştırmak için başarılı bir Fare Karaciğer Perfüzyonu gerçekleştirmektir. Bu yöntem, in vitro veya in vivo deneylerde spesifik karaciğer hücresi popülasyonlarının işlevlerine nasıl yardımcı olunacağı ile ilgili hepatoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, her bir karaciğerden elde edilebilen sinüzoidal endotel hücrelerinde hepatosit miktarının yüksek olmasıdır.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü hücre canlılığını korumak için en iyi şekilde sindirilen bir karaciğerin rengini ve şeklini görmek çok önemlidir. Portal ven kateterini yerleştirmek için, önce bağırsakları fare karın boşluğunun sağ tarafına hareket ettirmek için bir forsepsin arkasını kullanın, portal veni açığa çıkarın ve 20 santimetrelik bir polyester dikiş ipliği parçasını portal venin altına kaydırmak için kavisli forseps kullanın karaciğer ile superior pankreas duodenal ven arasında. İpliği hayvanın diğer tarafına dikkatlice çekmek için forsepsleri kullanın, böylece portal damarın altında ortalanır.

Ve portal damarın etrafına gevşek bir üst düğüm atın. Kavisli forsepsleri damarın altına yerleştirin ve damarı düzeltmek için tüm doku malzemesini yavaşça kuyruğa doğru çekin. Daha sonra, bir kateter iğnesinin eğimini yukarı bakacak ve portal venin alt kısmına paralel olarak forsepsin yanına yerleştirin ve damarı iğne ile hafifçe delin.

Eğim damarın lümenindeyken, yaylı iğneyi geri çekin ve eğim venüs dallı alanına yakın olana kadar palmer kateterini damar boyunca itmeye devam edin. Düğümü kateterin etrafına sabitledikten sonra, peristaltik pompayı hemen dakikada dört milimetreye ayarlayın ve borunun erkek ucunu kateterin dişi ucuna bağlayın, bu noktada karaciğer dalını görmeye başlamalısınız. Drenaj için aort abdominalis'i kesin.

Boruyu alt pedin üzerine hareketsiz hale getirmek için maskeleme bandı kullanın. Kan ve perfüzyon sıvısının drenajını sağlamak için karın derisini dikey olarak kesmek için makası kullanın. Daha sonra, karaciğeri şişirmek için atık kan damarını düz forseps ile birkaç kez sıkın, tüm kanın boşaldığından emin olun ve karaciğer dokusu ağarıncaya kadar karaciğeri PBS ile perfüze edin.

Hepatositleri hasat etmek için, önce çıkış borusunu bir litrelik PBS şişesinden, kollajenaz-4 ile desteklenmiş tampon iki içeren 125 mililitrelik bir şişeye değiştirin. Kollajenaz karaciğere ulaştığında, basınç oluşturmak ve sindirim tamponunun karaciğerin tüm loblarını doldurmasına izin vermek için atık kan damarını kısa ama sıkı bir şekilde sıkın. Tampon karaciğeri çevreleyen bağ dokusundan patlamadan önce damarı serbest bırakın.

Ve tüm hacim dokudan akana kadar tamponun karaciğerden geçmesine izin verin. Daha sonra, farenin yanına 10 mililitre tampon içeren kristalleştirici bir kap yerleştirin ve karaciğeri tabağa aktarmak için düz forseps ve makas kullanın. Çanağı steril bir doku kültürü başlığına aktarın ve steril teknik kullanarak, kapsülü soymak için karaciğeri alın.

Hücreleri karaciğer dokusundan yavaşça çalkalayın ve elde edilen hücre çözeltisini 100 mikronluk bir filtreden 50 mililitrelik konik bir tüpe dökün. Daha sonra filtredeki karaciğer kalıntılarını daha fazla tamponla durulayın. Karaciğer hücrelerden yoksun gibi göründüğünde, çekilen süzüntüyü 40 mikronluk bir filtreden ikinci bir 50 mililitrelik tüpe süzün ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.

Parankimal olmayan hücreyi ve süpernatant içeren ölü hepatositi tek bir hareketle buz üzerinde 50 mililitrelik yeni bir tüpe dökün, peleti korumak ve peleti bir sonraki santrifüjleme için 40 mililitre taze tamponda yeniden süspanse edin. Sinüzoidal endotel hücrelerini izole etmek için, parankimal olmayan hücreler içeren süpernatanları santrifüjleyin. Hücre süspansiyonlarını tek bir yeni 50 mililitrelik konik tüpe çekin ve toplam hacmi 35 mililitreye çıkarın.

Çekilen hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve süpernatan içeren parankimal olmayan hücrenin üst 25 mililitresini buz üzerinde yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe dikkatlice aktarmak için 25 mililitrelik bir pipet kullanın. Tüpe 25 mililitre taze ortam ekleyin ve ikinci bir santrifüjleme ve süpernatan uzaklaştırma için peleti yeniden askıya alın. Daha sonra süpernatanı santrifüjleyin ve yeni bir 50 mililitrelik tüpe 15 mililitre% 50 Percoll çözeltisi ekleyin.

En düşük ejeksiyon hızına ayarlanmış bir pipetleyici kullanarak, 20 mililitre% 25Percoll'u% 50 Percoll çözeltisine yerleştirin ve parankimal olmayan hücreleri 10 mililitre dört santigrat derece ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri dikkatlice Percoll çözeltisinin üzerine yerleştirin. Ve hücreleri yoğunluk gradyan santrifüjleme ile ayırın.

Daha sonra, ilk 30 mililitre çözeltiyi aspire edin ve %25 ila 50 yoğunluk gradyan çözeltisi interfazında bulunan sinüzoidal endotel ve Kupffer hücrelerini yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe toplamak için beş mililitrelik plastik bir transfer pipeti kullanın. Hücreleri 50 mililitre ortamla yıkayın ve tüp tabanının kenarlarını 12 mililitre ılık ortamda durularken peleti yeniden askıya alın. Sinüzoidal endotel hücrelerini Kupffer hücrelerinden ayırmak için, hücre süspansiyonunu sekiz dakika boyunca nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe bir polistiren Petri kabına aktarın.

İnkübasyonun sonunda, süpernatanı aspire etmek için 25 mililitrelik bir pipet kullanın ve kalan sinüzoidal endotel hücrelerini toplamak için pipetleyici seti ile tabağı durulamak için süpernatanı kullanın. Daha sonra sinüzoidal endotel hücrelerini 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri, kollajen kaplı hücre kültürü kaplarında yeniden süspansiyon ve kaplama için santrifüjleme ile toplayın.

PBS infikstifif perfüzyonundan sonra bir fare karaciğerinin taramalı elektron mikroskobu, az önce gösterilene benzer bir şekilde, karaciğer mikro anatomisinin ve hepatositler arasındaki mikrovillusun net bir görünümünü ortaya çıkarır. İşlemin erken dönemlerinde düşük hızlı dönüşler sırasında hasat edilen hepatositler, sığır serum albümini içeren tamponlarda dört yıkamadan sonra yüksek saflık gösterir. Sinüzoidal endotel hücrelerinin, kollajen kaplı polistiren Petri kabı üzerine seçici yapışma ile ayrılması, büyük ölçüde kollajenaz sindiriminin genel etkinliğine bağlı olan %83 ila 90'lık bir saflık ile sonuçlanır.

Az önce gösterildiği gibi, temsili bir ayırma prosedüründen ışık mikroskobu kullanılarak yapılan kantitatif ölçümler, yaklaşık% 100 saf hepatosit popülasyonunun tipik izolasyon sonuçlarını ortaya koymaktadır. Ve %89'un biraz üzerinde saf sinüzoidal endotel hücre popülasyonu. Bu videoyu izledikten sonra, bir fare portal veninin nasıl katetize edileceğini ve fare karaciğerinden hem hepatositlerin hem de sinüzoidal endotel hücrelerinin nasıl saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedür, farklı yoğunluk gradyanları ve santrifüjleme hızları kullanılarak hepatosit izolasyonundan sonra uydu hücrelerini parankimal olmayan fraksiyondan saflaştırmak için de kullanılabilir.