Antimikrobiyal Biyomühendislik uygulamalar için gelişmiş malzeme karakterizasyonu

Bu yöntem, birçok biyomühendislik uygulaması için çok arzu edilen antimikrobiyal özellikler gibi malzeme mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, doğru sonuçlar için izlenecek derinlemesine adım adım prosedürlere ihtiyaç duyan daha az deneyimli araştırmacılara yardımcı olmak için laboratuvarlar arasında tutarlı bir protokol olarak kullanılabilir. Bu yöntem için ilk olarak antimikrobiyal protokoller aramaya başladığımızda aklımıza geldi ve literatürde bununla ilgili ayrıntılı bir protokol olmadığını fark ettik.

Bu çalışmada, farklı kimyasal yapılara sahip dört gelişmiş malzeme ve bir kontrol malzemesi, antimikrobiyal aktivite açısından test edilecektir. Her malzemeyi 10 mm çapında diskler halinde keserek hazırlayın. Daha sonra, her bir numuneyi 10 dakika boyunca% 70 etanole daldırarak sterilize edin, ardından her iki tarafta bir saat boyunca ultraviyole radyasyon uygulayın.

Gelişmiş malzemelerin antimikrobiyal aktivitesini test etmek için üç farklı mikroorganizma kullanılacaktır. Gram pozitif bakteriler, Staphylococcus aureus, gram negatif bakteriler, Escherichia coli ve maya, Candida albicans. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, steril bir santrifüj tüpünde bulunan 25 mL triptik soya suyu veya TSB'de her mikroorganizmanın birkaç kolonisini yeniden süspanse edin.

Düzgün bir karışım elde etmek için bir dakika boyunca vorteksleyin. Bir spektrofotometre ile her mikroorganizma kültürü için 540 nm'de absorbansı ölçün. Her mikroorganizmanın konsantrasyonunu uygun sayıda koloni oluşturan birime veya mililitre başına CFU'ya ayarlayın.

Mikroorganizma dağılımını iyileştirmek için mikrobiyal süspansiyonu beş saniye boyunca girdap haline getirin ve bu mikrobiyal süspansiyona steril bir pamuklu çubuğu kısa bir süre daldırın. Swabı kültürü içeren tüp duvarına bastırarak swabdaki fazla sıvıyı çıkarın. Her bir mikrobiyal et suyu süspansiyonunu steril pamuklu çubukla triptik soya agarının veya TSA plakasının yüzeyine tüm yüzeyi mikroorganizma ile kaplamak için üç düzlemde eşit şekilde çizin.

Aşılamadan sonra plakaların beş dakika kurumasını bekleyin. Mikrobiyal süspansiyon konsantrasyonunu ve saflığını kontrol etmek için mikrobiyal et suyu süspansiyonlarını daha sonra kullanmak üzere tezgah üstünde bırakın. Bir cımbızı% 96 etanol içeren bir behere batırarak ve ardından bir alkol brülörü ile alevlendirerek sterilize edin.

Test edilecek numune disklerini TSA plakalarının ortasına yerleştirmek için steril cımbız kullanın. TSA plakalarını 24 saat boyunca 37 santigrat derecede ters pozisyonda inkübe edin. Difüzyon testi sonuçlarını analiz etmek için, inhibisyon bölgesinin çapını ve numune disk çapını bir dijital kumpas ile veya bir fotoğraf çekerek ve uygun bir görüntü işleme yazılımı kullanarak ölçün.

Bu prosedür, daha önce belirlenen mikrobiyal konsantrasyonların doğru olduğunu doğrulamak ve mikrobiyal çevre kontaminasyonunun olmamasını sağlamak için gereklidir. Uygun otoklavlanmış uçlara ve aseptik koşullara sahip bir mikropipet kullanarak, steril TSB'yi steril mikrosantrifüj tüplerine dağıtın. Negatif kontrol olarak kullanılacak bir örnek ekleyin.

TSA plakalarını çizmek için daha önce kullanılan mikrobiyal et suyu süspansiyonları ile altı ondalık seri seyreltme gerçekleştirin. Önceden sterilize edilmiş bir Drigalski spatula kullanarak, seçilen her seyreltmeden 100 l'yi bir TSA plakasına yayın. Negatif kontrol olarak bir TSA plakasına mikroorganizma içermeyen 100 l TSB ortamı yayın.

TSA plakalarını 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, mililitre başına CFU'nun daha önce belirlenene benzer olup olmadığını kontrol etmek için koloni sayısını sayın. Mikrobiyal çevre kontaminasyonu olmadığını doğrulamak için negatif kontrol plakasını kontrol edin.

Bu prosedüre, TSB'de test edilecek farklı mikroorganizmaları gece boyunca 37 santigrat derecede bir orbital çalkalayıcıda kültürleyerek başlayın. Ertesi gün, her gece kültürünün OD540'ını ölçün ve daha sonra her kültürü 50 mL önceden sterilize edilmiş bir santrifüj tüpünde 20 mL TSB içinde mililitre başına yaklaşık on ila altıncı CFU konsantrasyonuna seyreltin. Her malzeme türünden dört diski ve dört kontrol diskini steril 48 oyuklu bir plakanın ayrı kuyularına yerleştirin.

Her disk yüzeyine 150 l mikrobiyal süspansiyon pipetleyin. Plakayı 37 derece santigrat derece inkübatörde 24 saat inkübe edin. 48 oyuklu plaka 24 saat inkübe edildikten sonra, dört numune diskinin ve dört kontrol diskinin her birinin yüzeyine 850 l steril PBS pipetleyin ve mikrobiyal süspansiyon ile karıştırın.

Her bir PBS mikrobiyal süspansiyon karışımını ve her bir diski 48 oyuklu plakadan toplayın ve 15 mL önceden sterilize edilmiş bir tüpe aktarın. PBS mikrobiyal süspansiyon karışımlarını ve disklerini bir dakika boyunca vorteksleyin. Beş dakika boyunca 50 Hz'de sonikasyon yapın ve malzeme yüzeyine hiçbir canlı mikroorganizmanın yapışmamasını sağlamak için bir dakika boyunca tekrar girdaplayın.

Sonikasyonlu kültürlerin ve TSB içeren steril mikrosantrifüj tüplerinin ondalık seri dilüsyonlarını gerçekleştirin. Her seyreltmenin 100 l'sini bir TSA plakasına yayın ve plakaları 24 saat boyunca aerobik olarak 37 santigrat derecede inkübe edin. 24 saat sonra, koloni sayısını sayın ve bu sayıyı mililitre başına CFU cinsinden ifade edin.

İletişim yöntemi sonuçları daha sonra metin protokolünde açıklandığı gibi analiz edilir. Agar disk difüzyon testlerinin sonuçları, ilk materyal için antimikrobiyal olmayan aktivite ve diğer üç materyal için S.aureus ve E.coli'ye karşı artan antibakteriyel aktivite göstermektedir. Bu grafik, 24 saatlik inkübasyondan sonra S.aureus ve E.coli'ye karşı her malzeme diski için normalleştirilmiş haleyi göstermektedir.

Temas yönteminin sonuçları ayrıca ilk malzeme için antimikrobiyal olmayan aktiviteyi ve diğer üç malzeme için gram pozitif ve gram negatif bakterilere karşı artan antibakteriyel aktiviteyi göstermektedir. C, 24 saatlik inkübasyondan sonra kontrol diskinden geri kazanılan canlı bakteridir. Bu grafik, malzeme yüzeylerinde S.aureus ve E.coli'ye karşı dört malzeme için canlılık kaybı yüzdesini göstermektedir.

Numune M1 hiçbir antimikrobiyal aktivite göstermedi. Burada gösterilmemesine rağmen, dört materyalden hiçbiri Candida albicans mayasının büyümesini başka bir yöntemle engelleyemez. Bu videoyu izledikten sonra, bu iki tamamlayıcı yöntemle antimikrobiyal aktivitenin nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız.