Name: Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Keşfedin hepatit E virüsü nano taneciklerinin kimyasal konjugasyon yöntemleriyle yüzey modifikasyonunu. Bu tekrarlanabilir teknik, kanser hücrelerine hedeflenmiş tanı ve tedavi için nanotıpta uygulama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar tarafından NIH RHC için fon sponsorluk kabul vermek #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Ulusal Enstitüsü gıda ve tarım gibi Finlandiya ayırt edici Profesör programı.

1. HEVNP üretim böcek hücrelerinde
Not: Tüm aşağıdaki adımları bir hücre kültür mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor. Bizim önceki yayın için daha ayrıntılı HEVNP üretim işlemleri11bakın.
<ol><li>Kültür Sf9 böcek hücrelerinde ( Tablo malzemelerigörmek) Medya 50-%75 izdiham içinde 6-şey plakaları için hücre.</li>
	<li>Böcek hücre transfection reaktifler göre üreticinin iletişim kurallarını kullanarak, rekombinant baculovirus üretmek için Bacmids HEVNP - 573C ORF2 Sf99 hücrelere içeren transfect. 27 ° C'de transfected hücreleri hücre canlılığı bağlı olarak 3-6 gün kuluçkaya.</li>
	<li>(Transfected hücre baculovirus enfeksiyon nedeniyle lysed sonra), 3-6 gün sonrası enfeksiyon süpernatant P0 baculovirus stok olarak toplamak.</li>
	<li>Kültür orta % 50-75 Konfluent Sf9 hücrelerde bir 25 cm2 monolayer şişesi 200 µL P0 stokunun uygulamadan önce kaldırın. Şişeye her 15dk inoculum tam kapsama sağlamak için rock. 4 kez, toplamda 60 dk için yineleyin.</li>
	<li>Böcek hücre kültür orta 2 mL şişe için ekleyin ve canlılığı hücre baculovirus için daha yüksek bir titresi yükseltmek için bağlı olarak 3-6 gün için 27 ° C'de tutun.</li>
	<li>12okuma baculovirus titresi elde etmek için plak deneyleri taşımak.</li>
	<li>Böcek cep orta 250 mL şişe 100 mL ile askıya alınmış Tn5 böcek hücreleri (Tablo reçetesi) kültür ve 150 devirde titresi 0.5 x 10 için 27 ° C'de sallamak5 - aşılama için 1 x 106 .</li>
	<li>Baculovirus enfeksiyonu (MOI) çokluğu, 5-10-100 mL Tn5 hücrelerinin bir 250 mL şişe ekleyin. Aşı sonra 150 rpm'de 27 ° C'de 5-7 gün için salla.</li>
	<li>Bir kez en hücreleri veziküller sahip gibi görünmesine ve hücrelerin % 70-90 optik mikroskop gözlem altında ölü, Tn5 hücreleri toplamak ve 33 mL ultracentrifuge tüpler içine aktarmak. 10.000 x g için 25 ° C'de 90 dk de kova rotor, denge ve hücre artıkları ve rekombinant baculoviruses aşağı spin sallanan içinde yer ultracentrifuge tüpler</li>
	<li>Daha fazla arıtma 4 ° C'de yayımlanan HEVNPs içeren süpernatant tutun. Baculovirus süpernatant genişletilmiş depolama için proteaz inhibitörleri ekleyin.</li>
</ol>2. HEVNP arıtma
<ol><li>Cips ve sezyum klorür (CsCl) degrade ayrımı yöntemi kullanılarak HEVNPs izole:<ol>
<li>Toplanan süpernatant nakletmek (adımından 1,10) ve % 20 eklemek NP-%40 0,5 son bir konsantrasyon yapmak her tüpün içine geri kalan herhangi bir hücresel membran çözülmeye NP-40. Yavaşça pipetting tarafından mix ve en az 30 dk. 25 ° C'de için kuluçkaya</li>
		<li>Ultracentrifuge HEVNPs süpernatant üzerinden aşağı cips için kova rotorlar için 2 h 4 ° C'de sallanan içinde 112,400 x g de HEVNPs. Süpernatant Santrifüjü sonra atmak ve yavaşça ham Pelet 200 µL her tüp gecede 10 mM MES tampon pH 6.2 (O/N) 4 ° C'de yeniden askıya yılında SDS-52 kDa grup olarak ham Pelet içinde HEVNP ORF2 varlığını doğrulamak için sayfayı (Adım 3.1) çalıştırın.</li>
		<li>% 38.5 (w/v) CsCl degrade karıştırma 1.96 g CsCl, yeniden askıya alınmış ham Pelet ve ~ 4 mL 5 mL ultracentrifuge tüp içinde 0.01 M MES pH 6.2 hazırlayın. Tüpler dengelemek ve sallanan bir kova rotor yerleştirin. Ultracentrifuge 147000 x g 4 ° C'de 16 h için de</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kesirler CsCl degrade sonra toplamak:<ol>
<li>Öncelikle hafif hücre zarı enkaz olan en iyi 500 µL kesir, atın. Tüp, en baştan başlayarak 500 µL kesirleri toplamak ve ipuçları her kesir arasında değiştirin. Her kesir numaralı/etiketli 1,5 mL tüpler içine yerleştirin. Not: Varlığı HEVNP ORF2 kesirler degrade jelleri CsCl yüksek konsantrasyon nedeniyle SDS sayfa çalıştırarak tespit edilemez CsCl ayrılmış. CsCl her kesir kaldırılabilir veya CsCl temizlik yordamı izleyerek seyreltilmiş. Alternatif olarak, CsCl gradyan CsCl arta kalan önlemek için bir 10-%40 Sükroz degrade13 tarafından değiştirilebilir.</li>
