Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi
May 25th, 2017
Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.
Bu prosedürün genel amacı, Xenopus tropicalis kurbağa yavrularının damar sistemini görselleştirmektir. Bu yöntem, anjiyogenezin nasıl düzenlendiği gibi kardiyovasküler biyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sağlam bir kuyu tipi embriyodaki kan damarlarının basit bir floresan boya enjeksiyonu ile görüntülenebilmesidir.
Konik bir cam mikro pipeti yaklaşık beş mikrolitre şeffaf diI asetillenmiş LDL çözeltisiyle doldurmak için bir mikro yükleyici kullanarak başlayın ve çökelmiş parçacıkların yüklenmemesine dikkat edin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, yüklenen kompleksin hacmini ayarlamak için pipetin ucunu kırpmak için ince bir çift 55 forseps kullanın ve basınç kontrollü enjeksiyon sistemini enjeksiyon başına yaklaşık beş nano litre çözelti çıkaracak şekilde ayarlayın. Daha sonra pipet ucunu %0,04 MS-222'ye, 0,1X modifiye Barth'ın tuzlu suyuna veya MBS'ye özel yapım bir Sylgard kalıbına daldırın.
Daha sonra Xenopus tropicalis embriyosunu Sylgard kalıbına aktarın ve sırt yüzgeci stimülasyonuna yanıt eksikliği ile tam sedasyonu onaylayın. Diseksiyon mikroskobu altında, embriyo ventral tarafını hafif eğik bir pozisyonda kalıbın V şeklindeki girintisine yükleyin. İki adet 0.1 milimetrelik küçük pimi bir pim tutucuya sıkıca takın ve gözle görülür şekilde nabız atması gereken kalbin üzerindeki cildi delmek için bir pim kullanın.
Pimi kalbi delmeden kalp ile cilt arasındaki boşlukta bulunan delikten sokun ve takılan ucu kesi yapılacak bölgenin içine yerleştirin. Ardından, doğrusal bir kesi yapmak için ikinci pimi takılan pime sürtün ve kesiyi nazikçe genişletmek için her iki pimi birlikte kullanarak kalbi açığa çıkarın. DiI asetillenmiş LDL çözeltisini enjekte etmek için, cam pipet ucunu kalbe yerleştirin ve yaklaşık 10 ejeksiyon darbesinde 50 ila 60 nano litre DiI asetillenmiş LDL enjekte edin.
Boya çözeltisinin tamamı verildiğinde, kalbin hala attığını onaylayın ve embriyoyu 0.1X MBS içeren yeni bir Petri kabına aktarın. Beş ila 10 dakika sonra, kurbağa yavrusu anesteziden kurtulmalı ve hareket etmeye başlamalıdır. Uygun sayıda embriyo enjekte edildikten sonra, doğru şekilde etiketlenmiş anestezi uygulanmış embriyoları, diğer organları etiketlenmiş hayvanları atarak bir floresan mikroskobu altında görsel olarak tarayın.
Yeterince etiketlenmemiş embriyolar tekrar enjekte edilebilir. Daha sonra doğru şekilde etiketlenmiş embriyoların görüntülerini yakalayın. Kan damarlarının daha kapsamlı bir şekilde görüntülenmesi için, yeniden anestezi altına alınmış embriyoları, konfokal mikroskopi ile görselleştirme için ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
Kalbe yeterli miktarda diI asetillenmiş LDL enjekte edilirse, arka kardinal ven veya PCV, bir floresan mikroskobu altında hemen görünür olmalıdır. İntersomitik venler veya ISV'ler, evre 36'da başlayan ve evre 40 ila 41 civarında sona eren ve evre 43 civarında hafifçe dallanan anterior ila posterior dalgada PCV'den dorsal olarak çıkar. PCV ve ISV'ler, sıkı gelişimsel kontrol altında olan stereotipik bir anjiyojenik paternde büyür.
İlginç bir şekilde, TIE-2 sinyallemesinin antisens morfalinonlar tarafından yıkılması, ISV'lerin uzunluğunu ve karmaşıklığını azaltırken, TIE-2'nin yapısal olarak aktif formunun ekspresyonu aşırı ISV dallanmasına neden olur. ISV'lerin karmaşıklığını değerlendirmek için bir Damar Karmaşıklık İndeksi hesaplanabilir ve embriyonik Xenopus tropicalis vaskülatürünün genel mimarisini görselleştirmek için işlenmiş yollar oluşturulabilir. Orijinal protokol, Levin ve Colics tarafından Xenopus laevis kullanımı için tanımlandı ve biz de onu Xenopus tropicalis için uyarladık.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa bir saat içinde tamamlanabilir. Bu işlemden önce, hangi genlerin ve sinyal yolaklarının vasküler gelişimi düzenlediği gibi ek soruları yanıtlamak için genetik ve farmakolojik manipülasyonlar yapılabilir. Bu prosedür kullanılarak, etiketlenmiş damar sistemi sağlam bir hayvanda gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir ve vasküler gelişimin dinamiklerini araştırmak için güçlü bir araç sağlar.
