Travmatik Beyin Hasarı Murine Modelinde İntranazal Doğum sonrası MRG kullanarak Süperparamanyetik Demir Oksit etiketli Mezenkimal Kök Hücrelerin Takibi

Bu yöntem beyne intranazal doğumdan sonra lobitik kök hücrenin baz dağılımını belirlemeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, mezenkimal kök hücrelerin beyne non-invaziv doğum ve takibini kolaylaştıran olmasıdır. Ayrıca, birden fazla dozda yaralanmalar dan sonra kronik aşamada nakledilen hücrelerin terapötik etkilerini maksimize etmek mümkündür.

Bu teknik, yaralanma bölgesine teslim edilen hücre sayısını en üst düzeye çıkarır ve lobitik hücrenin diğer dokulara ilerlemesini en aza indirir. Bu teknik travmatik beyin hasarı tedavilerinde mezenkimal kök hücrelerin kullanımına ışık tokus etmekle birlikte, travmatik olmayan beyin yaralanmalarının araştırılmasında da kullanılabilir. Süper paramanyetik demir oksit ile mezenkimal kök hücre etiketleme için, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 24 saatlik kuluçka için bir T 75 şişesinde% 80 eşzamanlı mezenkimal kök hücre kültürüne etiketleme orta altı mililitre ekleyin.

Ertesi gün, dikkatle süper natant aspire ve yıkama başına PBS altı mililitre ile hücreleri iki kez yıkayın. Hücrelerin başarılı bir şekilde etiketlenip etiketlenmediğini belirlemek için, floresan bir mikroskop altında kültürü kontrol edin. Bir CCI yaralanma neden olmak için, pedal refleks yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, kafatasının dorsal yüzeyinden kürk tıraş için elektronik makas kullanın, ve iyot batırılmış steril bir pamuklu bez ile birkaç kez traş alanı temiz.

Son bezden sonra iyot çıkarmak ve bir stereotaktik çerçeve içinde hayvan yerleştirmek için% 70 etanol batırılmış bir pamuklu bez kullanın. Fareyi kulak ve burun çubuklarıyla sabittutun ve kafatası yüzeyine erişmek için tıraşlı deride 2,5 santimetrelik orta sagital kesi yapın. Kafatası kapsayan doku kaldırmak ve% 3 hidrojen peroksit ile ıslatılmış bir pamuklu bez ile 10 saniye boyunca kafatası yüzeyini temizlemek için bir pamuk ped kullanın.

Taze bir pamuk ped ile kafatası kuru ve maruz kemik üzerinde tercih koordinatları etrafında dört milimetrelik bir daire çizmek için bir kalem kullanın. 0,5 milimetre çapında yuvarlak bur ile donatılmış bir mikro matkap kullanarak, dikkatle basınç uygulamadan işaretli daire de kafatası inceltin. Temiz ve kuru pamuklu bir bezle kemik tozunu çıkarın ve ortaya çıkan kemik kapağını dikkatlice çıkarmak için steril kılıflar kullanın.

Dura mater maruz kaldığında, cci cihazının stereotaktik çerçeve içine fare aktarın ve baş rostrocaudal yönde düzeyde olacak şekilde kulak ve burun çubukları ile hayvan güvenli. Kontrol kutusundaki talimatları izleyerek, darbeci ucu doğrudan istenilen korteks koordinatlarının üzerine hizalamak için darbeci ucuetkilemek için darbeci nin tabanındaki X ve Y kontrol tekerleklerini kullanarak maruz kalan kortikal yüzeye darbe ucunu sıfırlayın. Deneme parametrelerini saniyede beş metre hıza, 250 milisaniyelik bir çalışma süresine ve hafif bir yaralanmaya neden olmak için bir milimetrelik yaralanma derinliğine ayarlamak için kontrol kutusunu kullanın.

Ardından, kontrol kutusunun üzerindeki darbe düğmesine basın. Steril pamuklu bir bezle oluşan herhangi bir kanamayı temizle ve fareyi çerçeveden çıkarın. Kesiyi ipek cerrahi dikişlerle kapatın ve fareyi tam tedavi edilene kadar izleyerek bir ısıtma yastığına yerleştirmeden önce siteye topikal antibiyotik uygulayın.

Yaralanmadan bir gün sonra, mezenkimal kök hücre kültürünü üç mililitre tripsin ile etiketlenmiş süper paramanyetik demir oksit tedavi edin. 37 santigrat derecede beş dakika sonra, önceden ısıtılmış DMEM orta yedi mililitre ile reaksiyona başlamak, 10% fetal sığır serum ile takviye ve 15 mililitre konik tüp içine hücre süspansiyon toplamak. Hücreleri santrifüj ile çökün ve pbs'deki peleti saymak için yeniden askıya alın.

Daha sonra, hücre konsantrasyonu 1,5 kez 10 PBS 18 mikrolitre başına beş hücre ayarlayın. Hücre teslimatı için, parmak sıkışmayanıt eksikliği doğruladıktan sonra, kafatası immobilizing sırasında fare scruff. PBS mikrolitre başına dört birim hyaluronidase içeren bir pipetin ucunu farenin nareyakınını 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve her burun deliğe üç mikrolitre hyaluronidase süspansiyon uygulayın.

Toplam 100 ünite hyaluronidase tedavisi için tedaviyi dört kez tekrarlamadan önce hayvanın yüzünü beş dakika boyunca temiz bir pedüzerine yerleştirin. Son tedaviden sonra fareyi sadece gösterildiği gibi dizginlemeden önce fareyi 30 dakika boyunca alti ye geri yerleştirin. Baş hareketsiz ken, çözelti teslim başına üç saniyelik bir süre boyunca her burun deliğine mezenkimal kök hücre süspansiyonunun üç mikrolitresini uygulayın ve numune damlaları tamamen kaybolana kadar fareyi 30 saniye pozisyonda tutarak yerleştirin.

İki dakika sonra, mezenkimal kök hücre hacmi nin tamamı teslim edilene kadar teslimatı üç kez tekrarlayın. Daha sonra fareyi tam uygun olana kadar izleyerek kafesine geri döndürün. Mezenkimal kök hücrelerin MRG ile geçişini izlemek için, anestezili fareyi MR görüntüleyicinin görüntüleme tutucusu üzerine yerleştirin.

Daha sonra hayvanı yerinde sabitle ve tutucuyu MR Bobini'nin ortasına taşıyın. Yineleme süresini 1500 milisaniyeye, yankı süresini ise 2,8 milisaniyeye ayarlayın. Daha sonra, görüş alanını 16'ya 16 milimetre, satın alma matrisini 128'e, dilim kalınlığını 0,75'e, 0,8 milimetreye, dört sinyal ortalaması ve 90 derece çevirme açısıyla ayarlayarak bir spin yankı dizisi kullanarak T2 yıldız ağırlıklı taramaları elde edin.

Taramaları tamamladıktan sonra fare tutucuyu MRI bobini merkezinden geri çekin ve fareyi tam recumbency kadar izleyerek kafesine geri döndürün. T2 yıldız ağırlıklı görüntülerdeki etiketli mezenkimal kök hücreleri izlemek ve ölçmek için, BT kasa snap yazılımındaki verileri açın ve etkin etiketi seçin. Her segment için farklı etiket renkleri kullanarak hipoyoğun alanların ve lezyonun veya ilgi çeken diğer beyin parçalarının segmentasyonlarını oluşturmak.

Mezenkimal kök hücreleri etiketli süper paramanyetik demir oksit temsil eden hipoyoğun alanları seçmek için ana araç çubuğunda çokgen aracını kullanın ve kabul edin. Parçalı alanlar, belirli bir kesime atanan etkin etiketle aynı renkte görünür. Tüm dilimler bölümlere ayrılmıştır, tüm beyinde mezenkimal kök hücre dağılımını temsil etmek için parçalı alanların bir 3D harita geliştirmek için neşter aracı nı kullanın.

Etiketli hücreleri temsil eden parçalı hipoyoğun alanların hacim ve yoğunluk ortalamasının nicel analizini yapmak için segmentasyona tıklayın ve hacim ve istatistikleri seçin. İntranazal doğumdan 24 saat sonra, süper paramanyetik demir oksit etiketli mezenkimal kök hücreler, t2 yıldız ağırlıklı görüntülerde kortikal yaralanmaya orta kuvvette hipoyoğun alanlar olarak tespit edilir ve bu da süper paramanyetik demir oksitin yaralanma bölgesine hedefli göçettiğini gösterir. Bu geçiş, teslimat sonrası 14 güne kadar sinyalde gözle görülür bir azalma olmadan görünür kalır.

PBS ile tedavi edilen yaralı hayvanlarda herhangi bir zamanda hipoyoğun alanlar sergilenmez, gözlenen hipoyoğun alanların mezenkimal kök hücreler olarak etiketlenmiş süper paramanyetik demir oksite karşılık geldiğini ve sinyal objelerinden kaynaklanmadığını gösterir. Etiketli mezenkimal kök hücrelerin biyo-dağılımı 3D rekonstrüksiyon, histolojik Prusya mavi boyama, ya da etiketli mezenkimal kök hücreler içinde süper paramanyetik demir oksit etiketli FITC floresan tespiti ile görselleştirilmiş olabilir. Estoloji veya diğer yöntemlerle MR Sonuçları doğrulamak için emin olun.

Süper manyetik demir oksit parçacıkları hücre öldükten sonra dokularda kalabilir, yanlış pozitif sinyallere yol açar. Bu prosedürü takiben, sayısallaştırmada olası temperal non-invaziv izleme yetenekleri honlama ve beyinde mezenkimal kök hücrelerin tutulması ile ilgili soruları cevaplamak için uygulanabilir. Bu gelişmeden sonra, bu teknik beynin belirli bölgelerine honlama hücre geliştirmek için yöntemler keşfetmek için rejeneratif tıp alanında araştırmacılar için yol açmıştır.