		<li>5 mL ultracentrifuge tüp her kesir aktarmak ve CsCl ile 4.5 mL 10 mm MES, pH 6.2 oranında seyreltin. Tüpler dengelemek ve sallanan bir kova rotor yerleştirin. Ultracentrifuge 147000 x g 4 ° C'de HEVNPs cips için 2 h için de.</li>
		<li>Süpernatant atın ve yavaşça HEVNPs 10 mM MES pH 6.2 her tüp 100 µL yeniden askıya. Tüpler buharlaşma önlemek ve O/N 4 ° C'de kuluçkaya kapak</li>
		<li>A280 okuma ve A260/A280 nm oranı bir Spektrofotometre kullanarak kaydedin. ORF2 yaklaşık konsantrasyonu belirlemek: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57020/57020eq1.jpg"> Her ORF2 1 Cys ve kimyasal konjugasyon için 1 Lys siteleri içerir. Not: 1.019 mg/mL × A280 eşdeğer olan 60,280, HEVNP ORF2 molar tükenme katsayısı dür. 1:1 yakın bu böyledir bu HEVNPs konsantrasyon (mg/mL içinde) A280 ve bu nedenle, ORF2 konsantrasyon yukarıdaki denklem tarafından yaklaşık. Örneğin, bir HEVNP bir A280 okuma 1 ile 1 mg/mL, 18.8 µM için eşdeğeri olan bir konsantrasyon olacaktır ORF2.</li>
		<li>SDS-sayfa hazırlamak. Her kesir 6 µL örnekten 53,3 kDa HEVNP ORF2 protein (Adım 3.1) içeren kesirleri belirlemek için kullanın. HEVNPs kesirler 3-5, yoğunluklu olarak ~1.25 g/mL bulundu.</li>
		<li>Varlığı ve HEVNPs saflık TEM gözlem tarafından onaylayın. Hazırlamak veya HEVNP örnekleri için 0.5 - 2.0 mg/mL TEM için sulandırmak. HEVNPs boş icosahedral proteinleri olarak ~ 27 TEM içinde görünür nm çapında (Şekil 2). Bazı protein kirletici kesirler içinde kalabilir ve TEM (Adım 3.2) altında gözlenir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yabancı maddelerin TEM altında mevcut durumda 2.1.3 - 2.2.6 daha iyi HEVNPs saflığı için adımları yineleyin. Not: Ekstra arıtma CsCl gradyan ile HEVNPs verim kaybına neden olabilir. Alternatif olarak, CsCl degrade arıtma arta kalan CsCl13önlemek için % 10-40 Sükroz degrade tarafından değiştirilebilir.</li>
</ol>3. HEVNP karakterizasyonu
<ol><li>SDS sayfa 4-%12 Bis-Tris Protein jelleri, 1.0 mm, kullanıcının el ile14göre 17-wells ( Tablo malzemelerigörmek) hazırlayın:<ol>
<li>4 x 6 µL protein örneği arabelleğe yükleme 2 µL ekleyin. Örnek karışımı bir ısı blok 100 ° C'de protein denatüre için 10 dakika içinde kuluçkaya. Protein örnekleri jel üzerine yükleyin.</li>
		<li>SDS-sayfa 100 V 10 dk, 1 cm alt jel yukarıda örneklerini çalıştırma kadar 45 dk sonra 150 V DC güç kaynağı ayarlayarak çalıştırın.</li>
		<li>Leke SDS sayfa jel Coomassie mavi (% 0.25 (w/v) Coomassie parlak mavi R250, %30 (v/v) metanol, % 10 (v/v) Asetik asit), 1 h için.</li>
		<li>Sonra boyama yordam Coomassie mavi leke kaldırmak ve uygulamak için protein jel üzerine de-boyama arabellek (%30 (v/v) metanol, % 10 (v/v) Asetik asit) > oda sıcaklığında 12 h.</li>
		<li>Jel 52 kDa band, HEVNP ORF2 varlığını doğrulamak için beyaz ışık altında belge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TEM kullanarak HEVNPs gözlemlemek.<ol>
<li>Hazırlamak veya HEVNP örnekleri için 0.5 - 2 mg/mL ile TEM görüntüleme için 10 mM MES pH 6.2 oranında seyreltin.</li>
		<li>40 mA kızdırma deşarj için 30 ile karbon kaplı Izgaralar iyonize hidrofilik karbon yüzey üretmek için s. Kızdırma boşaltma ekipmanları Malzemeleri tabloaçıklanmıştır. Not: Kılavuzlar hidrofilik karbon yüzeyinde sadece son 30 dakika sonra parlaklık için tedavi akıntı.</li>
		<li>Cımbız içinde tutun ve HEVNP örnek 2 µL tasarım kılavuzuna ekleyin, 15-30 s için bekleyin ve filtre kağıdı ile leke.</li>
		<li>Hemen GKD20 kılavuzla ve leke filtre kağıdı ile yıkayın.</li>
		<li>Hemen kılavuz, bekle 15 s sonra leke filtre kağıdı ile 2 µL % 2 uranyl asetat ekleyin. Kuru bir elektronik koyarak onları örnek Izgaralar kuru kabine O/n için Ceketinizi</li>
		<li>Izgarayı TEM ve resim 10-80 k büyütmede içine aktarın. HEVNPs ~ 27 çoğu boş icosahedral proteinleri olarak TEM içinde görünür nm çapında, viral RNA yokluğu nedeniyle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. kimyasal konjugasyon Biotin, kanser hedefleme Ligand ve Fluorophores ile HEVNPs
<ol><li>HEVNPs ve maleimide bağlı biotin bir adım konjugasyon gerçekleştirin.<ol>
<li>Tampon Değiştir: HEVNPs mini diyaliz birimlerinde uygulamak ve 0.01 M PBS pH 7.4 üreticinin iletişim kuralı (Tablo reçetesi) göre 1 h için oda sıcaklığında karşı diyaliz. HEVNPs 1.5 mL tüpler için aktarmak ve protein konsantrasyonu 280 ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak nm.</li>
		<li>(Bkz. Adım 2.2.4 ayrıntılarda) Cys tepki siteleri, maleimide-biotin (100 µM) 1:5 molar oranı yapmak için 0,01 M PBS, pH 7.4, eşit miktarda 18.8 µM eşdeğeri olan 1 mg/ml HEVNP karıştırın; O/N 4 ° C'de tepki İlişkisiz maleimide-biotin üreticinin iletişim kuralı (Tablo reçetesi) göre 40 K MWCO Spin Desalting sütun yordamı ile kaldırın.</li>
		<li>SDS-sayfa (Adım 3.1) küçültme bir standart ile örnekleri analiz.</li>
		<li>Standart prosedürler kullanarak, HRP bağlantılı Streptavidin kullanarak leke, chemiluminescent bir Western hazırlayın. Chemiluminescent sinyal tarafından X ray film (Şekil 2) yakalama.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İki adım LXY30 konjugasyon yüzey maruz sistein HEV NPs (şekil 5) gerçekleştirin.<ol>
<li>Arabellek Satım: HEVNPs mini diyaliz birimlerinde uygulamak ve 0.01 M PBS pH 7.4 oda sıcaklığında 1 h. 1,5 mL tüpler HEVNPs aktarmak için karşı diyaliz ve ölçmek protein konsantrasyonu 280 nm bir Spektrofotometre kullanarak.</li>
		<li>0,01 M PBS pH 7.4 200 µM CuSO4 ve 1 mM askorbik maleimide bağlı LXY30 oluşturmak için asit ile 650 µM maleimide-azid ve 650 µM ALKİN-LXY3010 ekleyin (Mal-LXY30) kuluçkaya 650 µM. 4 ° C'de karışımı O/n için</li>
		<li>Cys tepki sitesi 18.8 µM için eşdeğeri olan 1 mg/ml HEVNP mix (bkz. Adım 2.2.4 ayrıntılarda) yaklaşık % 10 ile Mal-LXY30 hacmi (650 µM) 1:3 molar oranı; yapmak için 0,01 M PBS pH 7.4, içinde O/N 4 ° C'de tepki Not: Mal-LXY30 nispeten yüksek konsantrasyon nedeniyle, 10 kat, onların zarar HEVNPs görmesini önlemek için karıştırma sonra Reaktanları CuSO4gibi son konsantrasyonları azaltılır. Başka bir seçenek Cu-Alerjik konjugasyon yöntemi15' tir.</li>
		<li>Kaldır bağlantısı çözülmüş maleimide-tıklayın-LXY30 bir sütunla 40 K MWCO Spin Desalting üreticinin protokolüne göre ( Tablo malzemelerigörmek). 4 ° C'de LXY30 bağlı HEVNPs (LXY30-HEVNPs) tutmak</li>
	</ol>
</li>
	<li>LXY30-HEVNPs ve Cy5.5 NHS ester (NHS-Cy5.5) bir adım konjugasyon gerçekleştirmek<ol>
<li>Cys tepki sitesi 18.8 µM için eşdeğeri olan 1 mg/ml LXY30 bağlı HEVNPs (LXY30-HEVNPs) mix (bkz. Adım 2.2.4 ayrıntılarda) NHS-Cy5.5 eşit hacmi ile (100 µM) 0.01 M PBS pH 7.4 1:5 molar oranı; yapmak içinde O/N 4 ° C'de tepki</li>
		<li>Kaldır bağlantısı çözülmüş Cy5.5-NHS bir 40K Spin MWCO Desalting sütun yordamını üreticinin protokolüne göre ( Tablo malzemelerigörmek). LXY30, Cy5.5 bağlı HEVNPs 4 ° C'de (LXY30-HEVNP-Cy5.5) tutmak</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. HEVNP bağlama ve MDA-MB231 meme kanseri hücrelerinin içselleştirilmesi
<ol><li>Tohum MDA-MB231 meme kanseri hücrelerinin içine bir 35 mm cam alt yemekleri (5 x 104 tabak başı) O/N kabine bir memeli hücre kültüründe.</li>
	<li>Hücre bağlama deneme için LXY30-HEVNP-Cy5.5 tarafından aşağıdaki adımları 4.2-4.3 hazırlayın. LXY30-HEVNP-Cy5.5 HEVNP ORF2 0,188 µM için eşdeğerdir 0.01 mg/ml seyreltik (2.2.4 adıma bakın), 0 - 250 µL içinde % 1 FBS/DMEM.<ol>
<li>Negatif kontrol örneği 0.01 mg/mL HEVNP-Cy5.5 adımı uygulayarak 4.3 konjuge NHS-Cy5.5 boya sadece, (HEV-Cy5.5) ama'hazırlayın. HEVNP-Cy5.5 HEVNP ORF2 0,188 µM için eşdeğerdir 0.01 mg/ml seyreltik (2.2.4 adıma bakın), %250 10 µL içinde FBS DMEM ile desteklenmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri bir kez 1 M PBS tamponunun pH 7.4 250 µL uygulayarak yıkayın. Hücre kültür tabak içinde bazı arabellek tutarken yıkama sonra PBS arabellek kaldırın.</li>
	<li>LXY30-HEVNP-Cy5.5 250 µL % 10 FBS FBS kültürlü MDA-MB231 meme kanseri hücreleri için DMEM ile birlikte % 10 DMEM veya HEVNP-Cy5.5 ile desteklenmiş uygulanır. Kalkan hücre ışık alüminyum folyo ile gelen yemekler kültürlü.</li>
	<li>Kültürlü hücre yemekleri bir 37 ° C hücre kültüründe içselleştirilmesi için 1 h için kabine tutun.</li>
	<li>Buz kültürlü hücrelerdeyse 3 kez, yıkama, 1 M PBS, pH 7.4 250 µL ile başına 5 dk yıkayın.</li>
	<li>% 4 hücreleri tamir PFA 1 M PBS, pH 7.4 20 min ve o zaman yıkama için 1 M PBS, pH 7.4 250 µL hemen ile içinde. Not: Hücreleri tarafından confocal mikroskop yansıması hazırsınız. Temsilcisi veri şekil 5' te gösterilmektedir.</li>
</ol>

<ol><li>Ludwig, C., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-like+particles-universal+molecular+toolboxes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Virus-like particles-universal molecular toolboxes.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).</li>
<li>Galaway, F. A., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS2+viruslike+particles%3A+a+robust%2C+semisynthetic+targeted+drug+delivery+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform.</a> Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).</li>
<li>Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-based+nanocarriers+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Virus-based nanocarriers for drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).</li>
<li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+activatable+viral+capsid+functionalized+for+cancer+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).</li>
<li>Jariyapong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hepatitis+E+virus-like+particle+as+a+carrier+for+oral-delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery.</a> Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).</li>
<li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+hepatitis+E+capsid+protein+self-assembles+into+a+dual-domain+T+%3D+1+particle+presenting+native+virus+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes.</a> Virology. 265 (1), 35-45 (1999).</li>
<li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+elements+of+the+capsid+protein+for+self-assembly+into+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).</li>
<li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+hepatitis+E+virion-sized+particle+reveals+an+RNA-dependent+viral+assembly+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway.</a> J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).</li>
<li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+configuration+of+hepatitis+E+virus+antigenic+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain.</a> J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+high-affinity+and+high-specificity+peptide+ligand+LXY30+for+in+vivo+targeting+of+%CE%B13+integrin-expressing+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+research%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors.</a> EJNMMI research. 6 (1), (2016).</li>
<li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+self-assembly+of+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).</li>
<li>Technologies, I. bL. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System: User Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf">http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf</a> (2015).</li>
<li>Peyret, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+gentle+purification+of+virus-like+particles+produced+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants.</a> J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).</li>
<li>Technologies, N. bL. <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/ProteinExpressionAnalysis/pdfs/NuPAGE_Bis-Tris_Mini%20Gels_Protocol.pdf">Vol. MAN0007891 1-2</a>. , Life Technologies. (2013).</li>
<li>Baskin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-free+click+chemistry+for+dynamic+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Genellikle hafta sürer, zaman alıcı genetik mühendisliği yordamı aksine burada biz basit iki adım ve ligand hedefleme kanser ekleme 3 gün içinde tamamlanabilir tek adımlı kimyasal konjugasyon yordamlar göstermek ve/veya Floresans algılama boya HEVNPs Cys/Lys sitelerine. Teknik-ebilmek var olmak kullanılmış için en iyi ligand hedef ekran aday havuzu ve böylece mevcut peptit/küçük molekül sentezi Hizmetleri makul maliyet ve teslimat teker yararlanır.
Geleneksel genetik hangi yalnızca polipeptitl...

Nano ölçekli vektörel çizimler nanotheranostics bilinen tedavi ve teşhis teslimat gelişimi çok hedeflenen teslimat1doğru Genelleştirilmiş tedaviler uzak Biyomedikal alanının kaymıştır. Hedeflenen nanotheranostic teslim stabil bir belirli hastalıklı doku ya da biyokimyasal yol2,3,4 theranostic moleküller doğrudan theranostic molekülleri ile nano ölçekli vektörel çizimler (nano tanecikleri) entegre . Çünkü en iyi şekilde ölçekli nano tanecikleri kapasite theranostic molekülleri ise stabilize ve seçmeli olarak hedef hücre yüzey molekülleri hastalıklı dokuları üzerinde sunulan Nanomedicine hedeflenen teslimat ön plana geldi. Birçok nanotheranostic platformlar hala pasif hücre alımı, ön-olgun bozulması, toksisite ve yetersiz Derneği theranostic molekülleri ile muzdarip. VIP birçok hedeflenen teslimat bu engelleri aşmak. Bunlar nanocarriers yabancı epitopları görüntülemek ve/veya küçük moleküller teslim için kullanılmıştır: birçok hastalıkları1mücadele için kullanılan bir rejimi. Bu uygulama ağırlıklı olarak mülkiyeti üzerinde dayanır kendinden montajlı yanı sıra verilen VIP için tasarlanmış uygulama yerine getirmek için genetik değişiklikler kolaylığı. Genetik mühendisliği için karşılaştırıldığında, VIP için yabancı peptidler kimyasal konjugasyon varlıklar, peptidler veya VIP yüzeyine içinde bir modüle Birleşik oligosakkaritler, gibi çok çeşitli izin verdiği için önemli bir avantaj görüntüler ve esnek şekilde VIP derleme değişiklik olmadan.
HEVNPs, rekombinant HEV kapsid protein, 2nd açık türetilen çerçeve (ORF2) okuma, bulaşıcı olmayan, kendi kendine capsids giriş ve hücre-bağlama verebilir montaj. HEV Mukozal iletimi için evrim çünkü monte kapsid protein proteolitik ve asidik Mukozal koşulları5' te aynı şekilde stabil. HEVNPs içi boş, T şeklinde depolama ve hem de sert fizyolojik koşulları son derece kararlı işleme oluşan 60 aynı birim6,7 , ORF2, / 1 icosahedral kapsid, =. Herhangi bir virüs genetik öğe eksik, verimli, yüksek verim üretim baculovirus ifade sistem böcek hücrelerinde yoluyla elde edilir. Onların proteolitik istikrar nedeniyle, kendi kendine monte HEVNPs çıkarılan ve süpernatant cep gerekli arıtma adımları önemli ölçüde azaltarak saf. Ayrıca, HEVNPs kararlı bir icosahedral üs için esnek bir menteşe ile bağlı bir yüzey maruz çıkıntı etki (P) sahip. Esnek menteşe, önemli temel icosahedral yapısı ödün vermeden P etki alanı değiştirmek olanak verir iken yüzey maruz sivri icosahedral Bankası üstüne P etki alanı oluşturur. 60 tekrarlanan birimleri ile kimyasal modülasyon için 60 simetrik siteleri tek siteye özgü değişiklik sonuçlanır. Son zamanlarda, bir nano-platform önerilen kimyasal ligandlar veya theranostic uygulamalar için küçük moleküller eşlenik HEVNP kullanarak. Bu tek bir amino asit ile sistein HEV-VIP çıkıntı etki tepki site maleimide bağlı peptidler veya molekül ile değiştirerek sağlanır. HEV-VIP ve iyi okudu immünojenik epitopları8,9önceki yapısal çözümleme bağlı olarak, aşağıdaki beş HEV-VIP amino asitler olarak potansiyel adaylar sistein ile değiştirildi: Y485C, T489C, S533C, N573C ve T586C ( Şekil 1). İfade ve arıtma böcek hücrelerden sonra onların VIP oluşumları transmisyon elektron mikroskobu (TEM) gözlem (Şekil 2) tarafından teyit edildi ve maruz sistein siteleri Western tarafından analiz edildi leke maleimide bağlı biotin sonra fiil (Şekil 2). Beş mutantlar arasında HEVNP - 573C maleimide-biotin konjugasyon (Şekil 2) en güçlü sinyal göstermek ve nanocarrier meme kanser hücresi4 (şekil 3) hedefleme için gücümüzü izleme için kullanıldı.
Bu iletişim kuralı tümör hedefleme molekülleri HEVNPs için yüzey sistein konjugasyon eklemek için kimyasal konjugasyon yöntemleri gösterilmektedir. Rekombinant HEVNPs içeren N573 adlı bir sistein ile tümör hedefleme ve algılama molekülleri'tümör dır konjugasyon detay (HEVNP - 573C). Peptid, forma LXY30-HEVNP (şekil 4) LXY3010 HEVNPs için hedefleme meme kanser tümörü bağlamak için bir tıklama kimya konjugasyon işlemdir üzerinde duruldu. Daha sonra N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 LXY30-HEVNP-Cy5.5 floresan algılama için her iki vitro (şekil 5) oluşturmak için HEVNPs ayrı Lys ücreti için Birleşik ve içinde vivo4.