Bu videoyu izledikten sonra, damar sistemini görselleştirmek için bir Xenopus tropicalis kurbağa yavrusunun kalbine diI asetillenmiş LDL'nin nasıl enjekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, Xenopus tropicalis'teki vaskülatürü görselleştirmek ve kompleksitesini ölçmek için floresan tabanlı bir yöntemi gösterir. Teknik, embriyonun kalbine floresan boya enjeksiyonu yapıldıktan kısa bir süre sonra kan damarlarının görüntülenmesini sağlayarak, in vivo kardiyovasküler gelişim üzerine yapılan araştırmaları kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyovasküler biyoloji
- Anjiogenez
- Gelişimsel biyoloji
Arka Plan
- Xenopus tropicalis, omurgalı gelişimini incelemek için bir model organizmadır.
- Vasküler gelişimi anlamak, çeşitli hastalıklar hakkında bilgi edinmek için önemlidir.
- Floresan görüntüleme teknikleri, biyolojik yapıların görselleştirilmesini artırır.
- Bu yöntem, vasküler değişikliklerin gerçek zamanlı gözlemi için izin verir.
Çalışmanın Amacı
- Xenopus tropicalis dikenli balıklarının vaskülatürünü görselleştirmek.
- Anjiogenezin düzenlenmesini araştırmak.
- Kardiyovasküler gelişimi incelemek için basit ve etkili bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Embriyoyun kalbine floresan boya enjeksiyonu.
- Presiz boya teslimatı için mikro yükleyici ve konik cam mikro pipet kullanımı.
- Diseksiyon mikroskobu altında kan damarlarının görselleştirilmesi.
- Vaskülatür üzerindeki etkileri incelemek için genetik ve farmakolojik manipülasyonların uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Tamamen sağlam embriyolarda kan damarlarının başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Görüntüleme yoluyla elde edilen vasküler kompleksite ölçümü.
- Kardiyovasküler gelişimin dinamikleri hakkında elde edilen bilgiler.
- Floresan boya enjeksiyonu yönteminin etkinliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Protokol, vasküler gelişimi incelemek için güvenilir bir yöntem sağlar.
- Floresan görüntüleme, gerçek zamanlı analiz için güçlü bir araçtır.
- Bu yaklaşım, kardiyovasküler biyoloji üzerine daha fazla araştırmayı kolaylaştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of vascular complexity in a vertebrate model, supporting early-stage target validation in angiogenesis pathways. By providing quantitative readouts of vessel sprouting and branching, it facilitates mechanistic de-risking of vascular targets before committing to lead identification campaigns. The Xenopus tropicalis system offers a disease-relevant platform for assessing angiogenic phenotypes with predictive confidence in preclinical cardiovascular research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding angiogenic regulators such as TIE-2 signaling through direct observation of vessel sprouting patterns.
- Operational Value: Provides a rapid, one-week workflow to assess gene or pathway impact on vascular development without requiring genetically engineered models.
- Predictive Value: Quantifiable outputs like the Vein Complexity Index support objective assessment of target modulation effects for portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible vascular labeling compatible with downstream imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Enables measurement of intersomitic vein length and branching complexity as dose-responsive readouts for compound screening.
- Scalability: Simple dye injection and imaging procedure supports medium-throughput evaluation of pharmacological or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models stereotypic angiogenesis in Xenopus tropicalis, offering insight into human vascular development pathways.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation through conserved angiogenic mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Allows rapid testing of pathway modulators to clarify target biology before investing in mammalian model studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing vascular phenotype data that informs go/no-go decisions in angiogenesis-focused programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to quantifiable changes in vascular architecture.
- Screening: Delivers reproducible, imaging-based readouts suitable for evaluating compound effects on angiogenic sprouting.
- Analytics: Provides quantitative vascular complexity metrics that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Leverages conserved angiogenesis mechanisms to support continuity from embryonic models to mammalian vascular systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis target projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, quantitative visualization of vascular networks.
- Operational Value: Standardizes vascular assessment via simple dye injection and reproducible imaging, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of vascular targets, reducing late-stage failure risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of angiogenesis modifiers based on quantitative phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for embryo handling and cardiac microinjection.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure for vessel visualization and image capture.
- Necessitates standardization of embryo staging and injection timing for consistent vascular labeling.
- Involves adaptation considerations when extending findings to other model systems or human relevance contexts.
- Practical limitations include reliance on embryonic accessibility and the need for careful optimization of dye concentration to avoid non-specific labeling.
