Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

HEV nanopartiküllerinin yüzeyinin kimyasal olarak işlevselleştirilmesinin genel amacı, teşhis ve tedavi amacıyla HEV nanopartiküllerinin yüzeyine hedeflenen immünojenik, terapötik ve diagnostik moleküllerin konjugasyonu için tekrarlanabilir ve tutarlı bir yaklaşım sağlamaktır. Bu yöntem, kanserin gelişmiş hedeflemesi ve nano terapötiklerin dağıtımının nasıl izlenebileceği gibi nanotıp alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetik mühendisliği üretmeye kıyasla yüksek oranda tekrarlanabilir, verimli ve elde edilmesi çok daha kolay olmasıdır.

Prosedürleri gösteren, laboratuvarımızdan araştırma görevlileri Michelle Nguyen ve Ivan Ruiz olacak. Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı gibi hepatit E virüsü nano partikül üretimi ve saflaştırılması ile başlayın. HEV nanopartikül örneklerini bir TEM görüntüleme için 10 milimolar MES, pH 6.2 ile mililitre başına 0.5 ila iki miligram arasında seyreltin.

Hidrofilik bir karbon yüzeyi oluşturmak için karbon kaplı ızgaraları 40 miliamper kızdırma deşarjı ile 30 saniye iyonize edin. Izgaraların hidrofilik karbon yüzeyi, kızdırma deşarj işleminden sonra sadece 30 dakika dayanabilir. İyonizasyonun ardından, ızgarayı ve cımbızı tutun ve ızgaraya iki mikrolitre HEV nanopartikül numunesi ekleyin.

15 ila 30 saniye sonra ızgarayı filtre kağıdı ile kurulayın. Ardından ızgarayı hemen çift damıtılmış suyla yıkayın ve tekrar filtre kağıdı ile kurulayın. Hemen ızgaraya iki mikrolitre yüzde iki uranil asetat ekleyin.

15 saniye sonra ızgarayı filtre kağıdı ile kurulayın. Numune ızgaralarını gece boyunca bir elektronik nem alma cihazı kuru kabinine koyarak kurutun. Numuneye bağlı olarak, yapı görselleştirme ve karakterizasyonu için kriyojenik elektron mikroskobu veya kriyo-EM gerekli olabilir.

Izgarayı bir TEM'e aktarın ve 10 ila 80 K büyütmede görüntüleyin. HEV nanopartikülleri, TEM'de viral RNA'nın yokluğuna bağlı olarak yaklaşık 27 nanometre çapında boş ikosahedral proteinler olarak görünür. HEV nanopartiküllerinin ve maleimide bağlı biotinin tek aşamalı konjugasyonunu gerçekleştirmek için önce HEV nanopartiküllerini mini diyaliz ünitelerine uygulayın.

Nanopartikülleri, üreticinin protokolüne göre oda sıcaklığında bir saat boyunca 0.01 molar PBS pH 7.4'e karşı diyalize edin. Diyalize girdikten sonra, HEV nanopartiküllerini 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve bir spektrofotometre kullanarak protein konsantrasyonunu 280 nanometrede ölçün. Nanopartikülleri mililitre başına bir miligramda, bir ila beş molar oran elde etmek için eşit miktarda 100 mikromolar maleimid biotin ve 0.01 molar PBS pH 7.4 ile karıştırın.

Gece boyunca dört santigrat derecede reaksiyona girdikten sonra, üreticinin protokolüne göre bir spin tuzdan arındırma kolonu prosedürü ile bağlanmamış maleimid biyotini çıkarın. Numuneleri standart bir SDS azaltma sayfası aracılığıyla analiz edin. Standart prosedürleri kullanarak, HRP'ye bağlı streptavidin kullanarak bir kemilüminesan Western lekesi hazırlayın ve kemilüminesan sinyali x-ışını filmi ile yakalayın.

Meme kanseri hücresine özgü ligandın, LXY30'un HEV nanopartikülleri üzerinde yüzeye maruz kalan sisteine iki aşamalı konjugasyonunu gerçekleştirmek için, önce nanopartikülleri mini diyaliz ünitelerine uygulayın ve bir saat boyunca oda sıcaklığında 0.01 molar PBS pH 7.4'e karşı diyalize edin. Daha sonra HEV nanopartiküllerini 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve bir spektrofotometre kullanarak 280 nanometrede protein konsantrasyonunu ölçün. Daha sonra, 650 mikromolar maleimid azid ve 650 mikromolar alkin LXY30'u 200 mikromolar bakır sülfat ve bir milimolar askorbik asit ile birleştirin.

Bu, 650 mikromolarda maleimide bağlı LXY 30'u oluşturur. Karışımı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, bir ila üç molar oran elde etmek için HEV nanopartiküllerini mililitre başına bir miligrama yaklaşık% 10 maleimid bağlantılı LXY 30 ile karıştırın.

Gece boyunca dört santigrat derecede reaksiyona sürün. Maleimid LXY 30'un nispeten yüksek konsantrasyonu nedeniyle, bakır sülfat gibi reaktanların nihai konsantrasyonları, karıştırmadan sonra yaklaşık 10 kat azaltılır. Hepatit E virüsü nanopartiküllerine zarar vermelerini önlemek için başka bir seçenek de bakır içermeyen katkı yöntemidir.

Üreticinin protokolüne göre bir spin tuz giderme sütunu ile bağlanmamış maleimid click LXY 30'u çıkarın. LXY 30'a bağlı HEV nanopartiküllerini dört santigrat derecede tutun. LXY 30 HEV nanopartiküllerinin ve Cy5.5 floresan etiketinin tek aşamalı konjugasyonunu gerçekleştirmek için, önce LXY 30'a bağlı nanopartikülleri mililitre başına bir miligrama eşit hacimde Cy5.5 floresan etiketi ile karıştırın ve bir ila beş molar oran elde edin.

Karışımı gece boyunca dört santigrat derecede reaksiyona soktuktan sonra, bağlanmamış Cy5.5 NHS'yi üreticinin protokolüne göre bir spin tuzdan arındırma kolonu prosedürü ile çıkarın. LXY 30 Cy5.5'e bağlı HEV nanopartiküllerini dört santigrat derecede tutun. Tümör hücresi hedeflemesi için HEV nanopartiküllerinin LXY 30 işlevselleştirilmesi için iki yöntem denendi.

HEV 573C nanopartikülleri önce maleimid azide bağlandığında, ardından LXY 30 alkine bir tıklama kimyası reaksiyonu izlediğinde, HEV 573C nanopartiküllerinin TEM gözlemi altında parçalandığı ortaya çıktı. Bununla birlikte, maleimid bağlantılı LXY 30 oluşturmak için LXY 30 alkin ve maleimid azid arasındaki ilk tıklama kimyası reaksiyonu ve ardından modifiye edilmiş HEV nanopartiküllerine yardımcı olmak için konjugasyon yapısını etkilemedi ve HEV 573C nanopartikülleri bozulmadan kaldı. LXY 30 ve Cy5.5'e bağlı HEV nanopartikülleri, kültürlenmiş meme kanseri hücrelerine uygulandı ve konfokal mikroskopi ile gözlendi.

Konfokal mikroskopi ile yakın kızılötesi floresan görüntüleri, LXY 30 Cy5.5'e bağlı HEV nanopartiküllerinin, Cy5.5'e bağlı HEV nanopartiküllerine kıyasla MDA MB 231 meme kanseri hücrelerinde artan bir içselleştirme için daha yüksek bağlanma afinitesine sahip olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin etkileri, normal hücrelere zarar vermeden tümörün doğru bir şekilde hedeflenmesine ve teşhisine izin veren multimodal hedefleme ve terapötik moleküllerin incelenmesine kadar uzanır. Bu yöntem, kimyasal yüzey modülizasyonu yoluyla kanser ve tümör hedeflemesi hakkında bilgi sağlayabilse de, erken kanser teşhisi, taraması ve görüntüleme kılavuzluğunda tedaviye uygulanabilir.