Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi
25 Mayıs 2017
Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.
Bu prosedürün genel amacı, Xenopus tropicalis kurbağa yavrularının damar sistemini görselleştirmektir. Bu yöntem, anjiyogenezin nasıl düzenlendiği gibi kardiyovasküler biyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sağlam bir kuyu tipi embriyodaki kan damarlarının basit bir floresan boya enjeksiyonu ile görüntülenebilmesidir.
Konik bir cam mikro pipeti yaklaşık beş mikrolitre şeffaf diI asetillenmiş LDL çözeltisiyle doldurmak için bir mikro yükleyici kullanarak başlayın ve çökelmiş parçacıkların yüklenmemesine dikkat edin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, yüklenen kompleksin hacmini ayarlamak için pipetin ucunu kırpmak için ince bir çift 55 forseps kullanın ve basınç kontrollü enjeksiyon sistemini enjeksiyon başına yaklaşık beş nano litre çözelti çıkaracak şekilde ayarlayın. Daha sonra pipet ucunu %0,04 MS-222'ye, 0,1X modifiye Barth'ın tuzlu suyuna veya MBS'ye özel yapım bir Sylgard kalıbına daldırın.
Daha sonra Xenopus tropicalis embriyosunu Sylgard kalıbına aktarın ve sırt yüzgeci stimülasyonuna yanıt eksikliği ile tam sedasyonu onaylayın. Diseksiyon mikroskobu altında, embriyo ventral tarafını hafif eğik bir pozisyonda kalıbın V şeklindeki girintisine yükleyin. İki adet 0.1 milimetrelik küçük pimi bir pim tutucuya sıkıca takın ve gözle görülür şekilde nabız atması gereken kalbin üzerindeki cildi delmek için bir pim kullanın.
Pimi kalbi delmeden kalp ile cilt arasındaki boşlukta bulunan delikten sokun ve takılan ucu kesi yapılacak bölgenin içine yerleştirin. Ardından, doğrusal bir kesi yapmak için ikinci pimi takılan pime sürtün ve kesiyi nazikçe genişletmek için her iki pimi birlikte kullanarak kalbi açığa çıkarın. DiI asetillenmiş LDL çözeltisini enjekte etmek için, cam pipet ucunu kalbe yerleştirin ve yaklaşık 10 ejeksiyon darbesinde 50 ila 60 nano litre DiI asetillenmiş LDL enjekte edin.
Boya çözeltisinin tamamı verildiğinde, kalbin hala attığını onaylayın ve embriyoyu 0.1X MBS içeren yeni bir Petri kabına aktarın. Beş ila 10 dakika sonra, kurbağa yavrusu anesteziden kurtulmalı ve hareket etmeye başlamalıdır. Uygun sayıda embriyo enjekte edildikten sonra, doğru şekilde etiketlenmiş anestezi uygulanmış embriyoları, diğer organları etiketlenmiş hayvanları atarak bir floresan mikroskobu altında görsel olarak tarayın.
Yeterince etiketlenmemiş embriyolar tekrar enjekte edilebilir. Daha sonra doğru şekilde etiketlenmiş embriyoların görüntülerini yakalayın. Kan damarlarının daha kapsamlı bir şekilde görüntülenmesi için, yeniden anestezi altına alınmış embriyoları, konfokal mikroskopi ile görselleştirme için ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
Kalbe yeterli miktarda diI asetillenmiş LDL enjekte edilirse, arka kardinal ven veya PCV, bir floresan mikroskobu altında hemen görünür olmalıdır. İntersomitik venler veya ISV'ler, evre 36'da başlayan ve evre 40 ila 41 civarında sona eren ve evre 43 civarında hafifçe dallanan anterior ila posterior dalgada PCV'den dorsal olarak çıkar. PCV ve ISV'ler, sıkı gelişimsel kontrol altında olan stereotipik bir anjiyojenik paternde büyür.
