Name: Koşullu Stat3 Silme Fare Modelinin İskelet Fenotip Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Keşfedin, Stat3 geni silinmiş fare modellerinde iskelet fenotip analizi yöntemlerini. Osteoklast farklılaşması ve kemik kütlesi düzenlenmesi üzerine etkileri mikro CT ve TRAP boyama ile değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prof. Weiguo Zou ve S. Kato'ya reaktifler ve fareler için ve Zou laboratuvarı üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Ayrıca Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Kraniyofasiyal Anomaliler Için Dijitalleştirilmiş Stomatoloji ve Araştırma Merkezi Laboratuvarı'na yardım için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (NSFC) hibeleriyle desteklendi [81570950,81870740,81800949], Şanghay Zirvesi & Plato Disiplinleri, Şanghay Hassas Tıp Enstitüsü'nden SHIPM-mu fonu, Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi [JC201809], Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi için Üst Düzey İnovasyon Ekibinin Teşvik Projesi , Shanghai JiaoTong üniversitesi Tıp Fakültesi Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Disiplinler Arası Araştırma Fonu [JYJC201902]. Ve L.J. Üstün Gençlik Tıbbi Yetenekleri, Şanghay "Tıbbi Yeteneğin Yükselen Yıldızları" Gençlik Geliştirme Programı ve Şanghay Jiaotong Üniversitesi'nden "Chen Xing" projesinin bir bilginidir.

Burada açıklanan hayvanlarla ilgili tüm yöntemler Şanghay Jiaotong Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. Osteoklast spesifik Stat3 silme farelerinin yetiştirilmesi
NOT: Stat3fl/fl fareler ticari olarak elde edilmiştir. Ctsk-Cre fareleri S. Kato tarafından sağlanmıştır (Tokyo Üniversitesi, Tokyo, Japonya12). Fareler, standart koşullarda kurumsal hayvan tesisinde belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında yetiştirildi ve bakımı yapıldı.
<ol><li>Cinsel olarak olgun bir erkek fareyi aynı yaştaki iki dişi fareyle eşleştirin. 18 gün sonra, yenidoğan için günlük kontrolleri kontrol edin. Hamile dişi fareleri ayırın ve gerekirse yalnız tutun. Dişi fareler eşleştirmeden sonraki 1 ay içinde hamile değilse, erkek fareleri farklı üreme kafesleri arasında değiştirin.</li>
	<li>Stat3fl/fl farelerini Ctsk-Cre farelerine (F0) çapraz. Genotipleme için kuyrukları kırpın ve erkek Stat3fl /+; Ctsk-Cre fareleri, yaklaşık 6 haftalık (F1) olan cinsel olarak olgunlaşana kadar. Aşağıdaki astarları kullanın: Stat3 F-TTGACCTGTCTCCTACAAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTCTTC.</li>
	<li>Çapraz 6 haftalık erkek Stat3fl/+; Dişi Stat3fl / fl fareleri ile Ctsk-Cre fareleri. Genotipleme için kuyrukları kırpın ve erkek Stat3 fl / fl'itutun; Ctsk-Cre fareleri, yaklaşık 6 haftalık (F2) olan cinsel olarak olgunlaşana kadar.</li>
	<li>Çapraz 6 haftalık erkek Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre fareler ile dişi Stat3fl/fl fareler (F3). Genotipleme için kuyrukları kırpın ve eski üreme farelerini zamanla daha genç farelerle değiştirin (F3 + N).</li>
</ol>2. Numune toplama
<ol><li>Altı çift 8 haftalık erkek Stat3fl/fl ve Stat3Ctsk çöp eş farelerini karbondioksit boğulması ile ayrı ayrı ötenazi edin. NOT: CO2 akış hızı, kafes hacminin dakikada %30'unu yerinden eder (örneğin, 45 cm x 30 cm x 30 cm kafes için CO2 akış hızı 40 L/dk'dır).</li>
	<li>Fareleri bir destek pozisyonuna yerleştirin. bilateral kalça eklemlerini elle hafifçe yerinden sökün. Cildi distal kaval kemiğinden dikey olarak kesmek için oftalmik makas kullanın ve ardından tüm cildi arka uzuvdan parçalara bölün.</li>
	<li>Arka uzvu ayırmak için sağ kalça ekleminin ve diz ekleminin eklem bağını makasla kesin. Trokanteri ve fibulanın birleştiği yerde kesin ve arka uzvu% 4 paraformaldehit içine daldırın. 3. adım için sağ arka uzuvları saklayın. Kemik iliğini% 4 paraformaldehit ile tamamen daldırmak ve düzeltmek için kemiği her iki ucundan uygun şekilde kesin.</li>
	<li>Sol kalça ekleminin ve diz ekleminin eklem bağını makasla kesin, yumuşak dokuyu hafifçe çıkarın ve kaval kemiğini ve uyluk kemiğini dikkatlice ayırın. Kaval kemiğini ve uyluk kemiğini ayrı ayrı% 75 etanol içine daldır. 4. adım için femora ve adım 6 için kaval kemiği tutun. Trochanter'ı sağlam tuttuğunuzdan emin olun.</li>
</ol>3. Parafin bölümü hazırlığı
<ol><li>Sağ arka uzvu 48 saat boyunca 4 °C'de % 4 paraformaldehitte sabitle.</li>
	<li>Kireçten arındır: Numuneleri 1x PBS ile 10 dakika 3 kez hafifçe yıkayın. Kemikleri bükülene kadar 3 ila 4 hafta boyunca bir ultrasonik kireç çözücü ile örnekleri% 15 EDTA'da (800 mL'de 800 mL ddH2O ve 10x PBS'de 100 mL) kireçten arındırın. Her gün taze kireç çözen sıvı ile değiştirin.</li>
	<li>Numuneleri 1x PBS ile 3x hafifçe yıkayın ve ardından bir gecede 4 °C'de% 75 etanol içine daldırın.</li>
	<li>Susuzluk: İkinci gün, örnekleri her biri iki kez 1 saat boyunca% 95 etanol,% 100 etanol ve ksilen içine sırayla daldırma.</li>
	<li>Örnekleri 30 dakika boyunca 1/2 ksilen 1/2 parafin içine daldırın. Numuneleri gece boyunca 65 °C'de parafin içine daldırın.</li>
	<li>Gömme: Gömme için uygun bir gömme tankı seçin. Kaval kemiğini düzgün bir şekilde altına yerleştirin. Uyluk kemiğini ve kaval kemiğini 90° açıyla yerleştirin. Parafin tamamen soğuduktan ve katılaştıktan sonra gömme tankından çıkarın. Örnekleri numaralayın ve gece boyunca -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Mikrotom kullanarak sürekli olarak 5 μm kalınlığında bölümleri kesin. 20-40 bölüm kesin. Bölümleri 37 °C suya yayın, mikroskop slaytlarına yapıştırın ve gece boyunca 42 °C'de pişirin.</li>
</ol>4. Mikro BT tarama ve analizi
<ol><li>Mikro-CT tarayıcı ile sol femorayı tarayın. Çözünürlük: 10 μm; Gerilim: 70 kV; Akım: 114 μA; Fliter: 0,5 mm Al; Dönme adımı: 0,5°.</li>
	<li>Üreticinin talimatını takiben tarayıcının destekleyici yazılımını kullanarak kortikal kemik ve trabeküler kemiğin 3B görüntülerini yeniden yapılandırın. ROI'ler distal büyüme plakasına yakın toplam 1 mm genişlikte trabeküler kemikte ve femoranın ortasında kortikal kemiğin toplam 1 mm genişliğinde bir bölümündedir.</li>
	<li>Nicel mikro mimarisi parametrelerini hesaplayın: kemik mineral yoğunluğu (BMD), kemik hacmi fraksiyonu (BV/TV), trabeküler kalınlık (Tb.Th.), trabeküler sayı (Tb.N.), trabeküler ayırma (Tb.Sp.) ve kortikal kemik kalınlığı (Ct.Th.).</li>
</ol>5. TUZAK boyama
<ol><li>Parafin bölümlerini 65 °C'de 30 dakika pişirin.</li>
	<li>Dewax: Bölümleri 10 dakika boyunca ksilen içine daldırın. Bu adımı taze ksilen ile 3x gerçekleştirin.</li>
	<li>Rehidrat: Bölümleri sırayla% 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol ve ddH2O'ya daldırın, her biri iki kez 5 dakika boyunca.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına uyarak TRAP boyama kitini kullanarak boyama sokumini hazırlayın ve 37 °C'ye ısıtın. NOT: TRAP boyama sosu her test öncesinde hemen yeni hazırlanmalıdır.</li>
	<li>Her numuneye 50-100 μL boyama çözeltisi ekleyin ve 37 °C nemli bir odada 20-30 dakika kuluçkaya yatırın. Kırmızı çok fonksiyonlu osteoklastlar görülene kadar her 5 dakikada bir ışık mikroskobu altında osteoklastların boyama durumunu kontrol edin. Reaksiyona ddH2O ile son verin.</li>
	<li>30 s için hematoksilin çözeltisinde karşıtlık. 1 dakika boyunca% 1 amonyak çözeltisinde daldırarak kararlı bir mavi renk oluşturun. Yavaşça akan musluk suyunda durulayın.</li>
	<li>Bölümleri nötr balsam kullanarak kapaklarla monte edin ve gece boyunca kurutun.</li>
	<li>3-5 ilgi alanını mikroskopla yakalayın. Trabeküler çevreyi Resim J ile analiz edin: ' düzçizgi' aracını L1 olarak kullanarak ölçek çubuğunun (Ls) uzunluğunu ölçün, ardından 'parçalı çizgi' aracını L2, fiziksel uzunluk (Lp)= Ls * L2 / L1 olarak kullanarak trabeküler çevrenin uzunluğunu ölçün. Trap pozitif hücrelerin sayısını üçten fazla çekirdekle sayın.</li>
</ol>6. Calcein ve alizarin kırmızı çift etiketleme
<ol><li>Numune hazırlama: Intraperitoneally enjekte 20 mg/kg kalsein (1 mg/mL % 2 NaHCO3 çözeltisi içinde) gün 0, ve 25 mg/kg alizarin kırmızı S (AL, H 2 O'da2mg/mL) 4. 7. günde fareleri kurban edin. Kaval kemiğini dikkatlice ayırın ve 48 saat boyunca 4 °C'de% 4 paraformaldehitte sabitleyin.</li>
	<li>Dehidrat: Sabitlemeden sonra kaval kemiğini 3x'i 1x PBS ile hafifçe yıkayın. Numuneleri sırayla% 95 etanol,% 100 etanol ve ksilen için 5 dakika boyunca ayrı ayrı daldırın.</li>
	<li>Numuneleri 12 saat aseton, 2 saat boyunca 1/2 aseton 1/2 reçine ve bir gecede kurutma fırınında saf reçineye daldırin. NOT: Reçine, üreticinin talimatlarına göre piyasada bulunan reçine (örneğin, Embed 812 Reçine) tarafından hazırlanmıştır.</li>
	<li>Gömme: Uygun bir silika jel gömme tankına saf reçine ekleyin ve kabarcıkları önlemek için numuneleri hafifçe yerleştirin. Reçineyi 60 °C'de 48 saat boyunca kurutma fırınında polimerize edin.</li>
	<li>Numuneleri döner mikrotom ile sürekli olarak 5 μm kalınlığında bölümlere kesin. Numunelerin geri kalanını oda sıcaklığında kurutucu ile saklayın.</li>
	<li>Bölümleri% 75 alkol damlasına cımbızla yapıştırın. Bölümleri nötr balsam kullanarak kapaklarla monte edin. Floresan mikroskop ile kırmızı ve yeşil floresan etiketlemeyi yakalayın.</li>
	<li>İki etiketleme çizgisi (Ir.L.Wi), tek etiketli trabeküler çevre (sL.Pm), çift etiketli trabeküler çevre (dL.Pm) ve toplam trabeküler çevre (Tb.Pm) arasındaki genişliği ölçün. Mineral appozisyon oranını (MAR) ve kemik oluşum oranını (BFR/BS) hesaplayın. MAR = Ir.L.Wi/interval days. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*%100.</li>
</ol>

<ol><li>Zaidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+remodeling+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Skeletal remodeling in health and disease.</a> Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Cummings, S. R., Melton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+outcomes+of+osteoporotic+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures.</a> Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).</li>
<li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Practice.+Postmenopausal+Osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis.</a> New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).</li>
<li>Kos, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre%2FloxP+system+for+generating+tissue-specific+knockout+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+reviews%22%5BJournal%5D)">Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models.</a> Nutrition reviews. 62 (6), Pt 1 243-246 (2004).</li>
<li>Elefteriou, F., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+for+bone+studies-Strengths+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations.</a> Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).</li>
<li>Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+STAT3+in+mediating+the+cell+growth%2C+differentiation+and+survival+signals+relayed+through+the+IL-6+family+of+cytokine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors.</a> Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).</li>
<li>Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+STAT3+signalling+in+cancer%3A+new+and+unexpected+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).</li>
<li>Itoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+interleukin-6+family-mediated+Stat3+activation+in+osteoblast+differentiation+and+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation.</a> Bone. 39 (3), 505-512 (2006).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast%2Fosteocyte-specific+inactivation+of+Stat3+decreases+load-driven+bone+formation+and+accumulates+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species.</a> Bone. 49 (3), 404-411 (2011).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+controls+osteoclast+differentiation+and+bone+homeostasis+by+regulating+NFATc1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130 (5), 811-823 (2007).</li>
<li>Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Cre-LoxP+system%3A+general+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animal+research%22%5BJournal%5D)">Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).</li>
<li>Minkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+acid+phosphatase%3A+tartrate-resistant+acid+phosphatase+as+a+marker+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function.</a> Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).</li>
<li>Vaaraniemi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+machinery+for+matrix+degradation+in+bone-resorbing+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).</li>
<li>Ljusberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+excision+of+a+repressive+loop+domain+in+tartrate-resistant+acid+phosphatase+by+cathepsin+K+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).</li>
<li>Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naphthol-ASBI+phosphate+as+a+preferred+substrate+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).</li>
<li>Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochemistry+of+tartrate-resistant+acid+phosphatase.+Technical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations.</a> American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).</li>
<li>Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+immunoassay+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b+using+the+fluorogenic+substrate+naphthol+ASBI-phosphate+and+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%3A+International+Journal+of+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).</li>
<li>Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoalkaline+phosphatase+cytochemistry.+Technical+considerations+of+endogenous+phosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity.</a> American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).</li>
<li>Solberg, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tartrate-resistant+Acid+phosphatase+expression+in+osteoblasts+and+osteocytes+in+experimental+osteoporosis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats.</a> Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).</li>
<li>Tambutté, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein+labelling+and+electrophysiology%3A+insights+on+coral+tissue+permeability+and+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification.</a> Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lkb1+deletion+in+periosteal+mesenchymal+progenitors+induces+osteogenic+tumors+through+mTORC1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR%2FRaptor+signaling+is+critical+for+skeletogenesis+in+mice+through+the+regulation+of+Runx2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+LSD1+regulates+bone+mass+by+controlling+WNT7B+and+BMP2+signaling+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts.</a> Bone Research. 6, 14(2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Genetik olarak tasarlanmış fare modelleri genellikle insan hastalığının mekanizmasını ve farmasötik tedavisini incelemek için kullanılır13. Ctsk-Cre fareler osteoklastların fonksiyonel çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır6. Bu çalışmada iskelet fenotipini analiz etmek ve in vivo osteoklast aktivitesini kontrol eden kritik genleri incelemek için yöntemlerin protokolleri açıklanmıştır.
Histolojik analiz kemik metabolizmasını tes...

İskelet kemiği insan vücudunun ana yük taşıyan organıdır ve yürüyüş ve egzersiz sırasında hem iç hem de dış ortamdan baskı altındadır1. Kişinin yaşamı boyunca, kemikler sürekli olarak osteoblastlar ve osteoklastlar tarafından dengelenen kendini yenilemeden geçer. Osteoklastların eski kemikleri temizleme ve osteoblastların yeni kemik oluşturma süreci, iskelet sisteminin homeostazını ve mekanik işlevini korur2. Dengedeki bozukluk osteoporoz gibi kemik metabolik hastalıklarına neden olabilir. Aşırı osteoklastik aktivitenin neden olduğu osteoporoz, küresel olarak yaygındır ve topluma önemli ekonomik kayıplara neden olur2,3,4. Osteoporoz tedavisi için mevcut sınırlı sayıda ilada ve yan etki risklerine göre4, osteoklast oluşumu ve aktivitesinin ayrıntılarını ortaya çıkarmak önemlidir.
Monosit/makrofaj hematopoetik soyundan elde edilen osteoklastlar birden fazla çekirdeğe sahiptir (2 ila 50 çekirdek olabilir) ve büyüktür (genellikle çapı 100 μm'den büyüktür)2. Mekanizmaların keşfi ve ilaçların osteoklastik bozukluklar için taranma in vitro osteoklast kültürü ile yaygın olarak geliştirilmiş olmasına rağmen, karmaşık organik reaksiyonlar in vivo kanıtları hedeflenen tedavi için vazgeçilmez kılmaktadır. Fareler ve insanlar arasındaki genetik ve patofizyolojik benzerlikler nedeniyle, genetik olarak tasarlanmış fare modelleri, insan hastalığının mekanizmalarını ve farmasötik tedavilerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır in vivo6. Cre-loxP sistemi fare gen düzenlemesi için yaygın olarak kullanılan bir teknolojidir ve araştırmacıların gen fonksiyonlarını doku/hücreye özgü bir şekilde araştırmalarını sağlamıştır5. Cathepsin K (CSTK), kemik kollajen8'ibozabilen osteoklastlar tarafından salgılanan sistein proteazdır. CTSK'nın olgun osteoklastlarda seçici olarak ifade edildiği iyi kabul edilmektedir; Bu nedenle, Ctsk-Cre fareleri osteoklastların fonksiyonel çalışmaları için yararlı bir araç olarak kabul edilir ve6.
Transkripsiyon (STAT) ailesinin sinyal dönüştürücüsü ve aktivatörü klasiktir ve bağışıklık ve kanser ilerlemesi ve gelişiminde oldukça önemlidir7,8. Yedi STAT arasında, STAT3'ün kemik homeostazı9,10ile en alakalı olduğu bildirilmektedir. Çeşitli in vivo çalışmalar, OSTEOBLASTLARDA STAT3'ün spesifik inaktivasyonunun kemik oluşumunu azalttığını bildirmektedir9,10. Bununla birlikte, STAT3'ün osteoklast oluşumuna ve kemik metabolizmasına in vivo katılımına ilişkin sağlam kanıtlar hala sınırlıdır. Son zamanlarda, osteoklast spesifik Stat3 silme fare modeli (Stat3fl / fl; Ctsk-Cre, bundan sonra Stat3Ctskolarak adlandırılır) STAT3 osteoklast farklılaşmasına ve kemik metabolizması11'e katılır. Bu çalışmada, osteoklast spesifik STAT3 delesyonunun kemik homeostazı üzerindeki etkisini incelemek için Stat3Ctsk farelerinin kemik kütlesi, kemik histoporfolojisi ve kemik anabolizması ve katabolizmasındaki değişiklikleri analiz etmek için kullandığımız yöntem ve protokolleri açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>% 4 Paraformaldehit çözeltisi</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E672002</tr><tr><td>Aseton Şangay</td><td>Deneysel Reaktif Co., Ltd.</td><td></td><td></td>80000360</tr><tr><td>Alizarin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Amonyak çözeltisi</td><td>Şangay Deneysel Reaktif Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Ctsk-Cre fareler</td><td></td><td></td><td>, S. Kato, Tokyo Üniversitesi, Tokyo, Japonya'dan bir hediye</td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>DeCa Hızlı Kireç</td><td>Çözücü Pro-Cure</td><td>DX1100</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30 Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Şangay Deneysel Reaktif Co., Ltd.</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 REÇİNE Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>floresan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen çözeltisi</td><td>Beyotime Biotechanology</td><td>C0107</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-CT</td><td>Scanco Medical AG</td> <td>& mu; CT 80</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Şangay Deneysel Reaktif Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10018918</tr><tr><td>Nötr balsam</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E675007</tr><tr><td>NMA</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>Parafin</td><td>Sangon biyoteknoloji Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A601889</tr><tr><td>döner mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Stat3fl/fl fareler</td><td>GemPharmatech Co., Ltd</td><td>D000527</td><td></td></tr><tr><td>TRAP boyama kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>ksilen</td><td>Şangay Deneysel Reaktif Co., Ltd.</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

koşullu stat3 silme fare modelinin İskelet fenotip analizi

Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

Transgenik fare modelleri, osteoklast farklılaşmasını ve aktivitesini kontrol eden kritik genleri anlamak ve osteoporozun mekanizmalarını ve farmasötik tedavilerini incelemek için güçlüdür. Cathepsin K (Ctsk)-Cre fareleri osteoklastların fonksiyonel çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Transkripsiyon 3'ün (STAT3) sinyal dönüştürücüsü ve aktivatörü kemik homeostazında geçerlidir, ancak in vivo osteoklastlardaki rolü zayıf tanımlanmıştır. STAT3'ün osteoklast farklılaşmasına ve kemik metabolizmasına katıldığına dair in vivo kanıtları sağlamak için osteoklast spesifik bir Stat3 silme fare modeli(Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) ve iskelet fenotipini analiz etti. Mikro-CT tarama ve 3D rekonstrüksiyon, koşullu nakavt farelerinde kemik kütlesinin arttığını ima etti. Kemik metabolizmasını tespit etmek için H&E lekelenmesi, kalsesin ve alizarin kırmızı çift boyama ve tarta dayanıklı asit fosfataz (TRAP) lekeleme yapıldı. Kısacası, bu protokol iskelet fenotipini analiz etmek ve in vivo osteoklast aktivitesini kontrol eden kritik genleri incelemek için bazı kurallı yöntem ve teknikleri açıklar.

Mevcut protokol kullanılarak, STAT3 silmenin osteoklast farklılaşması üzerindeki etkisini incelemek için osteoklast spesifik Stat3 silme fareleri üretildi. Stat3Ctsk fareleri ve wildtype (WT) çöp arkadaşları genotiplemeden sonra yetiştirildi ve tutuldu. Kemik iliği makrofajları izole edildi ve osteoklastlar halinde kültürlendi ve Stat3Ctsk farelerinde STAT3delesyonu gösterildi (Şekil 1).
Femora rek...

Bu protokol, in vivo osteoklast aktivitesini kontrol eden kritik genleri anlamak için kurallı bir yöntemi açıklar. Bu yöntem, iskelet fenotipini analiz etmek için transgenik bir fare modeli ve bazı kurallı teknikler kullanır.

Koşullu Stat3 Silme Fare Modelinin İskelet Fenotip Analizi

Transgenic mouse models are powerful for understanding the critical genes controlling osteoclast differentiation and activity, and for studying mechanisms ...

Genetik olarak tasarlanmış fare modelleri, insan hastalıklarının mekanizmalarını in vivo olarak incelemek için güçlü araçlardır. Farelerin iskelet fenotipini analiz etmek, iskelet araştırmasının temelidir. Bu parçacık, iskelet fenotipini analiz etmek için iskelet dokusu araştırmalarına yeni başlayanlar için ilginç olabilecek bazı tipik teknikleri açıklar.Bu parçacığı denerken, hayvan deneylerinin zaman aldığını unutmayın, bu nedenle kısa vadede ihtiyacınız olmasa bile, her deney sırasında mümkün olduğunca çok sayıda yüksek kaliteli örnek toplayın. Ötenazi yapılmış bir fareyi sırtüstü pozisyona getirerek ve iki taraflı kalça eklemlerini elle nazikçe yerinden çıkararak başlayın. Distal tibiadan cildi dikey olarak kesmek için oftalmik makas kullanın ve ardından arka bacaktaki tüm cildi çıkarın.Arka ayağı ayırmak için sağ kalça eklemi ve diz ekleminin eklem bağını makasla kesin. Ardından, kemiği %4 PFA'ya tamamen daldırmak için kemiği her iki ucundan kesin. Trokanteri ve fibulanın birleşme noktasını kesin.Parafin kesiti için sağ arka uzuvu tutarak arka uzuvu %4 PFA'ya daldırın. Sol kalça ve diz eklemlerinin eklem bağlarını makasla kesin ve yumuşak dokuyu nazikçe çıkarın. Tibia ve uyluk kemiğini ayırın ve ayrı ayrı% 75 etanole batırın.Mikro BT taraması için femorayı ve kalsein ve alizarin kırmızı çift etiketleme için tibiaları saklayın. Parafin bölümlerini hazırlamak için, sabit sağ arka bacak PBS ile yıkama başına 10 dakika boyunca üç kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, kemikler bükülene kadar üç ila dört hafta boyunca ultrasonik bir kireç çözücü ile% 15 EDTA'da kireçten arındırın ve kireç çözücü sıvıyı her gün değiştirin.Dekalsifikasyondan sonra, numuneleri PBS ile üç kez yıkayın ve gece boyunca dört santigrat derecede% 75 etanole batırın. İkinci gün, numuneleri sırayla %95 etanol, %100 etanol ve ksilene birer saat daldırın. Örnekleri 30 dakika boyunca yarım ksilen ve yarım parafine batırın, ardından gece boyunca 65 santigrat derecede parafine batırın.Numuneyi gömmek için, uyluk kemiği ve kaval kemiğini 90 derecelik bir açıyla yerleştirerek parafine batırın. Parafin tamamen soğuduğunda, numuneleri gömme tankından çıkarın. Bunları numaralandırın ve gece boyunca eksi 20 santigrat derecede saklayın.Parafin bölümlerini 65 derecede 30 dakika pişirin, ardından 10 dakika ksilene batırarak cilalayın. Bölümleri her seferinde üç kez taze ksilen ile daldırın. Bölümleri sırayla %100 etanol, %95 etanol, %70 etanol ve damıtılmış suya her biri beş dakika daldırarak yeniden sulandırın.TRAP boyama kitini kullanarak boyama solüsyonunu hazırlayın ve 37 santigrat dereceye ısıtın. Her bölüme 50 ila 100 mikrolitre boyama solüsyonu ekleyin ve bunları 37 santigrat derece nemli bir odada 20 ila 30 dakika inkübe edin. Kırmızı çok çekirdekli osteoklastlar görülene kadar osteoklastların lekelenme durumunu her beş dakikada bir ışık mikroskobu altında kontrol edin.Ardından reaksiyonu su ile sonlandırın. Bölümleri hematoksilen çözeltisinde 30 saniye boyunca lekeleyin ve bir dakika boyunca% 1 amonyak çözeltisine batırarak sabit bir mavi renk oluşturun. Ardından yavaşça akan musluk suyunda durulayın.Bölümleri nötr balzamlı lamel lamlar kullanarak monte edin ve gece boyunca kurutun. Mikroskopla üç ila beş görüş alanı yakalayın ve trabeküler çevreyi görüntü J ile analiz edin. Ölçek çubuğunun uzunluğunu L1 olarak ölçmek için düz çizgi aracını kullanın. Ardından, trabeküler çevrenin uzunluğunu L2 olarak ölçmek için segmentli çizgi aracını kullanın. Fiziksel uzunluğu hesaplayın ve üçten fazla çekirdeğe sahip TRAP pozitif hücrelerin sayısını sayın. Fiksasyondan sonra, tibiaları PBS ile üç kez nazikçe yıkayın ve numuneleri sırayla beşer dakika boyunca% 95 etanol,% 100 etanol ve ksilen içine batırın.Numuneleri 12 saat asetona ve iki saat boyunca yarım aseton ve yarım reçineye ve gece boyunca bir kurutma fırınında saf reçineye batırın. Uygun bir silika jel gömme tankına saf reçine ekleyin ve numuneleri kabarcıklardan kaçınarak tanka yerleştirin. Reçineyi 48 saat boyunca 60 santigrat derecede bir kurutma fırınında polimerize edin.Numuneleri döner bir mikrotom ile sürekli olarak beş mikrometre kalınlığında bölümler halinde kesin ve numunelerin geri kalanını kurutucu ile oda sıcaklığında saklayın. Bölümleri cımbızla% 75 etanol damlasıyla yapıştırın ve nötr balsam kullanarak lamel ile monte edin. Bir floresan mikroskobu ile kırmızı ve yeşil floresan etiketlemesini yakalayın.Stat3 delesyonunun osteoklast farklılaşması üzerindeki etkisini incelemek için osteoklastlara özgü Stat3 delesyon fareleri üretildi. Femoral rekonstrüksiyon ve mikro BT ile yapılan kantitatif analiz, Stat3 Ctsk farelerinin kemik kütlesinin vahşi tip farelere kıyasla arttığını gösterdi. Yabani tip ve Stat3 Ctsk farelerinden elde edilen femora'nın histo morfolojisi H ve E boyama ile incelendi.Orestistojenik aktivite TRAP boyaması kullanılarak tespit edildi. Osteoklastlar, birden fazla çekirdeğe sahip büyük TRAP pozitif hücrelerdir. TRAP pozitif osteoklastların sayısı, Stat3 Ctsk farelerinde, vahşi tip farelere kıyasla daha düşüktü, bu da Stat3 eksikliğinin osteoklast oluşumunu bozduğunu gösteriyor.Osteogenez kalsein ve alizarin kırmızısı ile ölçüldü. Kalsein ve alizarin kırmızı floresan arasındaki alan yeni oluşan kemiği temsil eder. Osteoklastlarda silinen Stat3, kemik anabolizmasını etkilemedi.Daha sonra kıkırdağın simetrik olduğu ve burada net M şeklinde çizginin kullanıldığını gösteren sagital parafin kesitleri. Çalışmalar için, mekanik özellikler gibi iskelet sisteminin daha fazla özelliğini dahil edeceğiz.

skeletal-phenotype-analysis-conditional-stat3-deletion-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve...

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Açık alan aktivite düzeyleri lokomotif ve davranışsal aktivite düzeylerini değerlendirmek için kullanılır. Bu protokol nöromüsküler bozuklukların klinik öncesi çalışmalarda kullanmak için iyi tasarlanmış, standart bir protokol sağlar.

İskelet Kası Hastalıkları Açık Saha Aktivite İzleme Sisteminin Kullanılması Davranış ve Hareket Ölçümleri

Geliştirici aktivitenin deneysel doğrulamasına en iyi fonksiyon kaybı analizi ile yaklaşılır. Burada, hibrit bir genom (Mus musculus129 x Mus castaneus) içeren F1 ES hücrelerinde gen transkripsiyonunun alele özgü regülasyonunu incelemek için CRISPR/Cas9 aracılı delesyon kullanan etkili bir protokol sunulmaktadır.

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

Proteinler genellikle farklı hücresel fonksiyonları sarf edebilirsiniz birden çok etki içerirler. Gen irtibat kutusu kapağı (KO) bu işlevsel çeşitliliği dikkate almaz. Burada, çeşitli işlevsel etki alanları veya bir proteinin varyantlarının moleküler diseksiyon sağlar KO embriyonik kök hücrelerin bir rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) tabanlı bir yapı-işlev yaklaşım sunulmuştur.

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Zebra balığı içinde öldürücü iskelet mutant fenotipleri alellerle tarafından seçici üreme değiştirmek için bu iletişim kuralını hedefidir. Ölümcül mutantlar yetişkinliğe büyüdü ve kendilerini bred, bu nedenle bu protokolü izleme ve sınama döl tarafından birden fazla nesilden alellerle seçmek için bir yöntem açıklanır.

Zebra balığı öldürücü iskelet Mutant alellerle test döl tarafından değişen

Burada, kraniyofasiyal morphogenesis/patogenezi sırasında protein düzeylerini algılamak ve ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz Buna ek olarak, immünostasyon için genç farelerden undecalcified Sert dokularda hazırlama ve donuk kesit için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kraniyofacial dokularda ve Undecalcified kemik doku hazırlama ve Immünostasyon

Ayak izi analizi farelerde hareket anomalilerini ölçerek araştırmacılar için dijıtleştirilmiş yürüyüş analiz programlarına düşük maliyetli bir alternatiftir. Hız, basitlik ve uzunlamasına potansiyel nedeniyle, fare modellerinin davranışsal fenotiplemeyi için idealdir.

Nöromusküler hastalığın fare modellerinin davranışsal phenotyping için düşük maliyetli yürüyüş analizi

Burada, homozigot mutant Lamin Δ8-11 fare modeli, Emery-Dreifuss kas distrofisi (EDMD) için çok ciddi bir model erken doğum sonrası gelişim aşamalarında verimli bir şekilde tek kas lifleri elde etmek için bir yöntem öneriyoruz.

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Burada, fare embriyolarının üç ve dört boyutlu görüntü verilerinin, toto optik projeksiyon tomografisi ve multifoton mikroskobu kullanılarak canlı görüntüleme ve tam montajlı immünofloresan boyama ile elde edilen eksenel uzama ve segmentasyon bağlamında görselleştirilmesini ve analizini sağlayan hesaplamalı araç ve yöntemleri açıklamaktayız.

Omurgalı Eksenel Uzama ve Segmentasyonunu İncelemek için Üç ve Dört Boyutlu Görselleştirme ve Analiz Yaklaşımları

Bu çalışma, ortodontik kuvvet altında kemiğin yeniden şekillenmesini incelemek için indüklenebilir osteoblast soyuna özgü Stat3 nakavt farelerin kullanılması için bir protokol sağlar ve ortodontik diş hareketi sırasında alveolar kemiğin yeniden şekillenmesini analiz etme yöntemlerini açıklar, böylece iskelet mekanik biyolojisine ışık tutar.

Ortodontik Diş Hareketi Sırasında Alveolar Kemiğin Yeniden Şekillenmesini İncelemek için İndüklenebilir Osteoblastik Soya Özgü Stat3 Nakavt Farelerinin Kullanılması

Burada, farelerde kraniyomaksillofasiyal kemik gelişiminin mevcut yöntemlerle mümkün olandan daha iyi değerlendirilmesi için farelerde kraniyomaksillofasiyal kemiklerin 3D modellerini segmentlere ayırmak ve ölçmek için mikrobilgisayarlı tomografiye dayanan bir yöntemi derinlemesine açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Mikrobilgisayarlı Tomografi Kullanılarak Farelerde Kraniyomaksillofasiyal Malformasyonların Analizi

Keşfedin, Stat3 geni silinmiş fare modellerinde iskelet fenotip analizi yöntemlerini. Osteoklast farklılaşması ve kemik kütlesi düzenlenmesi üzerine etkileri mikro CT ve TRAP boyama ile değerlendirin.

Koşullu Stat3 Silme Fare Modelinin İskelet Fenotip Analizi

Daha fazla video keşfet