Name: Solid Tümörlerin Prediktif İmmün Modellemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Öğrenin, RNA tabanlı immün profilleme yöntemiyle solid tümörlerdeki bağışıklık hücrelerini hassas şekilde ölçün. Bu protokol, immün-onkolojide biyobelirteç keşfi ve tedavi yanıtlarını anlamak için çok boyutlu bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, TriStar Technology Group'un temsili sonuçların yanı sıra Cofactor Genomics'teki tüm moleküler, analiz, ürün ve ticari ekiplerin teknik uzmanlıkları ve Destek.

<ol><li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li>
<li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-infiltrating+lymphocytes%2C+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients%3A+clinicopathological+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li>
<li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).</li>
<li>Sierant, M. C., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Sequencing+in+Cancer%3A+Recent+Applications+to+Immunogenomics+and+Multi-omics+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Inform%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools.</a> Genomics Inform. 16, (2018).</li>
<li>Klauschen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+of+tumor-infiltrating+lymphocytes%3A+From+visual+estimation+to+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning.</a> Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).</li>
<li>Danaher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+markers+of+Tumor+Infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18(2017).</li>
<li>Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((xCell%3A+digitally+portraying+the+tissue+cellular+heterogeneity+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape.</a> Genome Biology. 18 (1), 220(2017).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li>
<li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218(2016).</li>
<li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128(2017).</li>
<li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154(2018).</li>
<li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612(2013).</li>
<li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li>
<li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis%3A+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482(2019).</li>
<li>PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO. , OncologyPRO. https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer (2019).</li>
<li>Haslam, A., Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+Percentage+of+US+Patients+With+Cancer+Who+Are+Eligible+for+and+Respond+to+Checkpoint+Inhibitor+Immunotherapy+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Network+Open%22%5BJournal%5D)">Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs.</a> JAMA Network Open. 2 (5), e192535(2019).</li>
<li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Schillebeeckx, I., et al. Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting. Journal of Molecular Diagnostics. 21, Baltimore, MD. (2019).</li>
<li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+%28TILs%29+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25(2018).</li>
<li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD4%2FCD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li>
<li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting. Cancer Research. 79 (13 Suppl), Atlanta, GA. (2019).</li>
</ol>

Tüm yazarlar Cofactor Genomics, Inc, geliştirilen ve Bu makalede kullanılan ImmunoPrism reaktif kiti ve bilişim araçları üreten şirket tarafından istihdam edilmektedir. İmmünoPrizma Tsay Sadece Araştırma Kullanımı içindir ve tanı prosedürlerinde kullanım için değildir.

