Koşullu Stat3 Silme Fare Modelinin İskelet Fenotip Analizi

Genetik olarak tasarlanmış fare modelleri, insan hastalıklarının mekanizmalarını in vivo olarak incelemek için güçlü araçlardır. Farelerin iskelet fenotipini analiz etmek, iskelet araştırmasının temelidir. Bu parçacık, iskelet fenotipini analiz etmek için iskelet dokusu araştırmalarına yeni başlayanlar için ilginç olabilecek bazı tipik teknikleri açıklar.

Bu parçacığı denerken, hayvan deneylerinin zaman aldığını unutmayın, bu nedenle kısa vadede ihtiyacınız olmasa bile, her deney sırasında mümkün olduğunca çok sayıda yüksek kaliteli örnek toplayın. Ötenazi yapılmış bir fareyi sırtüstü pozisyona getirerek ve iki taraflı kalça eklemlerini elle nazikçe yerinden çıkararak başlayın. Distal tibiadan cildi dikey olarak kesmek için oftalmik makas kullanın ve ardından arka bacaktaki tüm cildi çıkarın.

Arka ayağı ayırmak için sağ kalça eklemi ve diz ekleminin eklem bağını makasla kesin. Ardından, kemiği %4 PFA'ya tamamen daldırmak için kemiği her iki ucundan kesin. Trokanteri ve fibulanın birleşme noktasını kesin.

Parafin kesiti için sağ arka uzuvu tutarak arka uzuvu %4 PFA'ya daldırın. Sol kalça ve diz eklemlerinin eklem bağlarını makasla kesin ve yumuşak dokuyu nazikçe çıkarın. Tibia ve uyluk kemiğini ayırın ve ayrı ayrı% 75 etanole batırın.

Mikro BT taraması için femorayı ve kalsein ve alizarin kırmızı çift etiketleme için tibiaları saklayın. Parafin bölümlerini hazırlamak için, sabit sağ arka bacak PBS ile yıkama başına 10 dakika boyunca üç kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, kemikler bükülene kadar üç ila dört hafta boyunca ultrasonik bir kireç çözücü ile% 15 EDTA'da kireçten arındırın ve kireç çözücü sıvıyı her gün değiştirin.

Dekalsifikasyondan sonra, numuneleri PBS ile üç kez yıkayın ve gece boyunca dört santigrat derecede% 75 etanole batırın. İkinci gün, numuneleri sırayla %95 etanol, %100 etanol ve ksilene birer saat daldırın. Örnekleri 30 dakika boyunca yarım ksilen ve yarım parafine batırın, ardından gece boyunca 65 santigrat derecede parafine batırın.

Numuneyi gömmek için, uyluk kemiği ve kaval kemiğini 90 derecelik bir açıyla yerleştirerek parafine batırın. Parafin tamamen soğuduğunda, numuneleri gömme tankından çıkarın. Bunları numaralandırın ve gece boyunca eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Parafin bölümlerini 65 derecede 30 dakika pişirin, ardından 10 dakika ksilene batırarak cilalayın. Bölümleri her seferinde üç kez taze ksilen ile daldırın. Bölümleri sırayla %100 etanol, %95 etanol, %70 etanol ve damıtılmış suya her biri beş dakika daldırarak yeniden sulandırın.

TRAP boyama kitini kullanarak boyama solüsyonunu hazırlayın ve 37 santigrat dereceye ısıtın. Her bölüme 50 ila 100 mikrolitre boyama solüsyonu ekleyin ve bunları 37 santigrat derece nemli bir odada 20 ila 30 dakika inkübe edin. Kırmızı çok çekirdekli osteoklastlar görülene kadar osteoklastların lekelenme durumunu her beş dakikada bir ışık mikroskobu altında kontrol edin.

Ardından reaksiyonu su ile sonlandırın. Bölümleri hematoksilen çözeltisinde 30 saniye boyunca lekeleyin ve bir dakika boyunca% 1 amonyak çözeltisine batırarak sabit bir mavi renk oluşturun. Ardından yavaşça akan musluk suyunda durulayın.

Bölümleri nötr balzamlı lamel lamlar kullanarak monte edin ve gece boyunca kurutun. Mikroskopla üç ila beş görüş alanı yakalayın ve trabeküler çevreyi görüntü J ile analiz edin. Ölçek çubuğunun uzunluğunu L1 olarak ölçmek için düz çizgi aracını kullanın. Ardından, trabeküler çevrenin uzunluğunu L2 olarak ölçmek için segmentli çizgi aracını kullanın. Fiziksel uzunluğu hesaplayın ve üçten fazla çekirdeğe sahip TRAP pozitif hücrelerin sayısını sayın. Fiksasyondan sonra, tibiaları PBS ile üç kez nazikçe yıkayın ve numuneleri sırayla beşer dakika boyunca% 95 etanol,% 100 etanol ve ksilen içine batırın.

Numuneleri 12 saat asetona ve iki saat boyunca yarım aseton ve yarım reçineye ve gece boyunca bir kurutma fırınında saf reçineye batırın. Uygun bir silika jel gömme tankına saf reçine ekleyin ve numuneleri kabarcıklardan kaçınarak tanka yerleştirin. Reçineyi 48 saat boyunca 60 santigrat derecede bir kurutma fırınında polimerize edin.

Numuneleri döner bir mikrotom ile sürekli olarak beş mikrometre kalınlığında bölümler halinde kesin ve numunelerin geri kalanını kurutucu ile oda sıcaklığında saklayın. Bölümleri cımbızla% 75 etanol damlasıyla yapıştırın ve nötr balsam kullanarak lamel ile monte edin. Bir floresan mikroskobu ile kırmızı ve yeşil floresan etiketlemesini yakalayın.

Stat3 delesyonunun osteoklast farklılaşması üzerindeki etkisini incelemek için osteoklastlara özgü Stat3 delesyon fareleri üretildi. Femoral rekonstrüksiyon ve mikro BT ile yapılan kantitatif analiz, Stat3 Ctsk farelerinin kemik kütlesinin vahşi tip farelere kıyasla arttığını gösterdi. Yabani tip ve Stat3 Ctsk farelerinden elde edilen femora'nın histo morfolojisi H ve E boyama ile incelendi.

Orestistojenik aktivite TRAP boyaması kullanılarak tespit edildi. Osteoklastlar, birden fazla çekirdeğe sahip büyük TRAP pozitif hücrelerdir. TRAP pozitif osteoklastların sayısı, Stat3 Ctsk farelerinde, vahşi tip farelere kıyasla daha düşüktü, bu da Stat3 eksikliğinin osteoklast oluşumunu bozduğunu gösteriyor.

Osteogenez kalsein ve alizarin kırmızısı ile ölçüldü. Kalsein ve alizarin kırmızı floresan arasındaki alan yeni oluşan kemiği temsil eder. Osteoklastlarda silinen Stat3, kemik anabolizmasını etkilemedi.

Daha sonra kıkırdağın simetrik olduğu ve burada net M şeklinde çizginin kullanıldığını gösteren sagital parafin kesitleri. Çalışmalar için, mekanik özellikler gibi iskelet sisteminin daha fazla özelliğini dahil edeceğiz.