İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Bu deneyin genel amacı, tek tek hücrelerin gen ekspresyonunu değerlendirmek için mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks bir sistemde yakalanmaları için erken evre zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmektir. Bu yöntem, hücrelerin spesifikasyon ve farklılaşma sırasında hangi transkripsiyonel değişikliklere uğradığı gibi gelişim biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel popülasyon temelli tekniklerde maskelenen heterojenliği ortaya çıkarmak için tarafsız bir yaklaşım olmasıdır.

Genel olarak, bu tekniğe yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü tek hücrelerin canlı preparatlarını oluşturmak teknik olarak zordur, ancak aşağı akış analizi için gereklidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm embriyo örneklerinin entegre bir mikroakışkan çip üzerinde tek parçalanmış hücrelere işlenmesi, adımlar uygun şekilde gerçekleştirilirse altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, mikroakışkan cihazda yalnızca tek hücrelerin yakalandığından emin olmayı unutmamak önemlidir.

Yetişkin yabani tip ve transgenik zebra balığı üredikten sonra, tesis ve kurum onaylı standart işletme prosedürlerine göre 15 dakikalık aralıklarla embriyoları toplayın. En az iki saat sonra, tek bir zaman noktasından 100 ila 300 döllenmiş embriyoyu taze yumurta suyu içeren yeni bir Petri kabına aktarın. Ve koryonu her embriyodan manuel olarak çıkarmak için ince forseps kullanın.

Daha sonra, embriyoları minimum hacimde yumurta suyu içinde 2 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için geniş delikli bir cam pipet kullanın. Tüm embriyolar transfer edildiğinde, suyu 1 mililitre buz gibi soğuk yumurta suyu ile değiştirin ve tüpü 20 dakika boyunca buza batırın. Ötenaziden sonra, süpernatanı çıkarmak için geniş delikli bir cam pipet kullanın.

Ve embriyolara iki kez taze yumurta suyu eklemek için bir P-1000 pipeti. İkinci yıkamadan sonra, yumurta suyunu 1 mililitre yumurta sarısı giderme tamponu ile değiştirin ve embriyoları yumurta sarısı eriyene ve sadece embriyoların gövdeleri görünene kadar sekiz ila 12 kez ezmek için bir P-1000 pipeti kullanın. Dokuyu santrifüjleme ile toplayın.

Ardından, doku peletini bozmadan süpernatanı nazikçe çıkarmak için pipeti kullanın ve hücreleri 1 mililitre taze yumurta suyunda yeniden süspanse edin. Embriyoları iki kez daha yıkadıktan sonra, peleti 1 mililitre oda sıcaklığında hücre ayrışma reaktifi-1 içinde tekrar süspanse edin. Daha sonra tüpü oda sıcaklığında 10 dakikalık bir inkübasyon için yan yatırın.

Topaklanmayı önlemek için her iki ila üç dakikada bir hafifçe ezme ile. İnkübasyonun sonunda, hücreleri tekrar döndürün ve peleti 1 mililitre hücre ayrışma reaktifi-2 içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri oda sıcaklığında yatay olarak beş ila 15 dakika daha inkübe edin ve her iki ila üç dakikada bir hafif öğütme yapın.

Her beş dakikada bir, 2 mikrolitre süpernatanı 18 mikrolitre FACS tamponunda seyreltin ve hücreleri bir hücre kültürü kabına bir damlacık olarak dağıtın. Numunenin üzerine bir lamel yerleştirin ve 10 ve 20x büyütmelerde sindirim ilerlemesini değerlendirmek için bir doku kültürü mikroskobu kullanın. Preparasyon, bazı küçük ve büyük hücre kümeleri ve çoğunlukla bozulmamış birkaç embriyo gövdesi ile esas olarak tek hücrelerin bir karışımı gibi göründüğünde, hücreleri aşağı doğru döndürün ve peleti 1 mililitre soğuk FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

Ardından, 40 mikronluk bir hücre süzgecini FACS tamponu ile ıslatın. Ve hücreleri süzgeçten geçirerek 35 milimetrelik bir hücre kültürü kabına süzün. Hücreleri tekrar döndürdükten sonra, peleti 100 mikrolitre FACS tamponunda yeniden askıya alın ve Tripan mavisi dışlaması ile canlı hücrelerin sayısını sayın.

Daha sonra, numuneyi mililitre başına 5 kez 10 ila 6. hücrelere seyreltin. Ve lekesiz kontrol için hücrelerin %10 ila 20'sini ayırın. Hücrelerin geri kalanını floresan canlı/ölü ayrım boyası ile boyayın.

Daha sonra 35 mikronluk hücre süzgeci kapaklı bir FACS tüpünü 20 mikrolitre FACS tamponu ile ıslatın ve hücreleri yerçekimi ile toplayarak süzgecin içine ekleyin. Resimli geçit stratejisini kullanarak, floresan işaretleyiciyi ifade eden tek canlı hücreleri sıralayın. Çift etiketli hücrelerle kapının doğrulanması.

İlgilenilen popülasyondan 2.000 ila 4.000 hücreyi, buz üzerindeki bir mikrosantrifüj tüpünde 5 mikrolitre soğuk FACS tamponuna sıralayın. Daha sonra, sıralanmış hücrelerin 1 mikrolitresini, 100 mikrolitre FACS sıralama tamponu ve 1 ila 1.000 seyreltilmiş canlı / ölü leke içeren yeni bir FACS tüpüne aktarın. Ve sıralama sonrası canlılığı değerlendirmek için sıralama kapılarını kullanarak hücre örneğini çalıştırın.

Daha sonra, hücre konsantrasyonunu ve ortalama çapı belirlemek için 9 mikrolitre FACS tamponunda seyreltilmiş 1 mikrolitre hücreyi bir hemositometreye yükleyin. Şimdi, numunenin ortalama hücre çapı için uygun boyutta entegre bir mikroakışkan devre veya IFC çipi seçin ve akışkanları üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Hücreleri üreticinin talimatlarına göre plakaya yükleyin ve plakayı uyumlu bir akışkan makineye yükleyin.

Ardından, hücreleri yakalama şeritlerine itmek için IFC yongası için uygun bir hücre yükleme komut dosyası çalıştırın. Hücrelerin yakalama bölgelerine yerleştirildiğini doğrulamak için, plakayı bir plaka adaptörüyle donatılmış bir mikroskoba monte edin ve her yakalama bölgesinin 10x büyütmede parlak alan ve floresan görüntülerini elde edin. Hücreler daha sonra QRT-PCR ile hedef gen ekspresyonlarının aşağı akış değerlendirmesi için işlenebilir.

18-somit aşamasında, embriyoların ZsYellow ekspresyonunu doğrulamak için floresan mikroskobu kullanılabilir. Sıralamadan sonra, çeşitli çaplara sahip hücreler elde edilir. IFC plakası, ilgilenilen çapa sahip hücreleri yakalamak için kullanılabilir.

Örneğin, bu deneyde, beş ila 10 mikrometre çapında hücreler. Beklendiği gibi, döllenme sonrası 18 saatlik embriyolardan sıralanan ve yakalanan hücreler ZsYellow floresan markörünü ifade etti. Burada, bir IFC plakası üzerindeki hücre yakalama bölgelerinden 40 tek hücrede ilgilenilen spesifik genlerin göreceli gen ekspresyonunu değerlendirmek için QRT-PCR kullanıldı.

Temizlik geni için döngü eşik değerleri aralığı, örnekler arasındaki gen ekspresyonunu karşılaştırmak için çok geniş olduğundan ve birçok döngü eşik değeri 30'u aştığından, değerler bir ısı haritası olarak görselleştirildi. Örnekler arasında karşılaştırıldığında, bu deneyde gen ekspresyonunda önemli bir heterojenlik gözlendi. Gen ekspresyon modellerine göre Tip 1'den 5'e kadar sınıflandırılan hücrelerle.

Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm embriyo örneklerinin entegre bir mikroakışkan çip üzerinde tek parçalanmış hücrelere işlenmesi, adımlar uygun şekilde gerçekleştirilirse altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, mikroakışkan çipte yalnızca tek hücrelerin yakalandığını hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, tek hücrelerin transkriptomlarını tam olarak karakterize etmek için yüksek verimli tek hücre dizileme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, erken gelişen embriyolarda hücresel heterojenliği keşfetmek için gelişimsel biyoloji alanındaki araştırmacıların yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri nasıl izole edeceğinizi, mikroakışkan bazlı tek hücreli multipleks sistemde tek hücreleri nasıl yakalayacağınızı ve tek tek hücrelerin gen ekspresyonunu nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamalısınız.