Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu
16 Aralık 2021
Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.
Burada, primer fare karaciğeri sinüzoidal hücre izolasyonu veya LSECs izolasyonu protokolümüzü gösteriyoruz. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu ve parankimal olmayan hücre saflaştırması ve CD146 manyetik boncuk seçimi için düşük hızlı ultrasantrifüjlemeden oluşur. LSEC izolasyon yöntemimiz oldukça verimlidir ve sağlıklı ve hastalıklı fare karaciğerine uygulanabilir.
İzole edilmiş LSEC'ler yüksek saflık gösterir ve yapıyı ve işlevi korur. Bu protokol kullanılarak izole edilen LSEC'ler, fonksiyonel ve moleküler çalışmalar ve multi-omik veri üretimi için optimumdur. Bu protokol, karaciğerdeki hücreler arası iletişimi incelemek için yararlı olacaktır.
10 santimetrelik kültür tabaklarını üç mililitre kollajen çözeltisi ile kaplayarak başlayın. Ardından, bulaşıkları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, fazla sıvıyı kaplanmış yüzeyden çıkarın.
Bulaşıkları PBS ile üç kez yıkayın ve havayla kurumasını bekleyin. Isıtmalı ve nemlendirilmiş devridaim perfüzyon aparatını kurun. Perfüzyon sistemini beş dakika boyunca% 10 ağartıcı kullanarak durulayın.
Ardından, sistemi 10 dakika daha steril suyla tekrar durulayın. Kollajenaz çözeltisi ile perfüze etmeden önce durulama sıvısını mümkün olduğunca boşaltın. Kollajenaz çözeltisini perfüzyon sisteminden geçirerek 37 santigrat dereceye kadar ısıtın.
Pompa hızını, hız kontrol kadranındaki bir hızı olacak şekilde ayarlayın. Tüm prosedür boyunca hızı aynı tutun. İşlem için fareyi tartın.
Daha sonra cerrahi yüzeye sabitleyin. Fare karnına% 70 etanol püskürtün. Cerrahi makas kullanarak, karnın alt kısmından başlayarak ksifoid sürece kadar yaklaşık beş santimetrelik bir kesi yapın.
Bundan sonra, karın organlarını tamamen ortaya çıkarmak için karnın her iki tarafında küçük iris makası kullanarak iki yanal kesim yapın. Karnı kaldırmak ve düzleştirmek için IV kateterin kılıfını hayvanın sırtının altına yerleştirin. Düzenli bir kavisli pansuman forseps kullanarak, bağırsakları ve mideyi hayvanın soluna doğru yavaşça çekin.
Daha sonra, maruz kalan sol böbreğin hemen altındaki inferior vena kava veya IVC'nin altına 5-0'lık bir cerrahi sütür yerleştirin. Dikişe gevşek bir bağlantı bağlayın. Daha sonra, hepatik portal venin etrafına 5-0 cerrahi sütür daha yerleştirin.
Sütürü, hepatik portal venin dalak damar dallanma noktasının hemen üzerine yerleştirin. Yine, dikişe gevşek bir bağlantı bağlayın. Portal ven sütürünü gerginlik olarak kullanarak, 20-gauge IV kateteri, sağ ve sol hepatik portal vene dallandığı bir santimetre aşağıda hepatik portal ven içine yerleştirin.
Ardından, kateteri damardan yukarı kaydırın, ancak dallanma alanının altında tutun. Kanın damlamaya başlayana kadar kateterden aşağı inmesine izin verin. IV kateteri portal ven sütürü ile sabitleyin.
Kateterine A tamponlu bir IV şişesi takmak için bir IV hattı kullanın. Daha sonra, sisteme hava girmesini önlerken karaciğeri bu çözelti ile yıkayın. Böbreğin altındaki IVC'nin etrafındaki dikişi bağlayın.
Bundan sonra, hayvanın kanamasına izin vermek için IVC'yi dikişin altında kesin. Rahatsız ettikten sonra, mideyi, bağırsakları, dalağı ve karaciğere bağlı diğer bağırsakları kesin. Ardından, diyaframı ve ana damarları göğüs boşluğundan kesin.
Karaciğeri hayvandan çıkarın ve perfüzyon tepsisine yerleştirin. IV hattını dikkatlice çıkarın ve kollajenaz çözeltisini devridaim odasına bağlayın. Kapsül modellenene ve yumuşak görünene kadar karaciğerin perfüzyonuna izin verin.
Bu işlem genellikle 10 ila 15 dakika sürecektir. Sindirildikten sonra, karaciğeri odadan çıkarın ve yaklaşık 20 mililitre serumsuz DMEM içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Karaciğeri birkaç pipet ucuyla yavaşça ayırın ve safra ağacını atın.
Bundan sonra, karaciğer süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir konik tüpe filtreleyin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında iki dakika boyunca 50 kez G'de santrifüj yapın. Daha sonra, parankimal olmayan hepatik hücreler içeren süpernatantı toplayın.
Süpernatantı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. Bundan sonra, hücre peletini toplayın ve bir mililitre izolasyon tamponunda yeniden askıya alın. Üreticinin yönergelerini izleyerek otomatik hücre sayacı kullanarak hücre numarasını belirleyin.
Ardından, hücre süspansiyonunu santrifüj edin. Süpernatantı tamamen aspire edin ve peleti 10 milyon hücre başına 90 mikrolitre izolasyon tamponu ile yeniden askıya alın. Toplam 10 milyon hücre başına 10 mikrolitre CD146 MicroBeads ekleyin.
İyice karıştırın ve dört santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri yıkamak için, 10 milyon hücre başına bir ila iki mililitre izolasyon tamponu ekleyin. Çözeltiyi 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin.
Bundan sonra, süpernatantı tamamen aspire edin ve 500 mikrolitre izolasyon tamponunda bir milyara kadar hücreyi yeniden askıya alın. Daha sonra, ayırma kolonunu üç mililitre izolasyon tamponu ile durulayarak hazırlayın. Hücre süspansiyonunu, 70 mikrometrelik ön ayırma filtreleriyle istiflenmiş sütuna uygulayın.
Kolonu üç mililitre izolasyon tamponu ile üç kez yıkayın. Bundan sonra, kolonu ayırıcıdan çıkarın ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Pipet, kolon üzerine beş mililitre izolasyon tamponu yerleştirin.
Manyetik boncuk etiketli hücreleri kurtarmak için, hücreleri temizlemek için pistonu sütuna sıkıca itin. Son olarak, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin. İzole LSEC'lerin saflığı ve yüzey belirteçleri akım sitometrisi ile değerlendirildi.
Kapılı LSEC'ler ve tekiller için veri analizi ve geçit stratejisi, ileri dağılım ve yan saçılma verilerine dayanmaktadır. İzole LSEC'ler bir canlılık boyası ve CD45, CD146 ve Stabilin-2 antikorlarının bir kombinasyonu ile boyandı. Canlı LSEC'ler CD45 negatif populasyona bağlandı ve CD146 ve Stabilin-2 ekspresyonu için analiz edildi.
Bu verilerden, izole edilmiş LSEC'lerin% 94'ten daha fazla canlılığa ve% 90'dan fazla saflığa sahip olduğu doğrulandı. İzole hücrelerin LSEC'e özgü fenotipi, ışık mikroskobu ve taramalı elektron mikroskobu kullanılarak daha da doğrulandı. İzole LSEC'ler altı saat boyunca tam büyüme ortamında kültürlendi ve ışık mikroskobu ile incelendi.
SEM görüntüsündeki beyaz oklar, LSEC'lerin karakteristik bir morfolojik özelliği olan LSEC fenestrae'yi gösterir. Bir karaciğer dokusunun tam perfüzyonunu sağlamak için kritik adımlar, uygun kateter bandı konumlandırması, kateterde hava girmesini önlemek ve kollajenaz sindiriminin optimum zamanlamasıdır. Protokolümüz kullanılarak elde edilen yüksek kaliteli LSEC, LSEC fonksiyonunun moleküler mekanizmasının tanımlanmasını kolaylaştıracak ve karaciğerde, sağlıkta ve hastalıkta hücreler arası iletişimdeki rollerini anlamamızı geliştirecektir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, karaciğer kollagenaz perfüzyonu ve manyetik boncuk seçimi kullanarak birincil fare karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin (LSECs) verimli izole edilmesi için bir protokol gösterir. İzole edilen LSECs, yüksek saflık ve canlılığı koruyarak çeşitli fonksiyonel ve moleküler çalışmalar için uygundur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre biyolojisi
- Karaciğer fizyolojisi
- Endotel hücre fonksiyonu
Arka Plan
- LSECs, karaciğer biyolojisinde ve hücreler arası iletişimde kritik bir rol oynar.
- Yüksek saflıkta LSECs'lerin izole edilmesi, karaciğer fonksiyonunu ve ilgili hastalıkları incelemek için hayati öneme sahiptir.
- Bu protokol, hem sağlıklı hem de hastalıklı fare karaciğerlerinden LSEC izole etmek için güvenilir bir yöntem sunar.
Kullanılan Yöntemler
- Karaciğer kollagenaz perfüzyonu ardından düşük hızlı ultrasantrifüjlemeye.
- Biyolojik sistem olarak fare karaciğeri.
- Hücre karakterizasyonu için akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu.
Ana Sonuçlar
- Protokol, %90'dan fazla saflık ve %94'ten fazla canlılık ile LSECs sağlar.
- İzole edilen LSECs, aşağı yönlü analizler için uygun yapı ve fonksiyonlarını korur.
- Bu yöntem, karaciğer fonksiyonu ve hücresel etkileşimler üzerinde ileri çalışmalara olanak tanır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, fare karaciğerinden LSECs izole etmek için etkili bir yöntem sunar.
- Protokol, karaciğer biyolojisini ve hastalık mekanizmalarını anlamaya önemli katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-purity isolation and characterization of mouse liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) enables robust investigation of liver microenvironment mechanisms relevant to metabolic, inflammatory, and fibrotic disease models. This protocol supports predictive confidence in early discovery and target validation by providing standardized, reproducible access to primary LSECs from both healthy and disease states. The approach facilitates translational continuity for multi-omics and functional studies across the preclinical pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of LSEC-specific pathways implicated in liver disease mechanisms.
- Supports biological de-risking by providing functionally validated primary endothelial cells.
- Facilitates mechanistic studies of intercellular communication within the hepatic niche.
- Improves predictive confidence for target selection in metabolic and fibrotic disease models.
Screening & Assay Development
- Provides a validated source of primary LSECs for quantitative adhesion and permeability assays.
- Enables assay standardization and reproducibility through high-purity cell preparations.
- Supports downstream screening workflows requiring disease-relevant endothelial systems.
- Facilitates platform reuse for multi-omics and pathway-specific analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant model systems for NAFLD and chronic liver injury studies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation using primary cell-based assays.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insight into LSEC function.
- Facilitates biomarker discovery and validation in translational liver research.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-quality LSECs for hypothesis testing, pathway analysis, and multi-omics profiling.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking and pathway clarification in liver disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for functional and molecular assays.
- Analytics: Enables flow cytometry and electron microscopy-based characterization for comparative studies.
- Translational Research: Provides primary cell systems for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for LSEC isolation across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in liver research.
- Operational Value: Standardizes LSEC isolation for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in perfusion techniques and primary cell isolation.
- Needs access to flow cytometry, electron microscopy, and magnetic bead separation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for consistent cell purity and viability metrics.
- Adaptable to both healthy and disease model systems for broad research applicability.
- Dependent on precise perfusion and digestion timing for optimal cell yield and quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:01
Preparation of Collagen-Coated Culture Dish or Plate
1:25
Equipment Setup
2:01
Surgical Procedure
4:50
Separation of Nonparenchymal Hepatic Cells and LSECs Purification
6:29
Results: Assessment of Purity and Morphology of Isolated LSECs
7:37
Conclusion
