Vasculogenesis Kinetik analizi Vasculogenesis ve anjiogenezi Vitro dinamiklerini Quantifies

Bu deneysel yöntemin genel amacı, zaman içindeki dinamik vaskülogenez sürecini görselleştirmek ve nicelleştirmektir. Bu yöntem, anjiyogenez ve vaskülogenez alanlarında, damar oluşum oranları ve oluşan ağ yapısal modelleri arasındaki farklar hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok sayıda vaskülogenez zaman noktasının ölçülmesini sağlayarak vaskülojenik sürecin kinetiğini değerlendirmek için bir fırsat sağlamasıdır.

Bu yöntem, bireysel hücre popülasyonlarının veya ko-kültür sistemlerinin incelenmesi için vaskülogenez veya anjiyogenez süreçlerini etkileyen herhangi bir hücre popülasyonuna veya patolojik duruma uygulanabilir. Deneye başlamadan yaklaşık bir ila iki saat önce, bir Mikroskop Aşamalı Üst İnkübatörü 37 santigrat dereceye ısıtın ve karbondioksiti %5'e ve nemi% 85'e ayarlayın Boşsa inkübatörün nem haznesini doldurun. Canlı hücre odasını mikroskobun üzerine yerleştirin ve ardından canlı hücre odası içindeki iki açık konumdan birine boş bir odacıklı slayt yerleştirin.

Slaytı damıtılmış suyla doldurun ve slaytları aşağıdan ısıtmak ve yoğuşmayı en aza indirmek için ikincil bir üfleyiciyi 39 ila 42 santigrat dereceye ayarlayın. Canlı hücre görüntüleme odası içinde uygun sıcaklık ve nemin korunması, deneyin başarısı için kritik öneme sahiptir. Deneysel slayt eklenene kadar ikinci bir slaydı boş olarak ekleyin.

Ardından, görüntüleme deneyi sırasındaki koşulları taklit etmek için ikinci slayttaki kuyuları çevreleyen rezervuarlara su ekleyin. Deney odası slaytını bazal membran matrisi ile yüklemek için, önce 20 mikrolitrelik bir pipeti soğuk 20 mikrolitrelik pipet ucuyla yükleyin ve ucun ucundan yaklaşık bir santimetre kesmek için makas kullanın. Pipet hacmini 10 mikrolitreden biraz daha yüksek olacak şekilde ayarlayın ve matrisi yavaşça değiştirilmiş pipet ucuna aspire edin.

Pipet ucunu hemen bir sürgü kuyusunun ortasına yerleştirin, ucu kuyunun dibine hafifçe dokundurun ve matrisi dışarı itmek için pistona yavaşça basın. 15 kuyucuğun tümüne matris ekledikten sonra, kapağı sürgünün üzerine sonuna kadar itin. Matrigel hacimlerinin her bir kuyucuğa doğru ve tutarlı bir şekilde pipetlenmesi, yüksek kaliteli faz kontrast görüntüleri elde etmek için kritik öneme sahiptir.

Ardından, matris dehidrasyonunu azaltmak için slaytı 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede iki ila üç mililitre PBS ile doldurulmuş 50 mililitrelik konik bir tüp kapağının yanına yerleştirin. Matris katılaştığında, süpernatanı gece boyunca kültürlenmiş bir endotelyal koloni oluşturan hücre kültüründen çıkarın ve hücreleri yedi mililitre PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin, hücreleri iki ila üç mililitre Tripsin ile 37 santigrat derecede iki ila beş dakika boyunca yıkayın ve çıkarın.

Daha sonra, herhangi bir hücre kümesini parçalamak ve elde edilen hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için ayrışmış hücreleri üç mililitre Endotelyal Büyüme Ortamı-2 içinde yeniden süspanse edin. Endotelyal koloni oluşturan hücre örneklerinin tümü yeniden süspanse edildikten sonra, hücreleri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve peletleri bir ila iki mililitre taze Endotelyal Büyüme Ortamında yeniden süspanse edin. Her numunedeki canlı hücrelerin sayısını sayın ve hücrelerin 175 mikrolitre orta konsantrasyon başına 1.4 kez 10 ila dördüncü hücreye seyreltilmesine izin vermek için yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe yeterli miktarda endotelyal koloni oluşturan hücre ekleyin.

Ardından, her bir ana karışımı nazik pipetleme ile karıştırın. Sürgülü kapağı çıkarın ve her bir ana karışımdan 50 mikrolitre oyuklu olarak lam üzerine üç nüsha halinde bırakın. Hücreleri görüntülemek için, boş slaytı bir deneysel slaytla değiştirin ve slayttaki hücreleri çevreleyen rezervuarlara su ekleyin.

Her aşama konumu arasında geçiş yapın ve ilk kuyunun merkezinin seçildiğini onaylayın. Kuyucukta kaplanmış hücrelere odaklanın ve sahnenin Z konumunu ayarlayın. Ayarlar doğru olduğunda, görüntüleme deneyine başlamak için ışıkları söndürün.

Görüntüleme tamamlandığında, görüntü yığını dosyalarını Image Capture yazılımı içinde ölçeklendirin ve dışa aktarın, görüntüleri analiz için TIFF dosyaları olarak kaydedin. Görüntüleri analiz etmek için, yazılımı açmak için Vaskülogenezin Kinetik Analizi dosyasını klasöründen yazılım penceresinin altındaki gri çubuğa sürükleyin ve yazılımı listeye eklemek için Kaydet'e tıklayın. Açılacak görüntü dosyasını seçmek için Dosya ve Aç'a tıklayın veya görüntü dosyasını yazılım içindeki gri çubuğa sürükleyin.

Parlaklık/Kontrast penceresini açmak için Görüntü, Ayarla ve Parlaklık/Kontrast'a tıklayın. Görüntüyü görselleştirmek için Brightness (Parlaklık/Kontrast) penceresinde Reset (Sıfırla) öğesine tıklayın. Ardından, görüntüleri 8 bit'e dönüştürmek için Görüntü, Tür ve 8 bit'e tıklayın.

Araçlar ve İlgi Alanı Yöneticisi'ni seçin ve yeni bir ilgi alanı oluşturmak için uygun şekilde şekillendirilmiş bir seçim aracı kullanın. İlgi bölgesi şeklini İlgi Alanı Yöneticisi penceresine eklemek için Ekle'ye tıklayın ve bölgeyi görüntüde görüntülemek için İlgi Alanı Yöneticisi'ndeki İlgi Bölgesi etiketine tıklayın. İlgilendiğiniz bölgeyi gerektiği gibi ayarlayın.

Bölge yerine oturduğunda, görüntüyü kırpmak için Görüntü'yü ve ardından Kırp'ı tıklayın. Ardından, Düzen menüsünü açın ve yığındaki her görüntü için ilgilenilen bölgenin dışındaki görüntü verilerini silmek için Dışını Temizle'yi seçin. Ardından, Eklentiler menüsünü açın ve Analyze Network eklentisini seçin.

Eşikleme Yöntemini değiştirmek için açılır penceredeki açılır oku kullanın ve yazılım işlemeyi başlatmak için Tamam'a tıklayın. Analizin sonunda, bir veri tablosu ve İskelet ve Maske yorumlamalarını gösteren bir kaynaşmış görüntü yığını açılacaktır. Sayısal değerleri bir elektronik tabloya aktarmak için Dosya ve Farklı Kaydet'i tıklatın ve ham veri değerlerini içeren elektronik tabloyu kaydedin.

Kaynaşmış İskelet ve Maske görüntüsüne tıklayın ve kaynaşmış İskelet Maskesi görüntü yığınını ve kırpılmış faz kontrast görüntü yığınını TIFF dosyaları olarak kaydedin. Ardından, İlgi Alanı Yöneticisi penceresine tıklayın, görüntüleri kırpmak için kullanılan ilgi bölgesini seçin ve ilgilenilen bölgeyi ileride kullanmak üzere kaydetmek için Diğer'e ve Kaydet'e tıklayın. Vaskülogenezin Kinetik Analizi ile tanımlanan endotelyal koloni oluşturan hücre ağları, yazılım tarafından miktar tayini için kullanılan yapıları göstermek için resimli olarak İskelet ve Maske yorumlamaları olarak temsil edilir.

Faz kontrast görüntülerinin kalitesi yüksek olduğunda ve yeterli kontrast elde edildiğinde, Vaskülogenezin Kinetik Analizi, faz kontrast görüntüsü ile Vaskülogenez tarafından oluşturulan İskelet ve Maske yorumlamalarının Kinetik Analizi arasında gözlemlenen benzerliklerin gösterdiği gibi endotelyal koloni oluşturan hücre ağlarını doğru bir şekilde tanımlayacaktır. Faz kontrastlı görüntüler yüksek kontrasta sahip değilse veya ızgaralama gibi görüntüleme artefaktları meydana gelirse, ağ algılama doğruluğu azalır ve sonuçlar belirsiz hale gelir. Bununla birlikte, burada gösterilen Ortalama ve Otsu gibi farklı eşikleme yöntemleri, görüntü kalitesindeki farklılıklara uyum sağlamak için yazılım açılır menüsünde analizden önce seçilebilir.

Gestasyonel diabetes mellitusa maruz kalan endotelyal koloni oluşturan hücrelerin ağ oluşumunun değişmiş kinetiğini gösterip göstermediğini belirlemek için Vaskülogenezin Kinetik Analizinin kullanılması, komplike olmayan bir gebelikten elde edilen endotelyal koloni oluşturan hücre kültürlerine kıyasla gestasyonel diabetes mellitus kültürlerinde heterojen olarak değişmiş ağ yapısı oluşumunu ortaya çıkarır. Gerçekten de, komplike olmayan gebelik örnekleri, gestasyonel diabetes mellitus örneklerine kıyasla tipik olarak daha fazla sayıda kapalı ağ oluşturur. Bununla birlikte, endotelyal koloni oluşturan hücre örneklerinin tümü, oluşum oranları ve elde edilen maksimum ağ sayısı örnekler arasında değişse de, genel olarak iki fazlı bir ağ oluşumu modeli sergiler.

Bu prosedürü takiben, Vaskülogenezin Kinetik Analizi ile oluşturulan veri değerleri, farklı numuneler tarafından oluşturulan ağ yapılarının istatistiksel olarak farklı olup olmadığını ve eğer öyleyse hangi zaman noktalarında olduğunu belirlemek için grafiklendirilebilir ve analiz edilebilir. Vaskülogenezin Kinetik Analizi, çok sayıda görüntü içeren hızlandırılmış deneylerin verimli bir şekilde işlenmesini sağlar. Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm sistemler düzgün çalışıyorsa görüntü alımı, son işleme ve analiz iki gün içinde tamamlanabilir.