Name: İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Öğrenin, mikroakışkan sistemler kullanarak Danio rerio embriyolarından tek hücre izolasyonu ve gen ekspresyonu analizi yöntemini. Bu teknik, hücre farklılaşmasındaki transkripsiyonel değişiklikleri ortaya çıkarır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Balık stoğu için Dr. C. Geoffrey Burns'e teşekkür ederiz. Yazarlar, bu projeyi mümkün kılan kaynaklar için UNC Akış Sitometrisi Çekirdek Tesisi'ne, UNC-CGIBD AAC çekirdeğine ve hayvan bakımı için ZAC tesisine minnettardır. L.S., NIH T32 hibe HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda) tarafından desteklenmektedir. NF, NSF Lisansüstü Araştırma Bursu NSF-DGE-1144081 tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma NIH P30DK034987 hibesi (UNC Advanced Analytics Core'a), Amerikan Kalp Derneği Bilim İnsanı Geliştirme Hibesi 13SDG17060010 ve Ellison Tıp Vakfı Yeni Burs Hibesi AG-NS-1064-13 (Dr. Qian'a) ve NIH R00 HL109079 hibesi (Dr. Liu'ya) tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol, embriyolar üretme yaşarlar, ergin zebrabalıkları kullanılmasını gerektirir. embriyolar doku toplama hasat edilir. Deney yapmak için uygun etik inceleme kurulları onay almak için esastır. 1. Sahnelenen Embriyolar elde <ol><li> Deneyden bir gün önce, üreme için sağlıklı, yetişkin zebrafish hazırlamak. bir erkek ve bir üretim tankı açık bir bölücünün karşılıklı yanları üzerinde bir dişi yerleştirin. </li><li> alt uygulama için yeterli embriyo üretimi için gerektiği kadar üreme tankları için 1.1 tekrarlayın. ilgi hücre tipinde floresan proteinleri ifade vahşi tip balık ve transgenik balıklar hem embriyolar elde edin. NOT: Adımlar 2-8&#39;de downstream uygulamalar için gerekli embriyo sayısı ilgi bir zaman noktasında ilgi hücrelerin göreceli bolluk bağlıdır. Bu hücre türüne göre değişebilir rağmen, 200 embriyolar 2,000-5,000 sıralı hücreler üretmek zaman cilgi arşın 24 hpf (saat sonra döllenme) de &lt;toplam hücre% 1.0 temsil etmektedir. </li><li> Ertesi sabah, taze bir üreme tankına balık aktararak breading tankındaki suyu değiştirmek ve bölücü çıkarın. üreme teşvik etmek için bir açı tankı yatırın. </li><li> sahnelenen embriyolar toplayın. <ol><li> Her 15 dk, taze üreme tankına yetişkinleri aktarılması ve çay süzgecinden geride yumurta geçerek embriyolar toplamak. NOT: karşılaştırılabilir yoğunlukları ve sıcaklıklarda muhafaza zaman Zebra balığı embriyolar eş zamanlı olarak gelişir. </li><li> (1 L çift distile su içinde 0.21 g / L Anında okyanus tuzları) Yumurta Su ile yumurta durulayın ve bir petri transfer. hava sirkülasyonu ile 28.5 ° C&#39;de nemli inkübatör petri aktarın. </li></ol></li><li> İki saat son toplanmasına, sıralama 10 cm petri kutularının içine çok hücreli embriyo döllenmiş ve çanak başına 50 embriyolar yoğunluğunu azaltır. Tek, 15 seçin embriyolaralt uygulama için toplama dakika zaman penceresi. 28.5 ° C embriyolar inkübe edin. NOT: Örneğin, 08:30, 08:45, 09:00, 09:15, 09:30, 09:45, 10:00 ve 10:15 AM embriyolar toplamak. döllenmiş embriyo en fazla sayıda 9:00 toplanan pençelerinden ise zaman noktalarındaki karşılaştırıldığında, daha sonra aşağı uygulamalar için sadece bu embriyolar kullanın. </li></ol> 2. Tek Hücre Ayrışma için Kurma <ol><li> önce ilgi (18 hpf) zaman noktasına yaklaşık 30 dakika ince forseps ile el koryon embriyolar kaldırmak. </li><li> Toplamak ve her durum için aşağıdaki etiket: İki 2 ml mikrosantrifüj tüpler, bir 40 mikron hücre süzgeç, bir 35 mm hücre kültürü çanak ve 35 mikron hücre süzgecinden ile tepesinde iki FACS tüpleri. </li><li> Buz üzerinde aşağıdaki reaktifler Chill: Yumurta Su 1L çift distile su 0.21 g / L Anında Okyanus tuzları içeren; 55 mM NaCI, 1.8 mM KCI, 1.25 mM NaHCO 3 ihtiva eden tampon De-yolking; ve FACS Tampon Leibovitz L-15,% 5 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ile takviye edilmiş ortam ihtiva etmektedir. </li><li> RT Hücre Ayrılma Reaktif 1 numune başına 1 ml getirin. buz üzerinde örnek başına çözülme 1 ml Hücre Ayrılma Reaktif 2. Kullanmadan önce hemen oda sıcaklığına kadar getirin. </li></ol> 3. Tek Hücre Ayrılma <ol><li> Geniş delikli cam pipet kullanılarak, yumurta suyun minimum bir hacmi içinde 2 ml mikro santrifüj tüpüne 100-300 embriyolar aktarılır. </li><li> 20 dakika boyunca buz içinde tüp 1 ml buz gibi soğuk yumurta su ile su değiştirilmesi ve daldırarak embriyolar öldürülür. DİKKAT! (Ikincil ötanazi gibi hücre ayrışma ardından buz üzerinde ürpertici) bu ötenazi yöntemi için uygun kurumsal hayvan bakım gözetim komitesinden onay almak için çok önemlidir. Standart ötanazi tipik embriyolar da canlı hücreleri elde etmek için uygun değildir ki, soğutulmuş sonra ağartılmalarına nispeten 3 gün sonra gübreleme &lt;gerektirir. </li><li> 1 ml buz gibi soğuk Yumurta suyla embriyolar iki kez yıkayın. yıkamak, Yumurta Suyu ve Yumurta Su eklemek için bir P1000 kaldırmak için geniş bir delik cam pipet kullanın. </li><li> P1000 ucu ile 8-12 kez 1 ml Deyolking Tampon ile embriyo su değiştirilmesi ve öğütülerek sarısı çıkarın veya sarısı çözülür ve kadar embriyoların sadece organları görebilir. </li><li> 1 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile doku toplanır. yavaşça doku pelet bozmadan süpernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. 1&#39;in ml Yumurta Su yeniden askıya. </li><li> Tekrarlayın üç yıkar toplam adım 3.5, ancak son yıkamada, 1 ml RT Hücre Ayrılma Reaktif 1 yeniden askıya. </li><li> yatay olarak yerleştirilmiş borular ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücre ayrışma Reaktif 1 inkübe edin. Her 2-3 dk hafifçe topaklanma önlemek için P1000 pipet ile çiğnemek. NOT: ezerek toz haline getirme adımları sırasında hafifçe örnekleri taşıyınız. Bazen tek bir büyük yığın embriyo organları bir arapsaçı gelen tüp içinde oluşacaktır. Bu iradeNazik toz haline getirilerek destekli ek sindirim ile dağıtmak. VORTEKS DO NOT. </li><li> 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile doku toplanır. 1 ml Hücre Ayrılma Reaktif 2 supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın. </li><li> Oda sıcaklığında 5-15 dakika boyunca inkübe edin. yatay tüpleri yerleştirin. Her 2-3 dk hafifçe topaklanma önlemek için çiğnemek. Her 5 dk, sindirim ilerlemesini değerlendirmek. <ol><li> , Sindirim ilerlemesini değerlendirmek hücre kültürü çanak üzerine bir damlacık olarak 18 ul FACS Tampon ve pipet içine 2 ul süpernatant sulandırmak için. </li><li> numune üzerinde bir lamel yerleştirin ve 10X ve 20X büyütmede bir doku kültürü mikroskop altında gözlemlemek. NOT: Hazırlık tek hücreler, küçük kümeler, büyük kümeler, ve zaman zaman çoğunlukla-sağlam embriyo vücudun bir karışımı olarak görünmelidir. </li><li> Görme tek hücreleri ve küçük kümeler olan hazırlık oranını değerlendirmek. NOT: Aşırı sindirim canlılığını azaltır; altında sindirim tek hücre verimi azaltacaktır. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücre hazırlama toplayın. Süpernatantı atın ve soğuk FACS Tampon 1 ml yeniden askıya. </li><li> FACS Tampon ile 40 mikron hücre süzgeç ıslatın. 35 mm hücre kültürü çanak üzerine 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirin. tampon sıralama 1 ml FACS hücre süzgeci bir kez yıkayın. </li><li> 2 ml mikrosantrifüj tüp akış yoluyla aktarın. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplamak ve 100 ul FACS tampon içinde yeniden askıya. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücre verimi güvenin. Dahası seçim FACS makine için önerilen ml veya optimum konsantrasyon başına 5x10 6 hücre örnekleri sulandırmak. hemasitometre hücre verimi sayma yaparken isteğe bağlı, tripan mavisi ile counterstain ölü hücreler FACS sıralama öncesinde hücre hazırlık canlılığı teyit etmek. NOT: Çok sıralamak için zaman aşırı miktarda alacak seyreltilmiş Hazırlıklar. çok c vardır Hazırlıklaroncentrated multimerler içine gelme eğilimindedir ve saf nüfus sıralamak için optimal bulunmaktadır. </li><li> Rezerv her numunenin% 10-20 olarak boyanmamış denetimlerini kullanmak için. ekleyerek diğer örnekler, leke ölü hücreler bir floresan ölü / canlı (L / D) ayrım Her numune içine boya. yıkama ETMEYİN. Not: nükleik asitler, L / D boyası olarak kullanılabilir tehlikeye hücre zarları ve lekeleri hücreleri nüfuz herhangi bir flüoresan boya, florasan spektrumu ilgi seçimi ve fluorofor markalama hücrelerinin FACS makine ile uyumlu olması koşuluyla. <ol><li> bazı hücreler FACS saflaştırma transit ölecek ve sıralı nüfus dışında tutulmalıdır olarak boya ekledikten sonra hazırlık yıkamayın. </li></ol></li><li> 20 ul FACS tamponu ile FACS tüp şapkalı 35 mikron hücre süzgeç ıslatın. süzgeç hücreleri ekleyin ve yerçekimi tarafından toplanır. Buz üzerinde muhafaza edin. </li></ol> 4. FACS Zenginleştirme <ol><li> için tek zenginleştirmek için FACS kullanınFloresan markörü eksprese eden canlı hücreler. <ol><li> yan dağılım genlikli (SSC-A) vs ileri dağılım (FSC-A) genlik bir dağılım arsa üzerinde enkaz hücreleri ayırt etmek için bir kapı olarak ayarlayın, hem doğrusal ölçeklendirme ile. Dikkat balığı hücreler tipik olarak bir fare veya insan hücrelerine göre daha küçüktür. Bu hücreler ve döküntüler, arasındaki düşük bir bazal ayırma yansıtılır. </li><li> 4.1.1 set kapısından, tek hücre için zenginleştirmek ve ileri saçılım yüksekliği (FSC-H) ve düşük yan dağılım yüksekliği (SSC-H) bir dağılım grafiğini kullanarak multimerlerini, doğrusal ölçekleme hem dışlamak için bir kapı olarak ayarlayın. NOT: orantısız yüksek FSC-H ve düşük SSC-H hücreler muhtemel multimerleri ve sıralama dışındadır. </li><li> tek renk kontrollerini kullanarak 4.1.2 gate seti, doğrusal ölçekleme ve kanal genliği ile FSA-A&#39;nın bir dağılım grafiği kullanan tek canlı hücreleri dahil bir kapı set günlük ölçeklendirme ile L / D leke tespit etmek için kullanılır. L / D negatif hücreleri içerir. </li><li> itibarenkapı, tek renk kontrollerini kullanarak, 4.1.3&#39;de belirlenen günlük ölçekleme ile floresan protein hücre işaretleyici tespit etmek için kullanılan kanalın lineer ölçeklendirme ve genlik ile FSA-A&#39;nın bir dağılım grafiği kullanılarak pozitif floresan ile tek canlı hücreleri dahil bir kapı set . Pozitif hücreler yer alır. </li><li> Gerekirse L / D leke ve floresan protein spektrumları arasındaki girişim için hesap, herhangi bir tazminat kontrolleri ayarlayın. </li></ol></li><li> Adım 4.1 ayarlanan kapılarının her giren hücrelere ayarlayın sıralama mantığı. <ol><li> çift ​​etiketli hücreleri kullanarak, hücre sıralama için yolluk doğrulayın. NOT: Hücreler yerine enkaz, tek hücreler yerine multimer, L / D negatif ve floresan pozitif hücreler olacaktır sıralama için hücreler. </li></ol></li><li> Buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüp içinde soğuk FACS Tampon 5 ul içine ilgi nüfus kriteri 2000-4000 hücreleri. hücre için mümkün olan en düşük basınçlar kullanmak, sıralama sırasında hücreler üzerinde kesme ve zorlanma en aza indirmek içinsıralayıcı. NOT: FACS Tampon 5 ul damlacık FACS makinesinden çıkan hücreler için bir yastık görevi görür. şirketinden FACS tamponuna 2000-4000 hücrelerin toplanması öncesinde IFC fiş üzerine yüklemeden santrifüj ihtiyacını ortadan kaldırır. Hücreler pelet birbirine bağlı olmadığını santrifüj multimerlerinin oluşumuna yol açabilir, bu strateji, tavsiye edilir. </li><li> sonrası sıralama canlılığı analizi değerlendirin. <ol><li> L / D leke 1000 seyreltme: Transferi 1 ul tampon ve 1 sıralama 100 ul FACS ile taze bir FACS tüp hücreleri sıralanır. Adım 4.1 yolluk stratejisi ile FACS sıralayıcı aracılığıyla hücrelere geçerler. L oranını kullanın / negatiften pozitife D sıralı hücrelerin canlılığı tahmin etmek. </li></ol></li></ol> Mikroakiskan Chip üzerine 5. Yük Hücreleri <ol><li> hemasitometre kullanarak, konsantrasyon ve sıralanmış hücrelerinin boyutunu hem de ölçün. <ol><li> en az 10 ul sıralı hücreleri sulandırmak. 5 u bir kısım seyreltin, 5 ul tripan mavisi ile L hücreleri. hemasitometre üzerine yerleştirin ve lamel uygulayın. </li><li> hemasitometre 4 x 4 ızgaraları tüm hücrelerin parlak bir alan görüntüleri toplamak. Canlı hücrelerinin sayısını ve canlı hücre / ml hesaplar. Canlı hücreler tripan mavisi kadar yapmayız. Not: Tüm canlı hücre çapını ölçmek için herhangi bir standart Image Analysis yazılımının kullanılması. hücre boyutu, ortalama ve standart sapma hesaplayın ve ilgi hücre boyut aralığı için uygun olan bir IFC plaka seçin. Hücre boyutu aralığı bir IFC plaka hücre boyut aralığı straddles ise ilgi hücreleri tam kapsamlı yakalamak için birden fazla tabak kullanın. </li></ol></li><li> üreticinin talimatlarına göre IFC plakaya Yük hücrelerinin (Malzeme). <ol><li> 1x10 6 hücre / ml hücreleri sulandırmak ve üreticinin talimatlarına göre yüzdürme optimizasyon yapmak. NOT: Yüzdürme optimizasyon hücreleri dibine çöker, ne de yükleme wel üstüne şamandıra ne sağlarIFC çip üzerine optimum yükleme l. hücrelere tampon oranı hücre tipine göre değişir, ancak genellikle 6 aralıkları olabilir: 4-7: Hücrelerin 3: tampon. </li><li> astar-IFC plakasına hücreleri ekleyin. Yük uyumlu Fluidics makinenin içine plaka ve Mikroakiskan devre boyunca ve yakalama şerit içine hücreleri itmek için bir hücre yükleme komut dosyasını çalıştırın. </li></ol></li><li> Hücreler IFC plaka üzerinde yakalama sitelerinde açılmış olduğunu doğrulamaktadır. <ol><li> Fluidics makineden IFC plakasını sökün. bir tabak adaptörü ile donatılmış bir mikroskop IFC plakasını monte edin. </li><li> 10X büyütmede her yakalama site için parlak bir alan ve floresan anlık toplayın. NOT: aydınlık yakalama süreleri lamba yoğunluğuna bağlı olarak, 10-50 ms arasında değişebilir. Floresan yakalama süreleri fluorofor parlaklığına bağlı olarak, 250-750 ms arasında değişebilir. fotohasar önlemek için hücrelerin ışığa maruz kalmaması. </li></ol></li></ol> 6. cDNA Sentezi <ol><li> I&#39;e göre yerinde hücre parçalama gerçekleştirinFC plaka üreticinin talimatlarına. <ol><li> IFC plaka üzerinde kuyu lizis tamponları ekleyin. üreticinin talimatlarına göre uyumlu fluidik makine ve çalışma hücre parçalama komut üzerine yük plakası. </li></ol></li><li> IFC plakası, üreticinin talimatlarına uygun olarak, ters transkripsiyon gerçekleştirin. <ol><li> IFC plakasına ters transkripsiyon ayraçlar eklenir. Uyumlu Fluidics makine üzerine yük plakası. Ters transkripsiyon komut dosyasını çalıştırın. Örnek döngü koşulları: 5 dakika 85 ° C&#39;de daha sonra da 1 döngü, 10 dakika boyunca 25 ° C &#39;de 1 döngü, 1 saat süre ile 42 ° C&#39; de 1 döngü. </li></ol></li><li> IFC plakası, üreticinin talimatlarına uygun olarak gene özel problar ile ön amplifikasyon gerçekleştirin. Not: düşük kopya numaraları ile daha kesin nedeniyle, ara katkı boyalar ile kullanım için optimize florojenik etiketli problar yerine probları kullanımı. <ol><li> Havuz astar ve son 180 nM her sulandırmak. IFC plakasına toplanmış primerler ekleyin. Uyumlu fluidi üzerine yük plakasıcs makinesi. Run amplifikasyon komut dosyası. </li></ol></li><li> Aşağıdaki çevrim koşulları ön amplifikasyon yapın: 1 döngü, 95 ° C&#39;de 10 dakika, daha sonra da 18 döngü, 4 dakika 60 ° C&#39;de, daha sonra 15 saniye boyunca 95 ° C &#39;de tavlama ve uzatma, denatüre edici ile. Mağaza hasat kadar 4 ° C &#39;de cDNA önceden büyütülmüş. kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de üreticinin talimatlarına ve saklamak için uygun mikroakışkan plakadan Hasat cDNA. </li></ol> Tek Hedef QRT-PCR Tek Hücreleri 7. Select cDNA <ol><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak 25 ul dilüsyon reaktif cDNA seyreltilir. NOT: Yaklaşık son verim hücre başına ön amplifiye cDNA 28 ul. QRT-PCR bir hedef içermeyen bir kontrol olarak kullanılmak üzere bir seyreltici bir kısım ayırın. <ol><li> parlak bir alan ve adım 5.3.2 kaydedilen floresan görüntülere değinen her yakalama sitesine puan. El ile saymak ve hücre sayısını kaydedin. Değerlendirmek ve her hücre grip olup olmadığını kayıtFlüoresan. NOT: Her birey sitesi içerebilir 0,&gt; 1 hücre birden çok hücre ve / veya tanımlanamayan enkaz ihtiva yakalama siteleri içeren 1 veya&gt; 1 hücre. görüntüler yeterli kalitede ise, bir piksel değeri de floresan sinyal yoğunluğu ölçmek için atanabilir. </li></ol></li><li> Mah-PCR analizi için seçin örnekleri. <ol><li> Pozitif floresan ile tam 1 hücreyi ihtiva adım 7.2 tanımlanan yakalama sitelerinden cDNA örnekleri seçin. Her bir numuneden cDNA havuzunu 1 ul alikotları. NOT: Bu ilgi genler seçilen hücrelerin herhangi ifade olup olmadığını belirlemek için kullanılan &quot;Havuz&quot; pozitif kontrol edilmesidir. </li><li> Bir negatif kontrol olarak tam olarak 0 hücreleri içeren en az bir yakalama sitesinden cDNA seçin. no-şablon kontrolü gibi adım 7.1.2 den seyreltici kullanın. </li></ol></li><li> Mah-PCR testi çalıştırın. <ol><li> Aşama 6.4.1 ön-yükseltme için kullanılan tek probları kullanın. triplicat tüm örnekleri yükleyine. 1 döngü, 50 ° C 2 dakika, 1 döngü, 10 dakika için 1, 60 ° C&#39;de, sonra 95 ° C 15 saniye tavlama ve uzatma denatüre edici ile 40 döngü 95 ° C: 384 plaka üzerinde 10 ul reaksiyon için döngü koşulları min. </li></ol></li></ol> 8. Veri Analizi <ol><li> Standart jel elektroforezi ile Mah-PCR ürünleri doğrulayın. Ürünü onaylamak beklenen molekül ağırlığında tek bir bant olduğunu (her sonda için değişir). NOT: Bir sonda uygunsuz boyutta birden çok bantları veya tek bir bant üretirse, o zaman özgünlüğü sorgulanabilir ve bu analizden geni dışlar. </li><li> Herhangi bir anormallik 14 tüm amplifikasyon eğrileri ve hesabı inceleyin. Her bir numune / gen kombinasyonu 15 için ortalama BT değerini hesaplayın. NOT: Pozitif kontroller CT değerleri tipik 10-30 arasında değişmektedir. Negatif kontroller CT değerleri tipik 35-40 (hiçbir amplifikasyon) arasında değişir. BT değerleri 30-35 derece düşük ifadesi olarak kabul edilirve dikkatli 14 ile yorumlanmalıdır. </li><li> Rapor verileri <ol><li> Numuneler CT = 10-30 düşersen, veriler de bir kontrol numunesine transkript bolluk katlık değişim olarak bildirilebilir. Not: (- ΔΔCT) katlı değişim 2 ^ eşittir ACt ev bakıcısı geni ile ilgili numunenin ortalaması CT çıkarılarak bir ev bakıcısı geni ile ilişkili ve ΔΔCT numunesi ve bir pozitif kontrol 15 ile ACt farklılıklar olduğunu. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis%3A+toward+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis: toward the clinic.</a> Genome medicine. 5, (2013).</li>
<li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+genomics%3A+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Single cell genomics: advances and future perspectives.</a> PLoS genetics. 10, e1004126(2014).</li>
<li>Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).</li>
<li>Yin, H., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for single cell analysis.</a> Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).</li>
<li>Garlanda, C., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+endothelial+cells.+Specific+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).</li>
<li>Diaz-Cano, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+heterogeneity%3A+mechanisms+and+bases+for+a+reliable+application+of+molecular+marker+design%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design.</a> International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cellular+hierarchy+by+single-cell+analysis+of+the+cell+surface+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire.</a> Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Developmental cell. 18, 675-685 (2010).</li>
<li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+lineage+hierarchies+of+the+distal+lung+epithelium+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 509, 371-375 (2014).</li>
<li>Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+early+development+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics+%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Genetics and early development of zebrafish.</a> Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).</li>
<li>Liu, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circulation research. 110, 870-874 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+and+microarray+in+transcriptome+profiling+of+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells.</a> PloS one. 9, e78644(2014).</li>
<li>McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+non-detects+in+qPCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">On non-detects in qPCR data.</a> Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature. 3, 1101-1108 (2008).</li>
<li>Lyons, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+and+morphogenetic+defects+in+the+heart+tubes+of+murine+embryos+lacking+the+homeo+box+gene+Nkx2-5%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5.</a> Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).</li>
<li>Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+tinman+homolog+demarcates+the+heart+field+and+initiates+myocardial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation.</a> Development. 122, 3809-3816 (1996).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+TGF-beta+binding+protein+3+identifies+a+second+heart+field+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish.</a> Nature. 474, 645-648 (2011).</li>
<li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+field+origin+of+great+vessel+precursors+relies+on+nkx2.5-mediated+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis.</a> Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).</li>
<li>McCurley, A. T., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+housekeeping+genes+in+zebrafish%3A+male-female+differences+and+effects+of+tissue+type%2C+developmental+stage+and+chemical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment.</a> BMC molecular biology. 9, 102(2008).</li>
<li>Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+reference+genes+for+quantitative+real-time+RT-PCR+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biochimica+et+biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization.</a> Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+in+the+heart+field+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation in the heart field of zebrafish.</a> Development. 125, 1095-1101 (1998).</li>
<li>de Pater, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+phases+of+cardiomyocyte+differentiation+regulate+growth+of+the+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart.</a> Development. 136, 1633-1641 (2009).</li>
<li>Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cardiac+development+requires+a+conserved+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field.</a> Development. 138, 2389-2398 (2011).</li>
<li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Developmental biology. 214, 23-37 (1999).</li>
<li>Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada tarif edilen yöntem, bir kardiyak genlerin bir alt ekspresyonunu değerlendirmek için mikro-akışkan destekli tek hücre yakalama sisteminde kullanım için zebra balığı embriyolardan kalp progenitör hücrelerin bir popülasyonu ettirecek hücre tipi özel bir promoterin kontrolü altında bir floresan protein ifade kullanır hücreler. FACS lazer eksitasyon ve emisyon özellikleri tercih fluorofor (ler) ile uyumlu olduğu sürece, bu yöntem, herhangi bir flüoresan raportör hattı için kullanılabilir. Birçok zebrabalıkları muhabi...

