Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization
11 Mayıs 2018
Biz-si mühendislik hepatit E virüs kapsid protein theranostic nanopartikül (HEVNP). HEVNP icosahedral istikrarlı Mukozal teslim kafese kendi kendine monte edilerek üretilir. Burada, HEVNPs değiştirilmesi yüzey Günese maruz kalan kalıntıları özellikle tümör hücreleri bağlamak sentetik ligandlar çekimlerine katıldı diziyi değiştirerek hedefleme tümör için açıklamak.
HEV nanopartiküllerinin yüzeyinin kimyasal olarak işlevselleştirilmesinin genel amacı, teşhis ve tedavi amacıyla HEV nanopartiküllerinin yüzeyine hedeflenen immünojenik, terapötik ve diagnostik moleküllerin konjugasyonu için tekrarlanabilir ve tutarlı bir yaklaşım sağlamaktır. Bu yöntem, kanserin gelişmiş hedeflemesi ve nano terapötiklerin dağıtımının nasıl izlenebileceği gibi nanotıp alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetik mühendisliği üretmeye kıyasla yüksek oranda tekrarlanabilir, verimli ve elde edilmesi çok daha kolay olmasıdır.
Prosedürleri gösteren, laboratuvarımızdan araştırma görevlileri Michelle Nguyen ve Ivan Ruiz olacak. Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı gibi hepatit E virüsü nano partikül üretimi ve saflaştırılması ile başlayın. HEV nanopartikül örneklerini bir TEM görüntüleme için 10 milimolar MES, pH 6.2 ile mililitre başına 0.5 ila iki miligram arasında seyreltin.
Hidrofilik bir karbon yüzeyi oluşturmak için karbon kaplı ızgaraları 40 miliamper kızdırma deşarjı ile 30 saniye iyonize edin. Izgaraların hidrofilik karbon yüzeyi, kızdırma deşarj işleminden sonra sadece 30 dakika dayanabilir. İyonizasyonun ardından, ızgarayı ve cımbızı tutun ve ızgaraya iki mikrolitre HEV nanopartikül numunesi ekleyin.
15 ila 30 saniye sonra ızgarayı filtre kağıdı ile kurulayın. Ardından ızgarayı hemen çift damıtılmış suyla yıkayın ve tekrar filtre kağıdı ile kurulayın. Hemen ızgaraya iki mikrolitre yüzde iki uranil asetat ekleyin.
15 saniye sonra ızgarayı filtre kağıdı ile kurulayın. Numune ızgaralarını gece boyunca bir elektronik nem alma cihazı kuru kabinine koyarak kurutun. Numuneye bağlı olarak, yapı görselleştirme ve karakterizasyonu için kriyojenik elektron mikroskobu veya kriyo-EM gerekli olabilir.
Izgarayı bir TEM'e aktarın ve 10 ila 80 K büyütmede görüntüleyin. HEV nanopartikülleri, TEM'de viral RNA'nın yokluğuna bağlı olarak yaklaşık 27 nanometre çapında boş ikosahedral proteinler olarak görünür. HEV nanopartiküllerinin ve maleimide bağlı biotinin tek aşamalı konjugasyonunu gerçekleştirmek için önce HEV nanopartiküllerini mini diyaliz ünitelerine uygulayın.
Nanopartikülleri, üreticinin protokolüne göre oda sıcaklığında bir saat boyunca 0.01 molar PBS pH 7.4'e karşı diyalize edin. Diyalize girdikten sonra, HEV nanopartiküllerini 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve bir spektrofotometre kullanarak protein konsantrasyonunu 280 nanometrede ölçün. Nanopartikülleri mililitre başına bir miligramda, bir ila beş molar oran elde etmek için eşit miktarda 100 mikromolar maleimid biotin ve 0.01 molar PBS pH 7.4 ile karıştırın.
Gece boyunca dört santigrat derecede reaksiyona girdikten sonra, üreticinin protokolüne göre bir spin tuzdan arındırma kolonu prosedürü ile bağlanmamış maleimid biyotini çıkarın. Numuneleri standart bir SDS azaltma sayfası aracılığıyla analiz edin. Standart prosedürleri kullanarak, HRP'ye bağlı streptavidin kullanarak bir kemilüminesan Western lekesi hazırlayın ve kemilüminesan sinyali x-ışını filmi ile yakalayın.
Meme kanseri hücresine özgü ligandın, LXY30'un HEV nanopartikülleri üzerinde yüzeye maruz kalan sisteine iki aşamalı konjugasyonunu gerçekleştirmek için, önce nanopartikülleri mini diyaliz ünitelerine uygulayın ve bir saat boyunca oda sıcaklığında 0.01 molar PBS pH 7.4'e karşı diyalize edin. Daha sonra HEV nanopartiküllerini 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve bir spektrofotometre kullanarak 280 nanometrede protein konsantrasyonunu ölçün. Daha sonra, 650 mikromolar maleimid azid ve 650 mikromolar alkin LXY30'u 200 mikromolar bakır sülfat ve bir milimolar askorbik asit ile birleştirin.
Bu, 650 mikromolarda maleimide bağlı LXY 30'u oluşturur. Karışımı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, bir ila üç molar oran elde etmek için HEV nanopartiküllerini mililitre başına bir miligrama yaklaşık% 10 maleimid bağlantılı LXY 30 ile karıştırın.
Gece boyunca dört santigrat derecede reaksiyona sürün. Maleimid LXY 30'un nispeten yüksek konsantrasyonu nedeniyle, bakır sülfat gibi reaktanların nihai konsantrasyonları, karıştırmadan sonra yaklaşık 10 kat azaltılır. Hepatit E virüsü nanopartiküllerine zarar vermelerini önlemek için başka bir seçenek de bakır içermeyen katkı yöntemidir.
Üreticinin protokolüne göre bir spin tuz giderme sütunu ile bağlanmamış maleimid click LXY 30'u çıkarın. LXY 30'a bağlı HEV nanopartiküllerini dört santigrat derecede tutun. LXY 30 HEV nanopartiküllerinin ve Cy5.5 floresan etiketinin tek aşamalı konjugasyonunu gerçekleştirmek için, önce LXY 30'a bağlı nanopartikülleri mililitre başına bir miligrama eşit hacimde Cy5.5 floresan etiketi ile karıştırın ve bir ila beş molar oran elde edin.
Karışımı gece boyunca dört santigrat derecede reaksiyona soktuktan sonra, bağlanmamış Cy5.5 NHS'yi üreticinin protokolüne göre bir spin tuzdan arındırma kolonu prosedürü ile çıkarın. LXY 30 Cy5.5'e bağlı HEV nanopartiküllerini dört santigrat derecede tutun. Tümör hücresi hedeflemesi için HEV nanopartiküllerinin LXY 30 işlevselleştirilmesi için iki yöntem denendi.
HEV 573C nanopartikülleri önce maleimid azide bağlandığında, ardından LXY 30 alkine bir tıklama kimyası reaksiyonu izlediğinde, HEV 573C nanopartiküllerinin TEM gözlemi altında parçalandığı ortaya çıktı. Bununla birlikte, maleimid bağlantılı LXY 30 oluşturmak için LXY 30 alkin ve maleimid azid arasındaki ilk tıklama kimyası reaksiyonu ve ardından modifiye edilmiş HEV nanopartiküllerine yardımcı olmak için konjugasyon yapısını etkilemedi ve HEV 573C nanopartikülleri bozulmadan kaldı. LXY 30 ve Cy5.5'e bağlı HEV nanopartikülleri, kültürlenmiş meme kanseri hücrelerine uygulandı ve konfokal mikroskopi ile gözlendi.
Konfokal mikroskopi ile yakın kızılötesi floresan görüntüleri, LXY 30 Cy5.5'e bağlı HEV nanopartiküllerinin, Cy5.5'e bağlı HEV nanopartiküllerine kıyasla MDA MB 231 meme kanseri hücrelerinde artan bir içselleştirme için daha yüksek bağlanma afinitesine sahip olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin etkileri, normal hücrelere zarar vermeden tümörün doğru bir şekilde hedeflenmesine ve teşhisine izin veren multimodal hedefleme ve terapötik moleküllerin incelenmesine kadar uzanır. Bu yöntem, kimyasal yüzey modülizasyonu yoluyla kanser ve tümör hedeflemesi hakkında bilgi sağlayabilse de, erken kanser teşhisi, taraması ve görüntüleme kılavuzluğunda tedaviye uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, hepatit E virüs kapsid proteininin hedeflenen tümör tedavisi için bir teranostik nanoparçacık (HEVNP) olarak mühendisliğini sunmaktadır. HEVNP'ler, sentetik ligandların bağlanması yoluyla tümör hedeflemesini artırmak için modifiye edilmiştir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nanotıp
- Teranostis
- Onkoloji
Arka Plan
- HEVNP'ler kendiliğinden kararlı yapılara toplanır.
- Nanoparçacıkların modifikasyonu, hedefleme yeteneklerini artırabilir.
- Terapilerin dağılımının anlaşılması kanser tedavisinde kritik öneme sahiptir.
- Bu yaklaşım, geleneksel genetik mühendisliği yöntemlerine kıyasla daha verimlidir.
Çalışmanın Amacı
- HEVNP'leri işlevselleştirmek için tutarlı bir yöntem geliştirmek.
- Sentetik ligandlar kullanarak kanser hücrelerinin hedeflenmesini artırmak.
- Tümörlerin teşhisi ve tedavisini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- HEV nanoparçacıklarının üretimi ve saflaştırılması.
- Görüntüleme için HEVNP örneklerinin seyreltilmesi.
- Ligandların yüzeye maruz bulunan sistein kalıntılarına bağlanması.
- Analizler için geçiş elektron mikroskobu (TEM) kullanımı.
Ana Sonuçlar
- HEVNP'ler tümör hedeflemesi için etkili bir şekilde modifiye edilebilir.
- Bağlanma yöntemi tekrarlanabilir ve verimlidir.
- Kanser hücrelerine yönelik hedeflemenin artırıldığı gösterilmiştir.
- Teşhis ve terapötiklerde potansiyel uygulamalar vurgulanmıştır.
Sonuçlar
- HEVNP'ler kanser tedavisi için umut verici bir platform temsil eder.
- Yüzey modifikasyonu, terapötik ajanların hedefe yönelik teslimini sağlar.
- Bu yöntem, nanotıp alanını ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Chemical surface functionalization of virus-like particles enables modular and reproducible conjugation of targeting ligands and imaging agents without genetic modification, supporting rapid prototyping of theranostic nanocarriers. This approach enhances predictive confidence in target validation by allowing systematic screening of diverse biomolecules on a stable nanoparticle scaffold. The method addresses a key discovery-stage challenge: achieving consistent, scalable display of functional entities for downstream oncology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise display of tumor-targeting ligands like LXY30 on HEV nanoparticles.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for evaluating ligand-receptor interactions using cysteine-directed conjugation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing rapid comparison of ligand affinity and internalization efficiency in cancer cell models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable nanoconjugates with defined ligand density for standardized binding and uptake assays.
- Operational Value: Enables batch-to-batch consistency in nanoparticle functionalization, critical for assay reproducibility.
- Scalability: Supports preparation of validated biological systems for high-throughput screening of targeting moieties.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Produces tumor-targeted HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) validated in breast cancer cell models, supporting progression to preclinical studies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates that pre-forming maleimide-linked LXY30 via click chemistry preserves nanoparticle integrity, reducing structural failure risk.
- Disease-Relevant System: Uses MDA-MB-231 cells to assess internalization and binding affinity, aligning with therapeutic relevance in triple-negative breast cancer.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling preparation of functionalized nanocarriers for preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing modular conjugation of immunogenic, therapeutic, and diagnostic molecules to HEV nanoparticles.
- Screening: Delivers assay-ready nanoparticles with reproducible surface modification for quantitative evaluation of targeting efficiency.
- Analytics: Generates measurable outputs via TEM, Western blot, and confocal microscopy to compare conjugation success and cellular uptake.
- Translational Research: Links discovery to preclinical continuity through demonstration of tumor-specific binding and internalization in cultured cancer cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable conjugation platform applicable to other macromolecular complexes with known structures.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through precise, cysteine-specific ligand display without altering nanoparticle assembly.
- Operational Value: Offers high reproducibility and efficiency compared to genetic engineering, reducing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid screening of ligands and imaging tags on a stable nanocarrier.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement by generating theranostic candidates with validated tumor targeting and imaging capabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein chemistry, conjugation techniques, and nanoparticle purification.
- Depends on access to dialysis units, spectrophotometry, SDS-PAGE, Western blotting, and confocal microscopy.
- Necessitates standardization across teams for consistent protein concentration measurement and reaction conditions.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other nanoparticle systems with different surface-exposed residues.
- Includes practical limitations such as nanoparticle disassembly if conjugation order is not optimized, as seen with premature maleimide azide binding.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
HEVNP Characterization
2:46
Chemical Conjugation of HEVNPs with Biotin, Cancer Targeting Ligand, and Fluorophores
7:05
Results: Production of LXY30-HEVNPs and Binding/Internalization of Fluorescently Labeled LXY30-HEVNPs in MDA-MB-231 Breast Cancer Cells
8:35
Conclusion