Protokol 20 ng bozulmamış veya 40 ng yüksek oranda bozulmuş (FFPE) RNA gerektirir. RNA örneği DNA, tuzlar (örneğin, Mg2+veya guanidinium tuzları), divalent katyon şelat ajanları (örneğin, EDTA, EGTA, sitrat) veya organik (örn. fenol ve etanol) içermez. DV200 <%20 olan RNA örnekleri ile devam etmek önerilmez. Bu denetimler, kitaplık hazırlamadan çözümedomaya kadar tüm protokol boyunca performansı değerlendirmek için bir araç sağladığından, kit içi denetim RNA'nın kullanımı önemle tavsiye edilir.
Protokol 0.2 mL PCR şerit tüpler kullanılarak yapılacak şekilde tasarlanmıştır. Tercih edilirse, protokol 96 kuyulu PCR plakalı kuyular kullanılarak da yapılabilir. PCR tüpleri veya şerit tüpleri tüm referanslar yerine 96-iyi PCR plaka kuyuları kullanın. Boncuk arınmaları ve yıkama adımları sırasında boncukların tamamen yeniden askıya alınmasını görsel olarak onaylamak kritik olduğundan, PCR plakaları yalnızca açık kuyularla kullanın.
Protokol boyunca, aksi belirtilmedikçe reaktifleri dondurulmuş veya buz üzerinde tutun. Tamamen çözülene kadar reaktifkullanmayın. Kullanmadan önce tüm reaktifleri iyice karıştırdığından emin olun.
Enzimleri kullanıma hazır olana kadar -20 °C'de tutun ve kullanımdan hemen sonra -20 °C'ye dönün. Sadece moleküler dereceli nükleaz içermeyen su kullanın; DEPC ile işlenmiş su kullanılması tavsiye edilmez. Karıştırmak için pipetting, yavaşça aspire ve çözeltiler iyice karıştırılır kadar toplam hacminin en az% 50 dağıtmak. Pipet enzimiçeren tüm ana karışımları karıştırın. Enzimleri karıştırmak için girdap kullanmak denatürasyona yol açabilir ve performanslarını tehlikeye atabilir. Boncuk arınmaları sırasında, moleküler sınıf etanol taze yapılmış% 80 etanol çözeltileri kullanın. Taze olmayan etanol solüsyonlarının kullanılması verimin düşmesine neden olabilir. Bu elüsyon verimliliğini azaltabilir gibi boncuklar kurutma üzerinde kaçının (boncuk kurutulmuş üzerinde kırık görünüyor).
Adım 10'da açıklandığı gibi, her reaksiyona benzersiz dizin astarları eklenir. Bu endekslerin dizilerine göre, düşük seviyeli çoklama için, bazı dizin kombinasyonları en iyisidir. Bu endekslerin dizileri, sıralama sonrası verilerin demultiplexing için gereklidir. Diziler ve önerilen çoklama kombinasyonları Ek Tablo 3'teverilmiştir. Aynı adımda, önerilen PCR döngülerinin sayısının kullanılan RNA'nın kalitesine bağlı olarak değiştiğine ve PCR'nin aşırı amplifikasyonu önlemek için bazı optimizasyonların gerekli olabileceğini unutmayın. ImmunoPrism Intact Control RNA ve diğer yüksek kaliteli RNA için, 10 PCR döngüleri ile optimizasyon abaşlayın. İmmünoPrizma FFPE Control RNA ve diğer yüksek oranda bozulmuş/FFPE RNA için 15 PCR döngüsü ile optimizasyona başlayın. PCR döngülerini optimize etmek için analiz edilecek malzemenin RNA temsilcisi kullanılarak bir test kitaplığı oluşturmaönerilir. Sürekli olarak yeterli ön yakalama kitaplığı verimi (>200 ng) sağlayan minimum PCR çevrimi kullanılmalıdır. Bioanalyzer iz üzerinde 1000 bp civarında ikincil bir tepe aşırı amplifikasyon göstergesidir(Şekil 4). Aşırı amplifikasyon en aza indirilmelidir, ancak küçük bir ikincil tepenin varlığı taht sonuçlarını etkilemez.
Numune kaybını en aza indirmek ve tüp değiştirmeyi önlemek için, Vakum konsantratörünüz izin veriyorsa, 1,5 mL mikrotüpler yerine PCR tüplerde, şerit tüplerde veya 96 kuyulu PCR plakada Adım 13 yapılabilir. Rotor birçok konsantratörde çıkarılabilir. Bu, şerit tüplerinin veya plakaların vakuma sığmasını sağlar. Vakum konsantrasyonu daha sonra hiçbir santrifüj ile sulu desiccation ayarı kullanılarak çalıştırılabilir. Talimatlar için vakum konsantratörünüz için kılavuza başvurun. Numuneler şerit tüpler veya 96 kuyulu bir plaka içinde kurutulursa, hibridizasyon adımı aynı kapta yapılabilir.
Adım 17 sırasında, boncuk yakalama verimliliğini artırmak için her 10-12 dakika girdap emin olun. Tüplerin açılmasını önlemek için karıştırma yaparken sıcak şerit tüplerinin kapaklarını dikkatlice tutun.
Adım 18'de tanımlanan yıkarlar yüksek spesifik olmayan kontaminasyonu önlemek için önemlidir ve yakından takip edilmelidir. Her yıkamada boncukları tamamen askıya aldığından, yıkama tamponlarını tamamen çıkardığından ve Yıkama Tamponu 2 yıkama sırasında numuneleri taze bir şerit tüpüne aktardığından emin olun (Adım 18.6.5). Streptavidin boncuktamamen resuspended ve tüm kuluçka sırasında süspansiyon kalır emin olun. Tüp kapaklarına sıçrama, yakalamayı olumsuz etkilemez. Oda sıcaklığında yıkar sırasında, daha kolay yeniden süspansiyon için iki dakikalık kuluçka süresinin tamamı için numuneleri girdaplamak için bir mikroplaka girdap karıştırıcı kullanılabilir. Streptavidin boncukları kurumasına izin vermeyin. Gerekirse, boncukların kurumasını önlemek için tamponlarda kuluçka süresini uzatın. Birden fazla şerit tüp kullanıyorsanız, diğer şerit tüpler termocycler içinde oturup her yıkama için bir seferde bir şerit tüp ile çalışın. Bu boncuk kurutma veya acele üzerinde önlemek yardımcı olabilir, kötü resuspension veya diğer sub-optimal teknikleri ile sonuçlanan. İlk kez kullanankullanıcılar için, aynı anda 8'den fazla kitaplık reaksiyonlarını işlemek önerilmez.
Mevcut immün profilleme teknikleri, önemli yorumlanması (RNA sıralaması) gerektiren binlerce veri noktasından bireysel, ayrık bir veri noktasına (tek pleksli IHC) kadar sürekli bilgi sunar. Burada açıklanan protokol, yüksek hassasiyet sağlayan odaklanmış bir kapsama sahip, ancak klinik olarak ilgili transkripsiyonel verilerin yalnızca bir alt kümesini yakalayan, ortada bir yerde olan bir yaklaşımı temsil eder. Toplu RNA çıkarma doğası nedeniyle, bu protokol bağışıklık hücreleri ve tümör mikroçevre arasındaki mekansal ilişkiler hakkında bilgi sağlamaz, ancak, sonuçlar bu bilgileri eklemek için görüntüleme teknolojileri ile tamamlanabilir. Bu protokol tarafından oluşturulan veriler için sayısız uygulama vardır, çünkü kanserin bir hastalık olarak biyolojisi hakkında öğrenilecek çok şey vardır ve tedavi etmek için geliştirilen tedaviler. Temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, bireysel bağışıklık raporu, hastalığın ilerlemesi veya tedavisi gibi olaylara yanıt olarak hastanın bağışıklık profilinin nasıl değişebileceğini anlamak için yararlıdır. Burada sunulan sonuçlar bazı örnek kullanım durumlarını sağlarken, bir tedavinin etki mekanizmasının araştırılması ve progresyonsuz ve genel sağkalım gibi klinik sonuçların putatif biyobelirteçlerinin belirlenmesi de dahil olmak üzere diğer uygulamalar da Pratik. Biyomarker keşif uygulamaları için bu protokolü kullanırken, homojen popülasyonların analiz edilmesini, istatistiksel güç için yeterli numunelerin dahil edilmesini ve önyargı kaynaklarının dikkate alınmasını sağlamak için iyi bir çalışma tasarımı nın uygulanması önemlidir. İdrarın odaklanmış, aerodinamik doğası nedeniyle, bu biyobelirteçlerin bir kez keşfedildikten sonra klinik doğrulama ve aşağı akım uygulamasına doğru bir yol hayal etmek mümkündür.

Tümör-infiltrasyon lenfositler (TILs) ve formalin-sabit ve parafin gömülü parafin diğer bağışıklık ile ilgili moleküllerin sayısallaştırılması (FFPE) katı tümör insan dokusu örnekleri klinik araştırma değeri göstermiştir1,2,3. Akış sitometrisi ve tek hücreli ribonükleik asit (RNA) dizilimi gibi yaygın teknikler taze doku ve kan4için yararlıdır, ancak canlı hücre süspansiyonları oluşturamamaktan dolayı FFPE malzemelerinin analizi için uygun değildir. FFPE dokusundaki bu hücreleri ölçmek için kullanılan mevcut yöntemler büyük zorluklardan muzdarip. İmmünohistokimya (IHC) ve diğer benzer görüntüleme iş akışları hücre yüzeyi proteinleri tespit etmek için özel antikorlar gerektirir, hangi tekrarlanabilir nicelleştirme sağlamak için laboratuvarlar arasında standartlaştırmak zor olabilir5. nCounter sistemi gibi platformlar, anahtar bağışıklık hücrelerini tanımlamak için tek genlerin ekspresyonuna dayanır6, duyarlılık ve algılama özgüllüğünü sınırlayan. Daha genel RNA sıralama yöntemleri, bağımsız yazılım araçları ile birleştiğinde, mevcuttur ama kullanmadan önce önemli optimizasyon ve doğrulama gerektirir7,8,9,10,11,12. FFPE doku için RNA dizilimi ile lazer yakalama mikrodisseksisi (LCM) birleştirerek son gelişmeler umut göstermiştir; ancak, sağlam biyobelirteçleri13,14tanımlamayı amaçlayan çeviri çalışmaları için daha yüksek işhacmi,anahtar teslimi çözüm gereklidir. Tedavi yanıtlayıcıları, kanser alt tipleri veya yüksek öngörülü doğruluk ve istatistiksel anlamlılıkla sağkalım sonuçlarını tanımlayan Predictive Immune Modeling gibi çok boyutlu biyobelirteçler oluşturma yöntemleri, hassas tıp ve immünoterapi çağında giderek daha önemli hale gelmektedir15,16.
Bu ihtiyacı gidermek için, standart RNA dizilimi reaktifleri ve bulut tabanlı bilişim kullanılarak solid tümör FFPE dokusundaki bağışıklık hücrelerinin hassas ve spesifik olarak ölçülmesini sağlamak için bir immün profil testi geliştirilmiştir. Protokol, FFPE dokusundan bozulmuş RNA'yı karşılamanın yanı sıra, çekirdek iğne biyopsileri, iğne aspireleri ve mikro veya makro-parçalanmış doku gibi sınırlayıcı doku örneklerinden elde edilen RNA'yı da barındırabilir. Her örnekten gelen RNA verileri, bağışıklık hücrelerinin bağışıklık sağlığı ekspresyonu modelleri olarak adlandırılan gen ekspresyonu modellerinin bir veritabanıile karşılaştırılır ve bağışıklık hücrelerini örnekte bulunan toplam hücrelerin yüzdesi olarak ölçer. Kısaca, bu modeller saflaştırılmış bağışıklık hücresi popülasyonlarından üretilen tüm transkriptom verilerinden benzersiz multijenik ifade desenleri tanımlamak için makine öğrenme yöntemleri kullanılarak inşa edilmiştir (kanonik hücre yüzeyi belirteçleri kullanılarak izole)17,18. Teknolojinin altında yatan çok boyutlu Sağlık İfade Modelleri, her bağışıklık hücresinin heterojen karışımda bulunan toplam hücrelerin yüzdesi olarak ölçülmesini sağlar. Bu, araştırmacının klinik değeri19,20olduğu gösterilmiştir inter- ve intra-örnek bağışıklık hücresi karşılaştırmaları oluşturmak için olanak sağlar. Diğer uygulamalar arasında temsili sonuçlarda açıklandığı gibi immün yanıt ın tedavi öncesi ve sonrası niceliği yer almaktadır. Sekiz bağışıklık hücre tipinin mutlak yüzdeleri de dahil olmak üzere tümör ve tümör mikroortamının bağışıklık kondoku larının birden fazla özelliği (gen ekspresyonu modellerinden türetilmiştir): CD4+ T hücreleri, CD8+ T hücreleri, CD56+ Doğal Öldürücü hücreler, CD19+ B hücreleri, CD14+ monositler, Tregs, M1 makrofajlar ve M2 makrofajları. Buna ek olarak, tahmin on bağışıklık kaçış geninin ifadesini (transkriptlerde veya TPM olarak) bildirir: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 ve ARG1.
Reaktif kiti, Şekil 1'degösterildiği gibi, hibrit yakalama tabanlı kütüphane hazırlama yöntemini takiben illumina platformunda sıralamaiçin yüksek kaliteli kütüphaneleri hazır hale getirmek için kullanılır. Bir araştırmacının laboratuvarında Illumina sıralama platformu yoksa, numunelerini sıralama için bir çekirdek laboratuvara gönderebilir. Oluşturulduktan sonra, sıralama verileri otomatik analiz için Prism Portal'a yüklenir ve her bir örnek için, İmmün Raporu(Şekil 2A)şeklinde kapsamlı, nicel bir profil kullanıcıya iade edilir. Kullanıcılar ayrıca Prism Portal'da örnek gruplandırmaları tanımlayarak iki hasta grubunu birbirinden ayıran istatistiksel olarak anlamlı biyobelirteçleri vurgulayan bir Biyomarker Raporu(Şekil 2B)oluşturabilirler. Daha da önemlisi, reaktif kiti tarafından oluşturulan veriler yalnızca araştırma amaçlıdır ve tanılama amacıyla kullanılamaz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> Şekil 1: İş Akışına Genel Bakış. Bu protokolde, RNA ilk cDNA dönüştürülür. Sıralama adaptörleri ligated ve adaptör-ligated cDNA güçlendirilmiş ve pcr tarafından barkodlu bir ön yakalama kitaplığı oluşturmak için. Biyotinylated problar daha sonra streptavidin boncukkullanılarak yakalanan belirli cDNA hedeflerine hibridize edilir. Bağlanmamış, hedefsiz cDNA yıkanarak çıkarılır. Son bir PCR zenginleştirme, sıralamaya hazır bir yakalama sonrası kitaplık sağlar. *Toplam RNA insan örneklerinden olmalıdır; bozulmamış veya bozulmuş (FFPE) RNA olabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> Şekil 2: Temsili Bağışıklık Raporları. İş akışı iki rapor, işlenen her örnek için ayrı bir bağışıklık raporu(A)ve tanımlanmış hasta kohortları için bir biyomarker raporu(B)oluşturur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Protokol yaklaşık 16 saat hazırlık süresi gerektirir (toplam RNA'dan sıralamaya hazır kütüphanelere kadar); ancak, protokolde belirtildiği gibi, isteğe bağlı durdurma noktaları vardır. Test, transkriptomiklerin zengin, dinamik doğasını kullanarak eski tek analitik biyobelirteçlerin ötesine geçerek çok boyutlu gen ekspresyonu modellerine yönelerek doku örneklerinin standartlaştırılmış olarak kapsamlı biyolojik karakterizasyonunu sağlar. reaktifler ve kullanımı kolay yazılım araçları. Araştırmacıların, değerli klinik örneklerin daha doğru, nicel bağışıklık profillerini elde etmek ve keşfetmek için makine öğreniminden ve Sağlık İfade Modelleri veritabanından yararlanarak kendi laboratuvarlarında çağdaş bir teknolojiyi kullanmalarını sağlar. tam istatistiksel analiz ile çok boyutlu RNA biyobelirteçleri.

<table><tbody><tr><td>0,2 mL PCR 8 tüp şeridi</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td>USA Scientific 0,2 mL PCR 8 tüplü şerit</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>EX0276-1</td><td>Deney gününde nükleaz içermeyen su ile karıştırarak %80 hazırlayın</td></tr><tr><td>96 kuyulu termal döngüleyiciler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Katı Faz Tersinir İmmobilizasyon (SPRI)</td><td>Boncukları Beckman-Coulter</td><td>A63882</td><td>Agencourt AMPure XP &ndash; PCR Saflaştırma</td></tr><tr><td>boncukları Dijital elektroforez çipleri ve kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Agilent Yüksek Hassasiyetli DNA çipleri ve kiti</td></tr><tr><td>Dijital elektroforez sistemi</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>Agilent 2100 Elektroforez Biyoanalizörü</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Boncukları ThermoFisher Scientific</td><td>65306</td><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td></tr><tr><td>İmmünoPrizma Kiti ve ndash; 24 reaksiyon</td><td>Kofaktör Genomik</td><td>CFGK-302</td><td>Kofaktör İmmünoPrizma İmmün Profil Oluşturma Kiti & ndash; 24 reaksiyon</td></tr><tr><td>İnsan Cot-1 DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15279011</td><td>Invitrogen marka</td></tr><tr><td>Manyetik ayırma rafı</td><td>Alpaqua/Invitrogen</td><td>A001322/12331D</td><td>96 kuyulu Manyetik Halka Standı</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>22620701</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>USA Scientific 1.5 mL düşük yapışmalı mikrosantrifüj tüpü</td></tr><tr><td>NextSeq550</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002</td><td>Bu protokol için herhangi bir Illumina sıralayıcı kullanılabilir</td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Prizma Ekstraksiyon Kiti</td><td>Kofaktör Genomik</td><td>CFGK-401</td><td>Kofaktör Prizma FFPE Ekstraksiyon Kiti ve ndash; 24 örnek</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış RNA</td> <td>-</td><td></td> <td>İnsan doku örneklerinden saflaştırılmış</td></tr><tr><td>Florometre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td>Qubit 4 Sistemi</td></tr><tr><td>Florometrik Test Tüpleri</td><td>Axygen</td><td>PCR-05-C</td><td>Düz Kapaklı 0.5 mL İnce Duvar PCR Tüpleri</td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli Florometrik Reaktif Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q32854</td><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td></tr><tr><td>Vakum yoğunlaştırıcı</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>VacufugePlus</td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu veya ısıtma bloğu</td><td>VWR / ABD Scientific</td><td>NA / 2510-1102</td><td>VWR su banyosu / ABD Bilimsel ısıtma bloğu</td></tr></tbody></table>

solid tümörlerin prediktif İmmün modellemesi

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

İmmünoterapiler onkoloji hastalarının tedavisinde umut vaat eder, ancak tümör mikroortamının karmaşık heterojenliği tedavi yanıtını öngörmeyi zorlaştırır. Tümör dokusu nda ve çevresinde bulunan bağışıklık hücrelerinin göreceli popülasyonlarını çözme yeteneğinin yanıtı anlamak için klinik olarak uygun olduğu gösterilmiştir, ancak akış sitometrisi ve immünohistokimya gibi geleneksel tekniklerle sınırlıdır ( IHC), gerekli doku büyük miktarda nedeniyle, doğru hücre tipi belirteçleri eksikliği, ve birçok teknik ve lojistik engeller. Bir titreci (örneğin, ImmunoPrism Immune Profiling Tsay) rna hem küçük miktarlarda ve son derece bozulmuş RNA, rna ortak özellikleri klinik olarak arşivlenmiş katı tümör dokusu ndan çıkarılan barındırarak bu zorlukların üstesinden. Teste, Illumina sıralama platformları için uçtan uca nicel, yüksek iş letimatif immün profilleme çözümü sağlayan bir reaktif kiti ve bulut tabanlı bilişim aracılığıyla erişilir. Araştırmacılar formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) doku veya toplam RNA 20-40 ng (örnek kalitesine bağlı olarak) iki bölüm kadar az ile başlar ve protokol sekiz bağışıklık hücresi tipleri ve on bağışıklık kaçış niceliksel bir bağışıklık profili raporu oluşturur genler, tümör mikroortamının tam bir görünümünü yakalama. Elde edilen verilerden yararlanmak için ek biyoinformatik analiz gerekmez. Uygun örnek kohortlarla protokol, hasta kitlesi içinde istatistiksel olarak anlamlı biyobelirteçleri tanımlamak için de kullanılabilir.

Protokol boyunca, kullanıcının oluşturulan malzemelerin kalitesini ve miktarını değerlendirmesini sağlayan birkaç denetim noktası vardır. Protokolde açıklanan Adım 12'den sonra Şekil 3'tegösterildiği gibi, bozulmamış bir RNA örneği için tipik bir ön yakalama kitaplığını temsil eden bir elektroferogram oluşturulur (RIN = 7.8).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> Şekil 3: Bozulmamış bir RNA örneği için tipik Yakalama Öncesi Kütüphane Biyoanalizörü izi. Yakalama öncesi kütüphaneler 250-400 baz çiftleri (bp) boyutu nda geniş bir tepe olarak görünür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
FfPERNA örneğinden (DV200 = 46) üretilen bir ön yakalama kütüphanesinin temsili elektrofeogramı olan Şekil 4'te gösterilen 1.000 bp civarındaki ikinci tepede belirtildiği gibi aşırı amplifikasyonu önlemeye özen gösterilmelidir. Bu tepe ana tepeye göre küçükse (gösterildiği gibi yaklaşık 250-400 baz çifti (bp), akış aşağı adımlarına veya analizlerine engel olmaz. İkinci tepe 250-400 bp tepeye göre büyükse, aşırı amplifikasyonu azaltmak için ön yakalama kitaplığı daha az PCR döngüsüyle yeniden yapılabilir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> Şekil 4: FFPE RNA örneği için tipik Yakalama Öncesi Kütüphane Biyoanalizörü izi. 1.000 bp civarındaki ikinci zirve aşırı amplifikasyonun göstergesidir. Bu tepe 250-400 bp civarında ana tepeye göre küçük ise (gösterildiği gibi), aşağı adımlar veya analiz müdahale etmez. İkinci tepe 250-400 bp tepeye göre büyükse, aşırı amplifikasyonu azaltmak için ön yakalama kitaplığı daha az PCR döngüsüyle yeniden yapılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Adım 12.1.3'te açıklandığı gibi, ek temizleme gerekip gerekip gerekip gerekmediğini belirlemek için adaptör dimerlerinin varlığı değerlendirilmelidir. Şekil 5'te gösterilen elektropherogramlar kabul edilemez(Şekil 5A, DV200 = 33) ve kabul edilebilir(Şekil 5B, DV200 = 46) adaptör dimer düzeyleri, 128 bp civarında keskin tepe olarak görünen temsil eder.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> Şekil 5: Yakalama öncesi kütüphane Bioanalyzer izleri. Adaptör dimer 128 bp. civarında keskin bir tepe olarak gösterir. (A) Aşırı adaptör dimerler bu elektrofeogram mevcuttur. (B) Kabul edilebilir adaptör dimer düzeyleri bu izde gösterilmiştir. Her iki iz de hafif aşırı amplifikasyon kanıt göstermek, ancak bu ImmunoPrism Assay müdahale etmemelidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Protokolün tamamlanmasından önce, sıralamadan önce, son kütüphaneler tekrar dijital elektroforez kullanılarak değerlendirilir. FFPE RNA'dan yapılan kütüphaneler, bozulmamış RNA'dan yapılan kütüphanelere göre ortalama boyut dağılımından daha küçüktür. Bozulmamış RNA örnekleri için elde edilen iz Şekil 6'ya benzer olmalıdır (RIN = 9.5). Bozulmuş veya FFPE RNA için elde edilen iz Şekil 7'ye benzer olmalıdır (DV200 = 36).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> Şekil 6: Bozulmamış bir RNA örneği için Tipik Final Library Bioanalyzer izi. Son kütüphaneler boyutu 250-400 baz çiftleri (bp) etrafında geniş bir tepe olarak görünür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> Şekil 7: FFPE RNA örneği için Tipik Final Library Bioanalyzer izi. FFPE RNA'dan yapılan kütüphaneler, bozulmamış RNA'dan yapılan kütüphanelere göre ortalama boyut dağılımından daha küçüktür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Açıklandığı gibi, bu protokolle oluşturulan sonuçlar Şekil 8'degösterildiği gibi iki anahtar şekilde uygulanabilir.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> Şekil 8: Protokolün iki kullanım örneğinde kullanılır. Bu immün profilleme tahsini ile oluşturulan sonuçlar iki temel çeviri uygulamasında uygulanır. (A) İlk kullanım olgusu insan solid tümör dokusundan (FFPE arşivleri dahil) başlar ve örnek için bireysel bir bağışıklık profili oluşturur. (B) Bir kez insan örnekleri bir kohort için oluşturulan, veri prizma Portal ı kullanılarak çok boyutlu bir biyomarker ve ilgili Biyomarker Raporu oluşturmak için birleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu kullanım örneklerinin her birini göstermek için, küçük bir çeviri çalışmasından elde edilen temsili veriler21'edahildir. Bu çalışmada kullanılan örnekler, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) tanısı konan ve tedavi edilen 7 hastadan alınan örneklerden bir erlerdir. Örnekler tedavi öncesi ve sonrası biyopsilerden hasta ile eşleşen solid tümör dokusu. İlk olarak, şekil 9'dagösterilen örnek rapor gibi bir bağışıklık profili oluşturmak için tek tek örnekler analiz edilmiştir.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> Şekil 9: NSCLC örneği için örnek bireysel immün rapor. Prism Portal boru hattı, burada gösterilen bir NSCLC katı tümör örneği için oluşturulan temsili bir rapor ile, işlenen her örnek için bir grafik raporu oluşturur. (A) Raporun ön yüzü FFPE dokusundan alınan RNA örneğinde bulunan bağışıklık hücrelerinin dökümünü grafik olarak gösteriştir. (B) Raporun ters tarafında bağışıklık hücreleri tablosu (mutlak yüzdeler halinde) ve kaçış gen ekspresyonu (milyon başına transkript veya TPM) yanı sıra tsay için performans ifadesi içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bağışıklık profilleri öncesi ve sonrası tedavi nasıl bir tedavi (kemoterapi veya radyasyon, bu çalışmada) tümör mikroçevre modifiye olduğunu anlamak için kullanılabilir. Bir örnek Şekil 10'dagösterilmiştir , her bir bağışıklık hücresi ve toplam immün içerik için yüzde değişiklikleri kemoterapi öncesi ve sonrası gösterilmiştir, tek bir hasta için.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> Şekil 10: Örnek Tedavi Öncesi ve Sonrası Sonuçlar. Tek bir NSCLC hastasından alınan tedavi öncesi ve sonrası örneklerden elde edilen bireysel immün hücre ve toplam immün içerik verileri gösterilmiştir. Bu örnekte hastaya tedavi olarak kemoterapi rejimi verilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Hastalar klinik sonuçlar veya karşılaştırma için fenotipler gibi kriterlere göre gruplandırılabilir. Örneğin, Şekil 11'de,NSCLC çalışmasındaki örnekler tedavi sonrası hastalığın ilerlemesi ile zamana göre karşılaştırıldı. Hastaların bir alt kümesi &gt;18 ay içinde hastalık nüks gösterdi ve başka bir alt küme ≤18 ay içinde daha hızlı ilerledi. Ortanca delta değeri (tedavi öncesi ve sonrası değerler arasındaki fark) hastalığın ilerlemesinin putatif biyobelirteçlerini belirlemek için her örnek için karşılaştırılır.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> Şekil 11: Örnek Klinik Sonuç Karşılaştırması. Eşleşen tedavi öncesi ve sonrası NSCLC örneklerinde bağışıklık hücresi yüzdeleri arasındaki nicel değişiklikler hesaplanmış ve "delta" değeri olarak bildirilmiştir. Sarı renkte vurgulananlar hayatta kalma durumu arasında net sinyal değişiklikleri gösterir. Mavi çubuklar hastalığın ilerlemesine kadar &gt;18 ay, turuncu çubuklar ise hastalığın ilerlemesine kadar olan 18 ay boyunca ortanca delta değerlerini temsil ediyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Son olarak, benzer örnek gruplandırmaları, biyomarker Raporu oluşturmak için Prizma Portalını kullanarak tahmine dayalı biyobelirteçleri belirlemek için özellikle tedavi öncesi numunelere bakmak için kullanılabilir. Şekil 12'degösterilen, yukarıda açıklandığı gibi aynı klinik fenotip (hastalık progresyonu) örnek gruplandırmaları tanımlar. Bu örnekte, iki immün kaçış geni örnek gruplandırmalarının istatistiksel olarak anlamlı ayırıcıları olarak tanımlanmıştır (ŞEKIL 12A'nınalt panelinde gösterilen CD47 ve OX40). Bu örnekte, bireysel gen biyobelirteçleri net istatistiksel anlamlılığa sahip sağlam olduğundan, çok boyutlu biyomarker anlamlı bir tahmin değeri eklemez (İmmünPrizma, Şekil 12B'ninsağ üst çubuk grafiğinde etiketlenmiş olarak). Tahlil için tüm 18 analit sonuçları da dahil olmak üzere veri tam tablo, istatistiksel analiz ve kısa bir yöntem özeti de dahil olmak üzere raporun ters tarafında özetlenir.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> Şekil 12: Örnek NSCLC örnekleri için Biyomarker Raporu. Biomarker Discovery boru hattı, bireysel biyobelirteçlerin görsel bir raporunu ve ayrıntılı istatistikleriçeren çok boyutlu bir makine öğrenimi biyomarkerini sunar. (A) Bu çalışma için, boru hattı 18 aylık eşiği ile hastalık ilerlemesini tanımlamak için istatistiksel olarak anlamlı olarak iki ayrı biyobelirteç (CD47 ve OX40) tespit etti. (B) Yöntem ve tam sonuçlarla ilgili ayrıntılar raporun ters tarafında yer almıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Reaktif Kiti Malzemeleri. İmmünoPrizma Kiti'nde sağlanan malzemelerin listesi, üreticiprotokolünde belirtilen parça numaralarıyla birlikte listelenir. Gerekli diğer tüm ekipman ve malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Güvenlik Veri Sayfaları (SDS) için <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> ziyaret edin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).</a>
Ek Tablo 2: Termal Cycler Programları. Protokol boyunca başvurulan önerilen döngücü programlar programlama kolaylığı için özetlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).</a>
Ek Tablo 3: Sıralama Dizin Kılavuzu. Reaktif kitinde sağlanan dizin astarları listelenir; ayrıştırma sonrası demultiplexing için her reaksiyona benzersiz bir astar eklenir. Önerilen düşük seviyeli çoklama kombinasyonları da sağlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).</a>

Solid tümör dokularının kantitatif immün profillerini belirlemek ve immün-onkoloji biyomarker keşfi için klinik kohortlardan yararlanmak için RNA tabanlı bir yaklaşımın kullanımı moleküler ve enformatik protokollerle açıklanmıştır.

Solid Tümörlerin Prediktif İmmün Modellemesi

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

İmmüno-onkoloji araştırmalarında tümör mikroçevresini kapsamlı bir şekilde karakterize etmek esastır. Bu test katı tümör dokusunda bağışıklık hücrelerini ölçmek için RNA tabanlı sağlık ekspresyonu modelleri kullanmak için ilk. Bu taht, araştırmacıların FFB solid tümör dokularında immün kondoku üzerinde son derece hassas ve spesifik ölçümler elde etmelerini ve bu sonuçları çok boyutlu bir biyomarker de birleştirmelerini sağlar.Tüm kanser tedavileri, sadece immünoterapiler, katı tümör yerinde bir bağışıklık yanıtı ortaya çıkarmak. Bu immün yanıtın ölçülmesi hastalığın ilerlemesini ve tedavi yanıtlarını anlamak için önemlidir. Bu protokol, geleneksel RNA kitaplık hazırlama tekniklerini hedefli yakalama ile birleştirir.Zaman alıcı iken, yıkama adımlarını takip etmek ve önerilen kalite kontrol kontrol noktalarının izlenmesi başarı için çok önemlidir. Formalin-sabit parafin gömülü numunelerden yüksek oranda bozulmuş RNA için, ilk iplikçik sentez reaksiyonunu buz üzerinde tabloya göre birleştirin. Numuneleri mikrosantrifüj de kısa bir süre eğilmeden önce birkaç kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak reaksiyonları iyice karıştırın.Santrifüjün sonunda, numuneleri hemen masadan üç numaralı programı takiben önceden ısıtılmış bir termal döngüye yerleştirin. Yüksek kaliteli bozulmamış RNA için, tablolarda belirtildiği gibi çekirdeksiz BIR PCR tüpünde buz üzerinde ilk iplikçik sentez reaksiyonu monte edin. Bu prosedüre başlamak için, 200 nanogramlık barkodlu ilgi alanıile iki mikrogram COT-1 DNA'sını ve iki mikrolitre bloke oligoyu çekirdeksiz bir PCR tüpünde karıştırın.Sonra tüp içeriğini kurutmak için 30 ila 45 santigrat derece ayarlanmış bir vakum konsantratör kullanın. Hibridizasyondan sonra, termal döngüceden numuneleri çıkarın ve ısıl işlem kapağı 70 santigrat dereceye ayarlanmış 65 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 17 mikrolitre tam homojenize boncukları numunelere ve pipetlere 10 kez yukarı ve aşağı aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.DNA'yı boncuklara bağlamak için tüpleri termal döngücünün içine yerleştirin 10 adet kısa bir süre için, boncukları yeniden asılı tutmak için üç saniyelik nazik girdap için her 10 ila 12 dakikada bir soyulmuş tüpleri çıkartın. Bağlayıcı kuluçka hemen ardından, termal döngücün tüpleri bir şerit çıkarın ve tüpler için önceden ısıtılmış yıkama tampon biri 100 mikrolitre ekleyin. Pipet iyice yukarı ve aşağı 10 kez ve boncuktamamen supernatant içeren sınırsız DNA aspire etmeden önce yıkama çözeltisinden ayırmak için izin vermek için bir manyetik raf tüpleri yerleştirin.Raftan tüpleri çıkarın ve kabarcıkları önlemek için özen boncuk lar tamamen askıya almak için kapsamlı karıştırma ile önceden ısıtılmış sıkı yıkama tampon 150 mikrolitre ekleyin. Tüpleri 65 santigrat derecede, tüpleri manyetik rafa yerleştirmeden önce beş dakika boyunca termal döngüye geri yerleştirin ve boncukların süpernatants'tan tamamen ayrılmasını bekleyin. Supernatants içeren sınırsız DNA atın, sadece iki sıkı yıkama toplam gösterildiği gibi önceden ısıtılmış sıkı yıkama tampon ile boncukbir kez daha yıkayın.Son yıkamadan sonra, supernatant çıkarın ve tüpler için oda sıcaklığında yıkama tampon bir 150 mikrolitre ekleyin. Pipet, boncukları tamamen yeniden askıya almak ve kapakları iki dakika boyunca kapatılan numuneleri 30 saniye girdap arasında dönüşümlü olarak ve 30 saniye dinlendirerek 10 ila 20 kez yıkayın. Kuluçka sonunda, kısa bir süre santrifüj ve manyetik raf tüpleri yerleştirin ve boncuklar tamamen mıknatıs yapışmış bir kez supernatant çıkarın.Tüpleri kapaklar kapalı kısa bir süre için santrifüj edin ve örnekleri manyetik rafa geri döndürün. Herhangi bir artık yıkama tampon kaldırmak ve oda sıcaklığında yıkama tampon iki 150 mikrolitre eklemek için 10 mikrolitre pipet kullanın. Pipet, boncukları tamamen yeniden askıya almak ve kapakları iki dakika boyunca kapamak ve 30 saniye boyunca girdap arasında dönüşümlü olarak numuneleri kuluçkaya yatırmak için 10 ila 20 kez yıkayın.Kısa bir santrifüjden sonra, her tüpteki boncuk ların tüm hacmini temiz nükleaz içermeyen PCR tüplere aktarın ve tüpleri manyetik rafa yerleştirin. Süpernatants içeren sınırsız DNA attıktan sonra, kısaca örnekleri tekrar santrifüj ve manyetik raf içinde iken boncuk herhangi bir artık yıkama tampon kaldırmak için 10 mikrolitrelik pipet kullanın. Boncukları tamamen yeniden askıya almak için tüplere ve pipetlere 150 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve 10-20 kez pipet ekleyin.Kısa bir süre santrifüj etmeden önce tüpü 30 saniye lik nazik girdap ile 30 saniye arasında değişen iki dakika kuluçkaya yatırın. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve boncuk örneklerini kısaca santrifüj edin. Onlar raftüpleri çıkarmadan önce manyetik raf ve tüp başına çekirdeksiz su 20 mikrolitre boncuk resuuse önce boncuk herhangi bir artık yıkama tampon kaldırmak için 10 mikrolitrelik pipet kullanın.Daha sonra boruların yan tarafına yapışmış boncukların askıya alınmasından emin olmak için boncukları 10 kez alın. Ek temizleme gerekip gerekolmadığını belirlemek için bağdaştırıcı dimers varlığı değerlendirilmelidir. Örneğin, bu elektroperogram adaptör dimer kabul edilemez bir düzeyde gösterirken, bu elektroferogram 128 baz çifti etrafında keskin bir tepe olarak görünür adaptör dimer kabul edilebilir bir düzeyde gösterir.Tedavi öncesi ve sonrası immün profiller, belirli bir tedavinin tümör mikroortamı üzerindeki etkilerini anlamak için kullanılabilir, çünkü bu temsili analizde ilgi çeken her bir bağışıklık hücresi için yüzde değişimleri ve toplam immün içerik tek bir hasta için kemoterapi öncesi ve sonrası gösterilmiştir. Bu analizde hasta grupları arasındaki örnekler tedavi sonrası hastalık progresyonu ile zamanlarına göre karşılaştırıldı. Hastaların bir alt kümesi 18 ay sonra hastalık nüks gösterdi, başka bir alt küme 18 veya daha az ay içinde daha hızlı ilerledi.Ortanca delta değeri daha sonra hastalığın ilerlemesi putatif biyobelirteçleri tanımlamak için her örnek için karşılaştırılabilir. Örneğin, burada iki immün kaçış geni örnek gruplandırmaların istatistiksel olarak anlamlı ayırıcıları olarak tanımlanmıştı. Bireysel gen biyobelirteçleri net istatistiksel anlamlılıkla sağlam olduğundan, çok boyutlu biyomarker önemli bir tahmin değeri eklemedi.Isıtılan yıkıntıları numune soğutmasını önlemek için bir seferde bir şerit ten teşkezlediğinden emin olun ve hedef dışı kontaminasyonu önlemek için boncukları taze tüplere aktarmayı unutmayın. Bu protokol, gen ekspresyonu modellerinin bağışıklık hücreleri ve tümör dokusunu ölçmek için kullanıldığını göstermektedir. Yeni modeller tükenme veya aktivasyon gibi hücre durumlarını ölçmek için geliştirilmektedir.

predictive-immune-modeling-of-solid-tumors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bağışıklık yetkili sıçanların plevra boşluğuna II-45 mezotelyoma hücrelerin nakledilmesi ile plevra malign mezotelyoma ortotopik sıçan modelinin üretimi sunulmuştur. Bir akış sitometrik yöntemi de tanımlanan bir 25 ul kan örneğinden, bu hayvanlarda, yedi immün hücre alt analiz etmek.

II-45 singenik Rat Mezotelyoma Modelinde Ortotopik Yerleştirilmesi ve Periferik Bağışıklık Hücre İzleme

Tümör microenvironment eğitim klinik yanıt immünoterapi prognostik veya akýllý biyolojik tespit edebilir. Burada sunulan, bir yöntem situ Floresans spektral analiz ve CD8 otomatik olarak çeşitli altgrupları saymak için görüntüleme üzerinde dayanır+ T hücreleri. Bu tekrarlanabilir ve güvenilir teknik büyük kohort analizi için uygundur.

Multiplexed ayirt analizi ve Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8 miktar+ T hücreleri

Fare orthotopic PDAC homografts immunophenotyping deneysel ameliyat tümör IMMUNO-microenvironment profil oluşturma amaçlamaktadır. Tümör ameliyat ile implante orthotopically vardır. Tümör boyutu 200-600 mm3 hasat ve tek hücreli süspansiyonlar, çok bağışıklık marker FACS analizi farklı fluorescently etiketli antikorlar tarafından takip hazırlamak için ayrışmış.

Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

Burada ayırmak ve kurulan subkutan tümörler tümör bağışıklık ve non-immün microenvironment bileşenlerinin zenginleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik tümör bağışıklık sızmak ve tümör bağışıklık microenvironment kapsamlı karakterizasyonu izin verebilir non-immün tümör kesirler ayrı analiz için sağlar.

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme çağında, kanser biyolojisi, tümör-bağışıklık arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için yeni in vitro ve hesaplama araçları gerektirir. Hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik izlenmesi ile uyumlu, 2D ve 3D ortamlarda tümör-immün mikroakışkan ko-kültürlerden yararlanmak için protokolleri açıklıyoruz.

İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Burada, bir fare tümörü modelinde tümöre özgü ve periferi kaynaklı tümör kaynaklı lenfositlerin karakterizasyonu için bir tümör transplantasyon protokolü sunulmaktadır. Alıcı kaynaklı immün hücrelerin akışının akım sitometrisi ile spesifik olarak izlenmesi, antitümör immün yanıtlar sırasında bu hücrelerin fenotipik ve fonksiyonel değişikliklerinin dinamiklerini ortaya koymaktadır.

Farelerde Tümör Sızan CD8 + T Hücrelerinin Dinamiğini Değerlendirmek için Tümör Transplantasyonu

Protokol, Flt3L eksprese eden B16-F10 melanomu ile hücre bazlı tümör aşılamasını kullanan bir kanser immünoterapi modeli sunmaktadır. Bu protokol, kültürlenmiş tümör hücrelerinin hazırlanması, tümör implantasyonu, hücre ışınlaması, tümör büyümesinin ölçülmesi, intratümöral immün hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi analizi dahil olmak üzere prosedürleri göstermektedir.

Hematopoetik Sitokin ile Tümör Aşılaması Kullanılarak Deneysel Melanom İmmünoterapi Modeli

Bu protokol, immüno-onkoloji çalışmaları için insan bağışıklık sistemi (HIS) farelerinin neslini özetlemektedir. Bu modelde implante edilen insan tümörleri üzerinde insan immünoterapötiklerini test etmek için bu modelin kullanımındaki talimatlar ve hususlar, insan bağışıklık sisteminin tümöre tepkisini karakterize etmeye vurgu yapılarak sunulmuştur.

İnsan Tümörleri Taşıyan İnsanlaştırılmış Bir Fare Modelinde Kanser İmmünoterapötiklerinin Test Edilmesi

Bu protokol, multipleks immünohistokimya kullanılarak tümör mikroçevresinin immün hücre karakterizasyonunun nasıl yapıldığını ayrıntılı olarak açıklar.

Tümör Mikroçevresinin Mekansal İmmün Hücre Manzarasının Multipleks İmmünohistokimyasal Analizi

Burada, antitümör antikorların önemli bir kanser hücresi öldürme mekanizması olan ADCC mekanizmasını modüle eden bileşikleri tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. NK hücrelerinin sitotoksik etkisi, Trastuzumab varlığında meme kanseri hücre sferoidlerinde ölçülür. Görüntü analizi, sferoidlerdeki canlı ve ölü öldürücü ve hedef hücreleri tanımlar.

Bir Tümör Sferoid Modelinde Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisitenin Ölçülmesi: İlaç Keşfi Uygulaması

Öğrenin, RNA tabanlı immün profilleme yöntemiyle solid tümörlerdeki bağışıklık hücrelerini hassas şekilde ölçün. Bu protokol, immün-onkolojide biyobelirteç keşfi ve tedavi yanıtlarını anlamak için çok boyutlu bir yaklaşım sunar.

Solid Tümörlerin Prediktif İmmün Modellemesi

Daha fazla video keşfet