İlginç bir şekilde, TIE-2 sinyallemesinin antisens morfalinonlar tarafından yıkılması, ISV'lerin uzunluğunu ve karmaşıklığını azaltırken, TIE-2'nin yapısal olarak aktif formunun ekspresyonu aşırı ISV dallanmasına neden olur. ISV'lerin karmaşıklığını değerlendirmek için bir Damar Karmaşıklık İndeksi hesaplanabilir ve embriyonik Xenopus tropicalis vaskülatürünün genel mimarisini görselleştirmek için işlenmiş yollar oluşturulabilir. Orijinal protokol, Levin ve Colics tarafından Xenopus laevis kullanımı için tanımlandı ve biz de onu Xenopus tropicalis için uyarladık.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa bir saat içinde tamamlanabilir. Bu işlemden önce, hangi genlerin ve sinyal yolaklarının vasküler gelişimi düzenlediği gibi ek soruları yanıtlamak için genetik ve farmakolojik manipülasyonlar yapılabilir. Bu prosedür kullanılarak, etiketlenmiş damar sistemi sağlam bir hayvanda gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir ve vasküler gelişimin dinamiklerini araştırmak için güçlü bir araç sağlar.
Bu videoyu izledikten sonra, damar sistemini görselleştirmek için bir Xenopus tropicalis kurbağa yavrusunun kalbine diI asetillenmiş LDL'nin nasıl enjekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, Xenopus tropicalis'te damar sistemini görselleştirmek ve karmaşıklığını nicelendirmek için floresan tabanlı bir yöntemi göstermektedir. Bu teknik, embriyonun kalbine floresan bir boya enjekte edildikten kısa bir süre sonra kan damarlarının görüntülenmesine olanak tanıyarak, in vivo kardiyovasküler gelişim çalışmalarını kolaylaştırmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyovasküler biyoloji
- Anjiyogenez
- Gelişimsel biyoloji
Arka Plan
- Xenopus tropicalis, omurgalı gelişimini incelemek için kullanılan bir model organizmadır.
- Vasküler gelişimi anlamak, çeşitli hastalıklar hakkında bilgi edinmek için kritik öneme sahiptir.
- Floresan görüntüleme teknikleri, biyolojik yapıların görselleştirilmesini geliştirir.
- Bu yöntem, vasküler değişimlerin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Xenopus tropicalis iribaşlarının damar yapısını görselleştirmek.
- Anjiyogenezin düzenlenmesini incelemek.
- Kardiyovasküler gelişimi çalışmak için basit ve etkili bir yöntem sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Embriyonun kalbine floresan boya enjeksiyonu.
- Hassas boya iletimi için bir mikro yükleyici ve konik cam mikro pipet kullanımı.
- Kan damarlarının bir diseksiyon mikroskobu altında görüntülenmesi.
- Damar sistemi üzerindeki etkileri incelemek için genetik ve farmakolojik manipülasyonların uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Bütün haldeki embriyolarda kan damarlarının başarılı bir şekilde görüntülenmesi.
- Görüntüleme yoluyla vasküler karmaşıklığın nicelendirilmesi.
- Kardiyovasküler gelişim dinamikleri hakkında elde edilen bulgular.
- Floresan boya enjeksiyon yönteminin etkinliğinin kanıtlanması.
Sonuçlar
- Bu protokol, vasküler gelişimin incelenmesi için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Floresan görüntüleme, gerçek zamanlı analizler için güçlü bir araçtır.
- Bu yaklaşım, kardiyovasküler biyoloji üzerine yapılacak ileri araştırmaları kolaylaştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Bu yöntem, bir omurgalı modelinde vasküler kompleksitenin doğrudan görselleştirilmesini ve nicelendirilmesini sağlayarak, anjiyogenez yolaklarındaki erken aşama hedef doğrulamasını destekler. Damar filizlenmesi ve dallanmasına ilişkin kantitatif veriler sunarak, öncü bileşik belirleme çalışmalarına başlanmadan önce vasküler hedeflerin mekanistik risklerinin azaltılmasını kolaylaştırır. Xenopus tropicalis sistemi, preklinik kardiyovasküler araştırmalarda anjiyojenik fenotiplerin öngörülebilir bir güvenle değerlendirilmesi için hastalıkla ilişkili bir platform sunar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Damar filizlenme modellerinin doğrudan gözlemi yoluyla TIE-2 sinyallemesi gibi anjiyojenik regülatörlere ilişkin terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Genetik olarak mühendislik ürünü modeller gerektirmeden, genlerin veya yolakların vasküler gelişim üzerindeki etkisini değerlendirmek için hızlı, bir haftalık bir iş akışı sağlar.
- Öngörücü Değer: Ven Kompleksite İndeksi gibi ölçülebilir çıktılar, portföy önceliklendirme kararları için hedef modülasyon etkilerinin objektif değerlendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Alt akış görüntüleme ve analiz boru hatlarıyla uyumlu, standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir vasküler etiketleme sağlar.
- Kantitatif Çıktı: Bileşik taramaları için doz yanıtlı okumalar olarak intersomitik ven uzunluğunun ve dallanma karmaşıklığının ölçülmesine olanak tanır.
- Ölçeklenebilirlik: Basit boya enjeksiyonu ve görüntüleme prosedürü, farmakolojik veya genetik pertürbasyonların orta düzeyde yüksek kapasiteli değerlendirmesini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgililik: Xenopus tropicalis'te stereotipik anjiyogenezi modeller ve insan vasküler gelişim yolakları hakkında içgörü sağlar.
- Translasyonel Süreklilik: Korunmuş anjiyojenik mekanizmalar aracılığıyla erken keşif bulgularını preklinik doğrulamaya bağlar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Memeli model çalışmalarına yatırım yapmadan önce hedef biyolojisini netleştirmek için yolak modülatörlerinin hızlı bir şekilde test edilmesine olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, anjiyogenez odaklı programlarda git/gitme kararlarına ışık tutan vasküler fenotip verileri sunar.
- Keşif Biyolojisi: Genetik veya farmakolojik perturbasyonları vasküler mimarideki ölçülebilir değişikliklerle ilişkilendirerek yolakların netleştirilmesini destekler.
- Tarama: Anjiyojenik filizlenmeye yönelik bileşik etkilerini değerlendirmek için uygun, tekrarlanabilir ve görüntüleme tabanlı sonuçlar sunar.
- Analitik: Deneysel koşullar arasında objektif karşılaştırma yapılmasını sağlayan kantitatif vasküler karmaşıklık metrikleri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Embriyonik modellerden memeli vasküler sistemlerine kadar sürekliliği desteklemek için korunmuş anjiyogenez mekanizmalarından yararlanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla anjiyogenez hedef projesinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir vasküler fenotipleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Vasküler ağların doğrudan ve kantitatif görselleştirilmesi yoluyla, anjiyojenik hedef doğrulamadaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Basit boya enjeksiyonu ve tekrarlanabilir görüntüleme ile vasküler değerlendirmeyi standartlaştırarak deneyler arası değişkenliği minimize eder.
- Stratejik Değer: Vasküler hedeflerin risklerinin erken aşamada belirlenmesini sağlayarak sermaye verimliliğini artırır ve kardiyovasküler programlarda geç evre başarısızlık riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Kantitatif fenotipik sonuçlara dayalı olarak, anjiyogenez modifikatörlerinin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Embriyo manipülasyonu ve kardiyak mikroenjeksiyon için mikrocerrahi tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Damar görselleştirme ve görüntü yakalama için floresan mikroskopi altyapısına bağımlıdır.
- Tutarlı vasküler etiketleme için embriyo evrelemesinin ve enjeksiyon zamanlamasının standartlaştırılmasını gerektirir.
- Bulgular diğer model sistemlere veya insanla ilgili bağlamlara genişletilirken adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Pratik sınırlamalar arasında, embriyonik erişilebilirliğe olan bağımlılık ve spesifik olmayan etiketlemeyi önlemek için boya konsantrasyonunun dikkatli optimizasyonuna duyulan ihtiyaç yer alır.