<table><tbody><tr><td>MINI Diyaliz Üniteleri, 10K MWCO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69572</td><td>mini diyaliz ünitesi</td></tr><tr><td>High Five Cells Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>Tn5 hücreleri</td></tr><tr><td>SF9 Hücreleri&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Sf9 hücreleri</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Ekspresyon Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11101, A11100</td><td>Baculovirus ekspresyon sistemi</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Ekspresyon Sistemi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024</td><td>Bacmid</td></tr><tr><td>ESF921 Böcek Hücresi Medya</td><td>İfade Sistemleri LLC</td><td>96-001-01</td><td>böcek hücre ortamı</td></tr><tr><td>Cy5.5 NHS ester, 5mg</td><td>Lumiprobe Corp</td><td>27020</td><td>Cy5.5 NHS ester</td></tr><tr><td>Zeba Spin Tuz Giderme Kolonları, 40K MWCO, 0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>87766</td><td>spin tuzdan arındırma kolonu</td></tr><tr><td>MES Hidrat</td><td>Sigma-Aldrich Chemical Co</td><td>M8250-250G</td><td>MES</td></tr><tr><td>Ultra Şeffaf Santrifüj İnce Duvar Ultra Santrifüj Tüpleri</td><td>Beckman Coulter, Inc</td><td>Rotora Bağlıdır</td><td>ultrasantrifüj tüpü</td></tr><tr><td>NuPage% 4-12 Bis-Tris Protein Jelleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NPO321BOX</td><td>SDS protein jeli</td></tr><tr><td>Cellfectin II Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>EMS Kızdırma Deşarj Elektron</td><td>Mikroskobu Bilim</td><td></td><td>kızdırma deşarj edici</td></tr></tbody></table>

hepatit e virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey functionalization

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virüs gibi parçacıklar (VIP) nanocarriers yabancı epitopları görüntülemek ve/veya algılama ve çeşitli hastalıkların tedavisinde küçük moleküller teslim etmek için kullanılmaktadır. Bu uygulama üzerinde genetik değişiklik, kendinden montajlı dayanır ve sistein konjügasyon, rekombinant VIP'ler. tümör hedefleme uygulama yerine getirmek ile genetik karşılaştırıldığında yabancı peptidler VIP'ler için değişiklik yalnız, kimyasal konjugasyon sunar bir önemli avantaj varlıkları, sentetik peptidler veya oligosakkaritler VIP yüzeye bir modüle edilmiş ve esnek şekilde VIP derleme değişiklik olmadan Birleşik, gibi çeşitli sağlar çünkü.
Burada, biz nasıl hepatit E virüs nanopartikül (HEVNP), bir modularized theranostic kapsülü, bir çok fonksiyonlu teslim taşıyıcı olarak kullanıldığını göstermektedir. HEVNPs fonksiyonlar doku hedefleme, görüntüleme ve tedavi teslim. HEVNP köklü yapısal araştırmaya dayalı, yapısal olarak bağımsız ve yüzey Günese maruz kalan artıkları sistein yerine konjugasyon siteleri maleimide bağlı kimyasal gruplar thiol seçici bağlantıları üzerinden için seçildi. Belirli bir sistein-modified HEVNP (573, asparagine Cys yerine aa (HEVNP - 573C)) için bir meme kanseri hücre özgü ligand, LXY30 Birleşik ve tümör hedefli işleme yakın kızılötesi (Nur) floresan boya ile (Cy5.5), etiketli Etkili tanı kapsül (LXY30-HEVNP-Cy5.5) olarak HEVNPs. Benzer mühendislik stratejileri tanınmış atomik yapıları ile diğer makromoleküllerin kompleksleri ile theranostic teslim potansiyel uygulamalar keşfetmek için istihdam edilebilir.

HEV-VIP, benzer tüm Cys oluşan HEVNPs çözünür icosahedral capsids değiştirilebilir ve çözümde üretim veya arıtma sırasında toplam değil. Önce ve sonra tek adım maleimide-biotin konjügasyon, her biri Cys modifiye HEVNPs HEV-VIP negatif leke EM (Şekil 2) içinde ayırdedilemez. Maleimide-biotin konjugasyon verimliliği Cys değiştirilmiş HEVNPs ilk Batı chemiluminescent streptavidin bağlama yoluyla kurutma ile test edildi. Maleimide-biotin oluşun Cys görüntülenen H...

Biz-si mühendislik hepatit E virüs kapsid protein theranostic nanopartikül (HEVNP). HEVNP icosahedral istikrarlı Mukozal teslim kafese kendi kendine monte edilerek üretilir. Burada, HEVNPs değiştirilmesi yüzey Günese maruz kalan kalıntıları özellikle tümör hücreleri bağlamak sentetik ligandlar çekimlerine katıldı diziyi değiştirerek hedefleme tümör için açıklamak.

Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

HEV nanopartiküllerinin yüzeyinin kimyasal olarak fonksiyonelleştirilmesinin genel amacı; tanı ve tedavi amacıyla, hedefleyici immünojenik, terapötik ve diyagnostik moleküllerin HEV nanopartiküllerinin yüzeyine konjugasyonu için tekrarlanabilir ve tutarlı bir yaklaşım sağlamaktır.Bu yöntem, kanserin hedeflenmesinin artırılmasının ve nanoterapötiklerin dağılımının nasıl izlenebileceği gibi nanotıp alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı; genetik mühendisliğine kıyasla yüksek düzeyde tekrarlanabilir, verimli ve uygulanmasının çok daha kolay olmasıdır.Prosedürleri, laboratuvarımızdan araştırma asistanları Michelle Nguyen ve Ivan Ruiz uygulamalı olarak gösterecekler.Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı şekilde hepatit E virüsü nanoparçacık üretimi ve saflaştırılması ile başlayın.TEM görüntüleme için HEV nanoparçacık örneklerini 10 millimolar MES, pH 6.2 ile mililitre başına 0.5 ile iki miligram arasına seyreltin. Hidrofilik bir karbon yüzey oluşturmak için karbon kaplı gridleri 40 milliamp glow discharge ile 30 saniye boyunca iyonize edin. Gridlerin hidrofilik karbon yüzeyi, glow discharge işleminden sonra sadece 30 dakika boyunca

surface-functionalization-hepatitis-e-virus-nanoparticles-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Heterokaryon Oluşumu İki Yöntemleri HCV Sınırlayıcı Etkenler Discover

Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için...

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

Bitki viral nanopartiküller (VNPs) biyomedikal uygulamalar için platformlar umut vericidir. Burada, biz bitki VNP yayılımı, saflaştırma, karakterizasyon ve bioconjugation ilişkin prosedürler anlatılmaktadır. Son olarak, biz bir fare ksenogreft model ve floresan görüntüleme kullanılarak tümör homing ve görüntüleme için VNPs uygulama göstermektedir.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

Kaynak: Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, indirgenmiş disülfitlerin bir polietilen glikol (PEG) bağlayıcı ile yeniden köprülenmesi yoluyla virüs benzeri parçacıkların floresan fonksiyonelleştirmesini göstererek, biyomedikal uygulamalarda hücresel görüntüleme ve hedeflenmiş iletim için uygun, kararlı ve izlenebilir konjugatlar üretmektedir.

Disülfür Yeniden Köprüleme Yoluyla Virüs Benzeri Partiküllerin Floresan Fonksiyonelleştirilmesi

Kaynak: Chen, C. C., et al. Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, geçirimli elektron mikroskobu ile görüntüleme amacıyla hepatit E virüsü benzeri nanopartiküllerin hazırlanmasını ve negatif boyanmasını göstermektedir. Yöntem, kendi kendine monte olmuş sadece kapsid içeren partiküllerin yapısal bütünlüğünü vurgulayarak, yüksek çözünürlüklü görüntüleme yoluyla bunların tekdüzeliğini ve saflığını...

Hepatit E Virüsü Nanopartiküllerinin Transmisyon Elektron Mikroskopisi ile Görüntülenmesi

Bu el yazması imal ve insan immün yetmezlik virüsü tip 1 bulaşmasına karşı güçlü yapıştırıcı ve antiviral faaliyet göstermek Griffithsin-modified Poli (laktik-co-glikolik asit) electrospun lifler karakterize için yordamı açıklar vitro. Sentez için kullanılan bir yöntem yüzey-değiştirmek ve elde edilen morfolojisi, konjugasyon, karakterize ve Griffithsin desorpsiyon yüzey-modified liflerinden açıklanmıştır.

İmalat ve Fiber Griffithsin-modified iskele karakterizasyonu önlenmesi için cinsel enfeksiyonlar iletilen

Burada, fluorescently Qβ VIP üzerinde disulfides dibromomaleimide ile functionalize için bir yordam mevcut. Biz Qβ ifade ve arıtma, molekülleri dibromomaleimide functionalized sentezi ve dibromomaleimide ve Qβ arasında konjugasyon tepki açıklanmaktadır. Elde edilen Sarı floresan konjuge parçacık bir floresan sonda hücrelere olarak kullanılabilir.

Konjugasyon kaynaklı floresan pegile virüs benzeri moleküller tarafından Dibromomaleimide-disülfür Kimya yapma

Burada açıklanan protokol araştırmacılar özellikle adenovirus capsids seçilen siteler tarafından basit Kimya değiştirmek sağlar. Korumalı adenovirus parçacıklar vektörler ve yeniden hedeflenen gen transferi vektörel çizimler oluşturulacak ve vektör ana etkileşimler okudu.

Genetik ve kimyasal kapsid değişiklikler Adenovirus tabanlı gen transferi vektörlerin koruyucu ve hedefleme için kombine

Model antijen ovalbumin'in in vivo dendritik hücre hedeflemesi için endositoz reseptörüne özgü antikora kimyasal konjugasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, antikorun saflaştırılmasını, antijenin kimyasal konjugasyonunu, ayrıca konjugenin saflaştırılmasını ve verimli konjugasyonun doğrulanmasını içerir.

Vitro ve In Vivo'da Fare Dendritik Hücrelerini Hedeflemek için Tam Uzunlukta Proteinli Saflaştırılmış DEC-205 Yönlendirilmiş Antikorun Kimyasal Konjugasyonu

Mevcut protokol, HA, S glikoproteini, ilgili hibrid tip glikanlar ve yüksek mannoz oligosakkaritlerine CV-N bağlanmasını incelemek için SPR bağlanma testleri için yeni araçları açıklamaktadır. SPR, bu glikanlara dimerik veya monomerik CV-N'yi bağlamak için KD'yi belirlemek için kullanılır.

Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral Ajanların Mühendisliği

Konakçı sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit ile bağlanma afinitesini (KD) ölçmek için izotermal titrasyon kalorimetrisini kullanarak, viral giriş öncesi ve sonrası yaşam döngüsü aşamalarını hedefleyen anti-hepatit B virüsü (HBV) bileşiklerini taramak için bir protokol sunuyoruz. Antiviral etkinlik, viral yaşam döngüsü belirteçlerinin (cccDNA oluşumu, transkripsiyon ve viral montaj) baskılanması yoluyla belirlendi.

Terapötik Hedef Olarak Polipeptitin Sodyum Taurokolat Kotransportasyonu Yoluyla Hepatit B Virüsü Girişini İnceleyen Yetkin Bir Hepatosit Modeli

Keşfedin hepatit E virüsü nano taneciklerinin kimyasal konjugasyon yöntemleriyle yüzey modifikasyonunu. Bu tekrarlanabilir teknik, kanser hücrelerine hedeflenmiş tanı ve tedavi için nanotıpta uygulama sağlar.

Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

Daha fazla video keşfet