hücre ve moleküler biyoloji en güncel çalışmalar nüfus ortalamasına dayanmaktadır. küçük popülasyonlar biyolojik süreçlerin ve hastalık sonucu önemli roller oynayabilir Bununla birlikte, önemli biyolojik olaylar bu geleneksel toplum tabanlı analizler maskelenmiş olabilir. Tek hücre düzeyinde heterojen popülasyonlar gen ifadesini anlama (ve vardır) ilgili biyolojik ve klinik Insights 1,2 yol açabilir. Embriyonik gelişim çalışmalarına ilgilendiren, daha büyük bir hücre popülasyonunda, progenitör hücreler, çoğunlukla az temsil edilmektedir zorlu sonuçta hücre kaderinin kararları 3 başlatmak gen ifadesinde ince değişiklikleri tespit etmek için yapım. Benzer şekilde, tek bir hücre tipi mikro-4 tepki olarak farklı ekspresyon profillerine sahip olabilir. Örneğin, (örneğin., Aort veya böbrek) aynı organ veya farklı organlarda yerleşik endotel hücreleri ortak Morp paylaşımı rağmen önemli heterojeniteye sergilerlerlitolojik ve fonksiyonel özellikleri 5. Buna ek olarak, aynı tümör doldurma kanser hücreleri, aynı zamanda, tek hücre düzeyinde 6 moleküler profiller ya da mutasyonlar farklı olabilir. Modeli sistemlerinde, tek hücre transkriptomik başarılı yeni hücre popülasyonu tespit hücre farklılaşması sırasında meydana gelen ara durumları, özelliği ve 7,8,9 uyaranlara diferansiyel hücresel tepkileri ortaya çıkarmıştır. Bu tür anlayışlar, geleneksel toplum tabanlı çalışmalarda maskeli olurdu. Zebra balığı embriyolar kök, dede bir derece altında kullanılan kaynağıdır ve geliştirme sırasında tek hücre heterojenite ve hücresel kimliklerin moleküler düzenleme soruları keşfetmek için hücrelerin ayırt. Onların son derece basmakalıp, ex vivo geliştirme ve genetik manipülasyon kolaylığı onlara bu yaklaşımın 10,11 için mükemmel bir model sistem olun. Özellikle, tek hücre gen yorumlanması önemli bir sınırlamae ifade veri gelişimi sırasında yeni ara hücre devletlerin güvenilir kimlik doku koleksiyonu 9 çok dikkatli zamanlama gerektirir. Bu tutulan hücre arasındaki farklılıklar, yaşa bağlı hücre farklılaşması tarafından sunulan gen ekspresyonu, tek bir zaman noktasında bir doku içinde heterojen yerine heterojen temsil sağlamak için gereklidir. Fareler ile karşılaştırıldığında, zebra balığı embriyo gelişimi tam olarak embriyoların 12 çok sayıda senkronize edilebilir. Buna ek olarak, geniş bir kavrama boyutları ile, zebra balığı embriyolar kök ve projenitör hücre bol kaynağı olarak kullanılabilir. Bu protokol, zebra balığı embriyoların hücreleri izole etmek ve QRT-PCR ile gen ekspresyon analizi için ticari olarak temin edilebilir, entegre Mikroakiskan devresi (IFC) çipi ve otoprep sistemi kullanılarak tek hücre yakalamak için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu protokol, bütün dahil olmak üzere herhangi bir yüksek verimli çoğullama deneyleri hızla devredilecek olabilirHücresel heterojenite 13 daha kapsamlı analiz sağlar transcriptome sıralama. Ayrıca, geleneksel gen sentezleme tahlilleri için çeşitli avantajlar sağlar. Tek hücre izolasyon protokolü alt uygulamalar dahildir tehlikeye hücrelerinin oranını azaltır FACS sonrasında yüksek canlılığı, elde edilir. Bir IFC kullanarak, yakalanan hücreler doğrudan yakalama oranlarını değerlendirmek ve morfolojik hücre sağlığını değerlendirmek için görülebilir. Buna ek olarak, bu protokol mikroakışkan hücre yakalama teknolojileri sadece etiketli transgenik balık hattı ve erişimi gerektiren, Zebra balığı araştırma topluluğuna geniş çapta uygulanabilir. Prensip kanıtı olarak, kalp progenitörlerinden edilen tek hücreler izole edilmiş ve bir IFC çip ele geçirilir ve daha sonra kalp farklılaşma markerlerinin nispi bolluk QRT-PCR ile ölçülmüştür. tek hücre düzeyinde gen ekspresyon analizi kalp atalarıdır kendi differe bir arada gösteriyorntiating soyu. Kalp atalarıdır tek hücreli profil elde edilen anlayış, geleneksel toplum tabanlı analizlerde maskelenmiş olabilir omurgalı gelişimi sırasında kalp progenitör hücreleri arasında gen ekspresyonu heterojenlikten, ışık tutabilir.

<table><tbody><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11254-20</td><td>Embriyolardan koryonu çıkarmak için</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü 2 ml</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>40 um hücre süzgeci</td><td>Biobasic</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>35 mm kültür kabı</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>35 um hücre süzgeci ile tepesinde FACS tüpleri</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>P1000 ve uçlar</td><td>Rainin</td><td>17005089</td><td></td></tr><tr><td>P20 ve uçlar</td><td>Rainin</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>IFC çip üreticisinin protokolü</td><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>Sürüm 100-6117 E1, temsili deneyde</td></tr><tr><td>kullanıldı Geniş delikli pastüer cam pippette</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td> embriyoların aktarılması</td></tr><tr><td>Yetişkin vahşi tip zebra balığı</td><td>N/A</td><td></td><td>AB hattı kullandık</td></tr><tr><td>Yetişkin transgenik zebra balığı</td><td>N/A</td><td></td><td>Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</strong<></td>strong<td>>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Hücre ayrışması için reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çift damıtılmış su</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anında Okyanus Deniz Tuzu</td><td>Anında Okyanus</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td><td>suda stok yapar ve yumurta sarısı giderme tamponu için kullanır</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>suda stok yapar ve yumurta sarısı giderme tamponu</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma için kullanır Aldrich</td><td>S6014</td><td>suda stok yapar ve yumurta sarısını gidermek için kullanır</td></tr><tr><td>Leibovitz'in L-15</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>Isı inaktive eder; herhangi bir FBS markası iyi olmalıdır</td></tr><tr><td>Hücre Ayrışması Reaktifi 1 -TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>Hücre Ayrışma Reaktifi 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>-20 Mağazası; buz üzerinde çözdürün; kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin</td></tr><tr><td>pronaz (isteğe bağlı)</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>L/D Boya - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>Akış sitometrisi için uygun herhangi bir canlı/ölü leke işe yarayacaktır</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>IFC plaka kullanımı ve qRT-PCR için reaktifler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen-spesifik problar Problar</td><td></td><td></td><td>deneye göre değişecektir</td></tr><tr><td>TaqMan Probu ef1a</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Dr03432748_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probu gata4</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probu nk2-5</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probu myl7</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probu vmhc</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probu isl1</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gen Ekspresyonu Master Mix</td><td>Life Teknolojileri</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>IFC üreticisinin protokolünde</td><td></td><td></td><td></td>listelenen reaktifler</tr><tr><td>C1 Reaktif Kiti</td><td>Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>Hücreleri IFC plakasına yüklemek için reaktifler</td></tr><tr><td>Ambion Tek Hücreden CTTM</td><td>Life Teknolojileri</td><td>4458237</td><td>Ters transkripsiyon ve ön amplifikasyon adımları için reaktifler</td></tr><tr><td>PreAmp (5-10 um)</td> için Moleküler Biyoloji Kaliteli Su Corning 46-000CM <td></td><td></td><td></td>C1 IFC Fluidigm 100-5757 küçük hücreler için IFC plakası</tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü > <</td> <td>güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> < güçlü > Ekipman< / güçlü><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 AutoPrep makinesi</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>IFC plaka kullanımı için</td></tr><tr><td>Hemositometre&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Hücreleri saymak ve hücre boyutunu değerlendirmek için</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td></td><td></td><td>Embriyoları koryondan çıkarmak için</td></tr><tr><td>Doku kültürü mikroskobu</td><td></td><td></td><td>Tek hücre sindirimini değerlendirmek için</td></tr><tr><td>FACS makinesi</td><td></td><td></td><td>İlgilenilen hücreleri izole etmek için</td></tr></tbody></table>

