Zebra balığı adacıkları tek hücreli çözünürlük kalsiyum Imaging'i kullanma Beta hücre fonksiyonu Analizi

Bu yöntem, beta hücre alanındaki önemli soruların anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bir adacık içindeki bireysel beta hücreleri arasındaki heterojen IT işlevi gibi. Bu tekniğin ana avantajı, beta hücrelerinin canlı görüntülenmesi ile sağlanan uzamsal ve zamansal çözünürlüktür.

Tek tek beta hücreleri içindeki kalsiyum salınımlarını yakalayabiliriz. Bir balığı metin protokolüne göre ötenazi yaptıktan sonra, kalsiyum ve magnezyum içeren HBSS çözeltisi içeren bir Petrie kabına aktarın. Daha sonra bir floresan lamba ve kırmızı bir filtre küpü ile donatılmış bir stereo mikroskop altında, cildi ağızdan anal yüzgecine kesmek için keskin forseps kullanın.

İç organları açığa çıkaracak olan karnı ortaya çıkarmak için sağ taraftaki kesilen cildi soyun. Daha sonra beta hücrelerinde mKO2 ekspresyonunu tanımlamak için kırmızı floresan kullanarak adacıkları bulun. Karaciğer ve adipositler gibi çevredeki dokuyu dikkatlice çıkararak birincil adacığı temizleyin.

Adacığa zarar vermemek veya dürtmemek için önlem alın. Daha sonra, cam tabanlı bir tabağın ortasına 30 mikrolitrelik bir HBSS damlası pipetleyin. Daha sonra disseke edilmiş adacığı damlanın içine aktarın.

HBSS ile adacığı bir kez dikkatlice yıkayın, ardından bir kez yıkamak için 30 mikrolitre fibrinojen çalışma solüsyonu kullanın. Hücre ölümüne neden olabilecek yıkama adımları sırasında adacığı kurutmaktan kaçının. Yavaşça ve nazikçe adacığa mililitre trombin çözeltisi başına 10 mikrolitre 10 birim ekleyin.

Adacığı ve tabağı 15 ila 20 dakika boyunca el değmeden bırakın. Fibrinojen trombin damlasının viskoz ve stabil hale geleceğini gözlemleyin. Trombinin fibrinojen çözeltisinde polimerize olması için yeterli zaman verilmesi gerekir.

Aksi takdirde küf görüntüleme seansı sırasında stabilite sağlamayacaktır. GCaMP floresansının ex vivo canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için, kalıbın üzerine 200 mikrolitre HBSS ekleyin ve tabağı dikkatlice konfokal mikroskobun plaka tutucusuna yerleştirin. Ardından 20X 0,8 NA hata hedefi ve parlak alan seçeneği ile adacığı bulun.

Beta hücrelerindeki nükleer mKO2 floresansını görüntülemek için kırmızı floresan filtresini kullanarak adacığa odaklanın. Bireysel çekirdekler açıkça görülebilir olmalıdır. Z ekseni boyunca adacığın kalınlığı boyunca manuel olarak hareket ederek net bir görüntüleme düzlemi bulun.

Görüntüleme düzleminin görüntüleme için 50 ila 100 beta hücresi içerdiğinden ve nükleer mKO2 floresansının parlaklığının, özellikle adacığın merkezinde eşit olduğundan emin olun. Sonraki akıllı kurulum menüsünde, aşağıdaki ayarları kullanarak GCaMP6 ve mKO2 floresan için sıralı bir alım ayarlayın. GCaMP6 için 488 nanometrelik bir uyarma ve yaklaşık 500 ila 555 nanometre emisyon seçin.

Yanlış renk altında GFP'yi seçin. mKO2 için 561 nanometrelik bir uyarma ve 570 ila 630 nanometrelik bir emisyon seçin. Sahte renk için mCherry'yi seçin.

Çekim modunda, görüntü çözünürlüğünü 1.024 x 1.024 piksele, hızı 10'a ve ortalamayı bire ayarlayın. Zaman Serisi seçeneğini belirleyerek ve süreyi kare başına yaklaşık iki saniye alım süresiyle 500 döngüye ayarlayarak sürekli bir kayıt başlatın. Görüntüleme döngüsüne dikkat edin.

Görüntü alımını bozmadan ilk 50 kareden sonra, adacığı tutan jelin üzerine beş mikrolitre 200 milimolar D-glikoz solüsyonunu nazikçe pipetleyin. Daha sonra 10 milimolar glikozda 150 çerçeve elde edin. Zaman Serisinin ilk 50 karesi, beş milimolar glikozda beta hücre aktivitesine karşılık gelir.

Bu bazal aktivitedir. Yanıt veren bir beta hücresi, zamanla yeşil floresanın artmasını ve azalmasını gösterecektir. 200 karede, 10 mikrolitre 200 milimolar D-glikozu nazikçe ekleyerek glikoz konsantrasyonunu 20 milimolar'a yükseltin.

Daha sonra 20 milimolar konsantrasyonda 150 kare elde edin. Görüntü dosyasını FIJI'de açmak için Eklenti, LSM Araç Kutusu'nu seçin, LSM Araç Kutusu'nu göster'i seçin. LSM Araç Kutusu'nda, LSM'yi Aç'ı tıklatın ve görüntü dosyasını seçin.

Analiz menüsündeki Araçlar altında, ROI Yöneticisi'ni açın. Araç çubuğunda bulunan poligon seçim aracı ile ROI'yi manuel olarak çizin. ROI'yi, hücrenin sitoplazmasının bir kısmını içerecek şekilde çekirdekten daha büyük bir alanı kaplayacak şekilde kırmızı kanala çizin.

ROI konumunun çerçeveler arasında tutarlı olduğundan emin olun ve gerekirse konumu ayarlayın. Seçilen ROI'leri Ekle Düğmesine tıklayarak ROI Yöneticisine ekleyin. Birden çok hücre hakkında veri elde etmek için birden çok ROI seçin ve ekleyin.

Ardından, Analiz menüsünden Ölçümleri Ayarla'yı seçin. Ardından, alan içindeki toplam floresan yoğunluğunun çıkarılmasını belirtmek için Entegre yoğunluk'u seçin. GCaMP floresansını içeren yeşil kanala geçin ve ROI Yöneticisi'nde Çoklu Ölçüm'ü seçin.

Bu, Zaman Serileri boyunca hücreler için yoğunluk ölçümlerini sağlayacaktır. FIJI çıktısını virgülle ayrılmış bir metin dosyası olarak kaydedin. LSM Araç Kutusu'ndan görüntü çerçevelerinin zaman damgalarını alın.

Zaman damgalarını almak için Damgaları Uygula, T-damgalarını uygula, Dosya Adı, Metin dosyasına dök'ü kullanın. Farklı kaydet seçeneğini kullanarak zaman damgalarını kaydedin veya elektronik tabloya kopyalayın. Tüm hücreler için yoğunluk değerlerini derledikten sonra, analizi her seferinde bir hücre veya otomatik olarak gerçekleştirin.

Daha fazla ayrıntı için metin protokolüne bakın. Bu deneyde, spesifik olarak beta hücrelerinde nükleer mKO2 ve GCaMP6 eksprese eden 45 DPF transgenik hattından bireysel birincil adacık beta hücreleri, bir glikoz rampası ile uyarıldı ve daha sonra potasyum klorür ile depolarize edildi. Hücrelerin aktivitesi analiz edildi.

FIJI ve veri analiz yazılımı kullanılarak, tek tek beta hücrelerinin GCaMP6 floresan yoğunluğu ekstrakte edildi ve normalleştirildi. Bu floresan yoğunluğu izinden görüldüğü gibi, tek tek beta hücreleri, glikoz ile uyarıldığında GCaMP6 floresansında salınımlar gösterir ve potasyum klorür ilavesi floresanı stabilize eder. Teknik, beta hücresinin glikoz duyarlılığının hücresel bir çözünürlüğünü ve işlevlerine bir pencere sağlar.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik doğru yapılırsa 45 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, beta hücrelerinin canlılığını doğrulamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, spesifik genlerin beta hücre fonksiyonu üzerindeki rolünü anlamak için genetik manipülasyonlar gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, tek tek beta hücreleri içindeki glikoz tepkisinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.