İzolasyon ve zebra balığı embriyolar gelen tek hücre karakterizasyonu

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Zebra balığı (Danio rerio), omurgalıların gelişimini incelemek için güçlü bir model organizmadır. Zebra balığı embriyonik gelişiminin birçok yönü morfolojik düzeyde tanımlanmış olsa da, organizma geliştikçe meydana gelen hücresel değişikliklerin moleküler temeli hakkında çok az şey bilinmektedir. Mikroakışkanlar ve çoğullama teknolojilerindeki son gelişmelerle, artık tek hücrelerde gen ekspresyonunu karakterize etmek mümkündür. Bu, hücre alt tiplerini tanımlamak ve sınıflandırmak, hücre farklılaşması sırasında meydana gelen ara durumları karakterize etmek ve uyaranlara farklı hücresel tepkileri keşfetmek için belirli hücre popülasyonlarının tek tek hücreleri arasındaki heterojenliğin araştırılmasına izin verir. Bu çalışma, yüksek verimli çoğullama deneyleri için zebra balığı embriyolarından canlı, tek hücreleri izole etmek için bir protokolü açıklamaktadır. Bu yöntem, floresan belirteçleri olan herhangi bir zebra balığı embriyonik hücre tipine hızlı bir şekilde uygulanabilir. Bu yöntemin bir uzantısı, tek hücrelerin transkriptomunu tam olarak karakterize etmek için yüksek verimli dizileme teknolojileri ile kombinasyon halinde de kullanılabilir. Prensip kanıtı olarak, kardiyak farklılaşma belirteçlerinin nispi bolluğu, nkx2.5 pozitif kardiyak progenitörlerden türetilen izole, tek hücrelerde değerlendirildi. Gen ekspresyonunun tek hücre düzeyinde ve tek bir zaman noktasında değerlendirilmesiyle, veriler kardiyak progenitörlerin farklılaşan döllerle bir arada bulunduğu bir modeli desteklemektedir. Burada açıklanan yöntem ve iş akışı, zebra balığı araştırma topluluğu için geniş ölçüde uygulanabilir olup, yalnızca etiketli bir transgenik balık misinası ve mikroakışkan teknolojilerine erişim gerektirir.

Prensip kanıtı olarak, gen ifadesi kalp gelişimi sırasında farklılaşma dinamikleri keşfetmeye değerlendirildi. zebrabalıkları kardiyak ataları Bunların, doğrusal kalp tüpü oluşturmak için sigorta ön yan levha mezoderm yer değiştiren hücrelerin mezodermal nüfusu ortaya çıkar. Füzyon öncesinde, kalp ataları kalp atalarıdır 16,17 erken belirli belirteç olduğu düşünülmektedir transkripsiyon faktörü Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), ifade başlar. Burada, daha önce tarif edilen BAC ...

Bu protokol, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmek, ilgilenilen hücreleri zenginleştirmek, mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks sistemlerde zebra balığı hücrelerini yakalamak ve tek hücrelerden gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir yöntemi tanımlar.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Bu deneyin genel amacı, bireysel hücrelerin gen ekspresyonunu değerlendirmek amacıyla, erken evre zebrafish embriyolarından tek hücreleri izole ederek mikroakışkan tabanlı bir tek hücreli multipleks sistemde yakalamaktır. Bu yöntem, hücrelerin spesifikasyon ve diferansiyasyon sırasında hangi transkripsiyonel değişikliklerden geçtiği gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel popülasyon tabanlı tekniklerde maskelenen heterojenliği ortaya çıkarmak için tarafsız bir yaklaşım sunmasıdır.Genel olarak, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, tek hücrelerin canlı preparatlarının oluşturulmasının teknik olarak zorlayıcı ancak sonraki analizler için temel olduğundan dolayı güçlük çekeceklerdir. Bu yöntem ustalıkla uygulandığında, tüm embriyo örneklerinin entegre bir mikroakışkan çip üzerinde tekil lize edilmiş hücrelere dönüştürülmesi, adımlar doğru şekilde gerçekleştirilirse altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, mikroakışkan cihazda yalnızca tekil hücrelerin yakalandığından emin olmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir.Yetişkin yabani tip ve transgenik zebra balıkları çiftleştirildikten sonra, tesis ve kurum onaylı standart çalışma prosedürlerine uygun olarak 15 dakikalık aralıklarla embriyolar toplayın. En az iki saat sonra, tek bir zaman noktasından 100 ila 300 döllenmiş embriyoyu, taze yumurta suyu içeren yeni bir Petri kabına aktarın. Ardından, her bir embriyonun korionunu manuel olarak çıkarmak için ince pens kullanın.Ardından, embriyoları minimum hacimde yumurta suyu ile 2 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için geniş ağızlı bir cam pipet kullanın. Tüm embriyolar aktarıldığında, suyu 1 mililitre buz soğukluğunda yumurta suyu ile değiştirin ve tüpü 20 dakika boyunca buzda bekletin. Ötani sonrası, süpernatantı uzaklaştırmak için geniş ağızlı bir cam pipet kullanın.Ve embriyolara iki kez taze yumurta suyu eklemek için bir P-1000 pipet. İkinci yıkamadan sonra, yumurta suyunu 1 milliliter vitellus temizleme tamponu ile değiştirin ve vitellüs çözülüp yalnızca embriyo gövdeleri görünür olana kadar embriyoları bir P-1000 pipet yardımıyla sekiz ila 12 kez triture edin. Dokuyu santrifüjleme yoluyla toplayın.Ardından, doku peletini rahatsız etmeden süpernatanı nazikçe uzaklaştırmak için pipet kullanın ve hücreleri 1 mililitre taze yumurta suyunda yeniden süspande edin. Embriyoları iki kez daha yıkadıktan sonra, peleti 1 mililitre oda sıcaklığındaki hücre disosiyasyon reaktifi-1 içinde yeniden süspande edin. Daha sonra tüpü, oda sıcaklığında 10 dakikalık inkübasyon için yan yatırın.Topaklanmayı önlemek için her iki ila üç dakikada bir nazikçe tritürasyon yapın. İnkübasyonun sonunda, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve pelletini 1 mililitre hücre ayrıştırma reaktifi-2 (cell dissociation reagent-2) içerisinde yeniden süspande edin. Hücreleri, her iki ila üç dakikada bir nazikçe tritürasyon uygulayarak oda sıcaklığında yatay konumda beş ila 15 dakika daha inkübe edin.Her beş dakikada bir, 2 µL süpernatantı 18 µL FACS tamponu ile seyrelterek hücreleri bir hücre kültür kabına damlacık şeklinde aktarın. Numunenin üzerine bir lamelyel yerleştirin ve sindirim ilerlemesini 10x ve 20x büyütmelerde değerlendirmek için bir doku kültürü mikroskobu kullanın. Preparat, ağırlıklı olarak tekil hücrelerden, bazı küçük ve büyük hücre kümelerinden ve birkaç tane çoğunlukla bütün kalmış embriyo gövdesinden oluşan bir karışım gibi göründüğünde, hücreleri santrifüjleyin ve pelletini 1 mL soğuk FACS tamponunda yeniden süspanse edin.Ardından, 40 mikronluk bir hücre süzgecini FACS tamponu ile ıslatın. Ve hücreleri süzgeç aracılığıyla 35 milimetrelik bir hücre kültür kabına filtreleyin. Hücreleri tekrar santrifüjledikten sonra, pelletini 100 µL FACS tamponu içinde yeniden süspande edin ve canlı hücre sayısını Trypan mavisi dışlama yöntemiyle belirleyin.Ardından, numuneyi mililitrede 5 x 10⁶ hücre olacak şekilde seyreltin. Hücrelerin %10 ila %20'sini boyanmamış kontrol için ayırın. Geri kalan hücreleri floresan bir canlı/ölü ayırt edici boya ile boyayın.Ardından, 35 mikronluk hücre süzgeçli FACS tüpünü 20 µL FACS tamponu ile ıslatın ve hücreleri süzgece ekleyerek yerçekimi yardımıyla toplayın. Resmedilen kapılama stratejisini kullanarak, floresan markör eksprese eden tek canlı hücreleri ayrıştırın. Kapılamayı çift etiketli hücrelerle doğrulayın.İlgi duyulan popülasyondan 2.000 ila 4.000 hücreyi, buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpü içindeki 5 µL soğuk FACS tamponuna sıralayın. Ardından, sıralanan hücrelerin 1 µL'sini, 100 µL FACS sıralama tamponu ve 1:1.000 oranında seyreltilmiş canlı/ölü boyası içeren yeni bir FACS tüpüne aktarın. Sıralama sonrası canlılığı değerlendirmek için sıralama kapılarını (gates) kullanarak hücre örneğini analiz edin.Ardından, hücre konsantrasyonunu ve ortalama çapı belirlemek için 9 µL FACS tamponu ile seyreltilmiş 1 µL hücreyi bir hemositometreye yükleyin. Şimdi, örneğin ortalama hücre çapına uygun boyutta entegre bir mikroakışkan devre veya IFC çipi seçin ve akışkanlar sistemini üretici talimatlarına göre hazırlayın. Hücreleri üretici talimatlarına göre plakaya yükleyin ve plakayı uyumlu bir akışkanlar makinesine yerleştirin.Ardından, hücreleri yakalama kanallarına itmek için IFC çipine uygun bir hücre yükleme betiği çalıştırın. Hücrelerin yakalama bölgelerine yerleştiğini doğrulamak için plakayı, plaka adaptörü olan bir mikroskoba yerleştirin ve her bir yakalama bölgesinin 10x büyütmede parlak alan ve floresan görüntülerini alın. Hücreler daha sonra, hedef gen ekspresyonlarının QRT-PCR ile downstream değerlendirmesi için işlenebilir.18-somit aşamasında, embriyoların ZsYellow ekspresyonunu doğrulamak için floresan mikroskobu kullanılabilir. Ayıklama işleminden sonra, farklı çaplarda hücreler elde edilir. İlgilenilen çaptaki hücreleri yakalamak için IFC plakası kullanılabilir.Örneğin, bu deneyde hücreler beş ila 10 µm çapındaydı. Beklendiği üzere, döllenmeden sonraki 18. saatteki embriyolardan ayrıştırılan ve yakalanan hücreler ZsYellow floresan belirtecini eksprese etti. Burada, bir IFC plakası üzerindeki hücre yakalama bölgelerinden alınan 40 tek hücrede, ilgilenilen spesifik genlerin göreceli gen ekspresyonunu değerlendirmek için qRT-PCR kullanıldı.Housekeeping geninin döngü eşik değerleri aralığı, örnekler arasında gen ekspresyonunu karşılaştırmak için çok geniş olduğundan ve birçok döngü eşik değeri 30'u aştığından, değerler bir ısı haritası olarak görselleştirilmiştir. Örnekler arası karşılaştırmada, bu deneyde gen ekspresyonunda önemli bir heterojenlik gözlemlenmiştir. Hücreler, gen ekspresyon modellerine göre Tip 1'den Tip 5'e kadar sınıflandırılmıştır.Yöntem ustalaştıktan sonra, adımların doğru şekilde yürütülmesi durumunda, tüm embriyo örneklerinin entegre bir mikroakışkan çip üzerinde tekil lizlemiş hücrelere dönüştürülmesi işlemi altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, mikroakışkan çipe yalnızca tekil hücrelerin yakalandığını unutmamak önemlidir. Bu işlemin ardından, tekil hücrelerin transkriptomlarını tam olarak karakterize etmek için yüksek çıktılı tek hücre sekanslama gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların erken gelişmekte olan embriyolardaki hücresel heterojenliği keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, zebrafish embriyolarından tek hücrelerin nasıl izole edileceğini, mikroakışkan tabanlı bir tek hücreli multipleks sistemde tek hücrelerin nasıl yakalanacağını ve bireysel hücrelerin gen ekspresyonunun nasıl değerlendirileceğini iyi bir şekilde kavramış olmanız gerekir.

isolation-and-characterization-of-single-cells-from-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit...

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

Bu iletişim kuralı Zebra balığı embriyolar, larva, Bütün transcriptome analiz için bir yaklaşım sunar veya hücre sıralanır. RNA izolasyonu, RNASeq veri yolu çözümlemesi ve qRT PCR dayalı doğrulama gen ifade değişiklikleri içerir.

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

Zebra balığı son kullanılan bir vivo içinde modeli sistemi olarak DNA çoğaltma zamanlaması geliştirme sırasında çalışmaya. İşte Zebra balığı embriyo profili çoğaltma zamanlaması için kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Bu iletişim kuralı kolayca çoğaltma zamanlaması mutantlar, tek hücre türleri, hastalık modelleri ve diğer türler çalışmaya adapte edilebilir.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

Biz nöronlar, makrofajlar ve microglia larva Zebra balığı beyin fizyolojik ve patolojik şartlar altında gelen izole etmek için bir protokol mevcut. Yalıtım, RNA gen ifade profillerini analiz etmek için bu hücrelerden elde edilir. Bu iletişim kuralı için yüksek kaliteli RNA koleksiyonu aşağı akım analizi qPCR ve transcriptomics gibi gerçekleştirmek için izin verir.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

Biz birincil hücre kültürleri zebra balığı embriyo transfection ve canlı hücre görüntüleme gibi primer hücre--dan yetişkin zebra balığı beyin hazırlamak için bir protokol için hazırlanması için etkili ve kullanımı kolay bir protokol mevcut.

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Bu protokol, erken evre zebrafit embriyoları belirli hücre popülasyonlarında hassas kolokalizasyon analizlerini sağlayarak, krobölümler üzerinde sıralı immünofluoresesans ve immünhistokimyasayı gösterir.

Cryosec, zebrafish embriyo üzerinde sıralı Immünofluorescence ve Immünhistokimya

Bu protokol, elektrofizyolojik çalışmalar için uygun, yetişkin, genç, larval ve embriyonik zebra balıklarından (Danio rerio) canlı kardiyak ve vasküler düz kas hücrelerinin akut izolasyonunu tanımlamaktadır.

Kardiyak ve Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Yetişkin, Genç, Larva ve Embriyonik Zebra Balıklarından İzolasyonu

Burada, tek hücreli RNA dizileme analizi için döllenmeden 5 gün sonra zebra balığı larvalarından bağırsak izolasyonu için bir yöntem açıklıyoruz.

Tek Hücreli RNA Dizilimi için Zebra Balığı Larvalarından Bağırsak İzolasyonu

Öğrenin, mikroakışkan sistemler kullanarak Danio rerio embriyolarından tek hücre izolasyonu ve gen ekspresyonu analizi yöntemini. Bu teknik, hücre farklılaşmasındaki transkripsiyonel değişiklikleri ortaya çıkarır.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet