Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Bu yapı-fonksiyon yönteminin genel amacı, saf veya farklılaşmış fare embriyonik kök hücrelerinde farklı protein alanlarının veya hastalıkla ilgili mutasyonların rolünü moleküler düzeyde incelemektir. Bu yöntem, bir proteinin farklı kalıntılarının veya alanlarının, belirli bir hücresel bağlamda işlevine nasıl katkıda bulunabileceğini ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kurtarma yapılarının nakavt edilmiş embriyonik kök hücrelerin veya ES hücrelerinin genomuna çok verimli bir şekilde hedeflenmesine ve farklı hücre tiplerindeki rollerinin araştırılmasına izin vermesidir.

Bunu başarmak için, yüksek verimli üç teknolojiyi bir araya getiriyoruz. Bunlar, geliştirilmiş fare embriyonik kök hücre izolasyonu, rekombinasyon tabanlı hedefleme faktörü montajı ve rekombinasyon aracılı kaset değişimi veya RMC yoluyla ES hücre hedeflemesini içerir. Bazı prosedürleri göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Jinke D'Hont olacak.

Rekombinasyon aracılı kaset değişimi veya RMCE, bir vektör ve bir genomik lokus arasında DNA parçalarının değiş tokuşuna izin verir. RMCE, çapraz reaksiyona girmeyen ve bir genomik lokusa gömülü olan hetero-spesifik rekombinasyon bölgelerinden yararlanır. Aynı hetero-spesifik bölgelerle çevrili bir DNA fragmanı içeren bir donör plazmidinin varlığında, rekombinaz bu DNA fragmanını çift eşzamanlı translokasyon nedeniyle RMCE uyumlu genomik lokusa yerleştirecektir.

Sadece doğru rekombinasyon üzerine, Rosa 26 yerleştirme bölgesinde sıkışıp kalmış promotörsüz Neomisin direnç geni, gelen hedefleme vektöründe bir PGK promotörü aracılığıyla geri yüklenecek ve bu da ilaca direnç sağlayacaktır. Bu Neomisin direnç tuzağı sistemi, blastosist izolasyonundan bir gün önce, 12 iyi kültürlenmiş plakaya% 0.1 jelatin ekleyin, genellikle% 100'e yakın çok yüksek bir hedefleme verimliliği ile sonuçlanır. Ve onları beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Jelatin çözeltisini aspire edin. Daha sonra bir şişe P2 Fare Embriyonik Fibroblastlarının veya MEF'lerin dörtte birini MEF ortamına tohumlayın ve 12 oyuklu plakaya bölün. 12 oyuklu MEF plakalarını 37 santigrat derecede iki mililitre MEF ortamında inkübe edin.

Ve hücreleri birleşik bir tek tabakaya büyütün. Daha sonra kuyucuklara mililitre Mitomisin tohumu başına 10 mikrogram ekleyin. Ve hücreleri etkisiz hale getirmek için kültürleri 37 santigrat derecede üç saat inkübe edin.

Metin protokolüne göre Rosa 26 lokusunda bir RMCE kaseti içeren heterozigot nakavt fareleri seçtikten sonra, heterozigot nakavt fareleri ile RMCE uyumlu heterozigot nakavt fareleri yetiştirmek için çiftleşmeler ayarlayın. Ertesi sabah, dişiyi masalın tabanından kaldırarak çiftleşme tıkaçlarını kontrol edin ve vajinal açıklığı beyazımsı bir kitle açısından inceleyin. Tıkacın görülmesi zorsa, açılı bir prob ile vulvanın dudaklarını hafifçe açın, ardından tıkalı dişileri erkeklerinden ayırın.

Koitus veya DPC'den 3.5 gün sonra blastosistleri toplamak için. Hamile kadınları ötenazi yaptıktan sonra, orta ventral bir kesi yapın ve uterus ve yumurta kanalını incelemek için ince makas ve forseps kullanın. Ardından, 26 gauge bir iğneyi M2 ortamı ile doldurulmuş 1 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 45 derecelik bir açıyla bükün.

Ve iğneyi uterusun yumurta kanalına en yakın olan ucuna yerleştirin. Blastosistleri uterustan 10 santimetrelik bir tabağın kapağına akıtmak için pistonu iterken iğneyi yerinde tutmak için ince forseps kullanın. Yıkama başarılı olursa uterus şişer.

Tüm embriyoları bir damla M2 ortamında toplamak için bir ağız pipeti kullanın ve embriyoları bir damla M2 ortamında iki kez yıkayın. Embriyoları yıkadıktan hemen sonra, mitomisin-C ile etkisiz hale getirilmiş hücreleri iki kez yıkamak için PBS kullanın. Daha sonra bir ağız pipeti kullanarak, her bir blastosisti, pluripotent veya 2I ile desteklenmiş SRES hücre ortamında, mitomisin-C ile muamele edilen MEF'lerin ayrı bir kuyucuğuna plakalayın.

Kültürleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. SREF hücre ortamını her iki ila üç günde bir yenileyin. Her blastosisti stereo mikroskop altında 4X büyütmede inceleyin ve MEF tabakasına tarama ve ayrılma olup olmadığını kontrol edin.

10 ila 12 günlük kültürden sonra, stereo mikroskop altında, tek tek icium büyümelerini seçmek için tek kullanımlık uçlara sahip bir P10 pipeti kullanın. Her bir büyümeyi yaklaşık 10 mikrolitre ortama, PBS oyuğu başına 30 mikrolitre içeren V şeklinde 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her oyuğa 50 mikrolitre% 0.25 tripsin ekleyin.

Ve plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte üç dakika inkübe edin. 100 mikrolitre önceden inkübe edilmiş FPS içeren ES hücre ortamı ekleyin ve 10 ila 15 kez pipetleyerek icium büyümelerini tek hücrelere ayırın. Daha sonra ayrışan hücreleri mitomisin-C ile muamele edilmiş 96 kuyulu MEF plakalarına aktarın.

Ertesi gün, SR tabanlı ortamı değiştirin. ES hücrelerini benzer şekilde 24 ila 6 oyuklu plakalardan genişletin. Kurtarılan CDNA vektörlerini metin protokolüne göre tanımladıktan sonra, 100 nanogram kurtarma CDNA vektörü, 150 nanogram önceden eksize edilmiş RMCEDV1 vektörü ve iki mikrolitre rekombinaz karışımı kullanarak 10 mikrolitrelik bir LR reaksiyonu hazırlayın, faj kodlu bir integraz, bir eksizyonaz ve bir bakteriyel entegrasyon konak faktörü.

Reaksiyonu iki saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Yeniden birleştirilen vektörleri dönüştürmek için, 2 mililitrelik etekli vidalı kapaklı bir tüpte 40 mikrolitre ısı şokuna yetkin E.Coli bakterisine her karışımdan 5 mikrolitre ekleyin. Ve numuneyi 20 dakika buz üzerinde inkübe edin.

Daha sonra hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Tüpe bir mililitre LB ortamı ekleyin ve hücreleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ampisilin içeren agar plakalarında 50 mikrolitre plaka

Ve bir gecede 37 santigrat derecede büyür. Rastgele beş koloni seçmek için bir P200 ucu kullanarak doğru hedefleme vektörüne sahip kolonileri tanımlayın. Ucu iki ila beş mililitre LB ortamı içeren bir cam test tüpüne aktarın ve gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün.

Her koloniden DNA'yı çıkardıktan sonra, 0,5 ila iki mikrogram DNA'yı sindirerek örnekleri doğrulayın ve örnekleri %1'lik bir agaroz jeli üzerinde ayırın. RMCE uyumlu bir ES hücresi kültürü başlatın ve bunları FBS tabanlı ES hücre ortamında MEF'lerde en az iki kez geçirin. Daha sonra ES hücrelerini jelatinleştirilmiş altı oyuklu bir plaka üzerine bölün.

Ertesi gün, yaklaşık% 50 birleşik olan ES hücrelerini yenilemek için 1,5 mililitre FBS bazlı ES hücre ortamı kullanın. Kurtarma CDNA'sı içeren bir mikrogram önceden eksize edilmiş RMCEDV1 hedefleme vektörü ve bir mikrogram FLIPe ekspresyon plazmidini 250 mikrolitre saf DMEM ortamında birleştirin. 250 mikrolitre saf DMEM ortamına yedi mikrolitre lipofektin bazlı transveksiyon reaktifi ekleyin.

Ve çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. DNA ve lipofektin çözeltilerini birleştirin. Ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

Daha sonra transveksiyon karışımını tazelenmiş ES hücrelerine pipetleyin ve hafifçe döndürün. Transveksiyondan bir gün sonra, tüm ES hücrelerini tüpten 10 santimetrelik bir kültür kabına, birleşik bir DR4 MEFS tabakası ve 10 mililitre FPS bazlı ES hücre ortamı ile ayırın. Transveksiyondan iki gün sonra, ortama G418 ekleyerek doğru FLIP-e aracılı kaset değişimine sahip ES hücre klonlarını seçin.

Burada gösterildiği gibi, hedeflenmemiş kolonilerin kitlesel olarak öldürülmesi üç ila beş gün sonra görünür olmalıdır. Koloniler yedi ila 10 gün sonra ortaya çıkmalıdır. Bu kolonileri seçin, ardından genişletin ve bu videoda daha önce gösterildiği gibi klonları doğrulayın.

ES hücrelerini embriyoid cisimlere veya EB'lere farklılaştırmak için, metin protokolüne göre Rosa 26 tahrikli kurtarma yapılarıyla ES hücrelerini kültürledikten sonra, EB'lerin 30 gün boyunca yapışmayan kaplarda oluşmasına izin verin. EB süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpe aktararak ortamı her iki ila üç günde bir yenileyin. Ve EB'lerin yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.

Süpernatanı çıkarın, taze ortam ekleyin ve EB süspansiyonunu bakteriyel dereceli bir tabağa aktarın. Metin protokolüne göre ES hücrelerini ve EB'leri immünofloresan ve TEM ile analiz edin. Yapı fonksiyonu yöntemi kullanılarak,% 100 verimlilikle önceden eksize edilmiş beş RMCEDV1 hedefleme vektörü oluşturuldu ve bu kurtarma yapıları, RMCE aracılığıyla,% 97'lik bir verimlilikle P120 katenin ES hücrelerini nakavt etmek için hedeflendiKistik EB morfolojisi, farklı kurtarma yapılarını taramak için fenotipik bir okuma olarak kullanılabilir.

Kavramın kanıtı olarak, R26 tahrikli P120 katenin izoform 1A, p120 katenin nakavt fenotipini kurtardı. P120 kateninin E-kaderinden bağımsız membran ankrajının sitik EB oluşumunu mümkün kılıp kılmadığını test etmek için, k-ras membran hedefleme motifi, CAAX, P120 kateninin karboksi terminaline kaynaştırıldı ve RMCE aracılığıyla, EB'ler yapılmadan önce P120 katenin ES hücrelerini nakavt etmek için sokuldu. Bununla birlikte, bu yapı, E-kaderinin bağlanmasına ve stabilizasyonuna izin vermeyen baskın bir negatife hizmet eder.

Ve sonuç olarak, p120 katenin nakavt fenotipini kurtarmaz. Epitelyal-mezenkimal geçiş veya EMT, ES hücre farklılaşması sırasında da meydana gelen önemli bir gelişimsel süreçtir. P120 katenin ES hücrelerinde eksprese edildiğinde, EMT indükleyicileri, ZEB1, ZEB2 veya E-kaderin gibi çeşitli epitelyal belirteç genlerini doğrudan baskılayabilen salyangoz, kistik EB oluşumunu geri yükleyemedi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, RMCE uyumlu ES hücreleri bir ay içinde izole edilebilir. RMCE uyumlu hedefleme vektörleri bir hafta içinde oluşturulabilir ve uygun şekilde gerçekleştirilirse bu teknik kullanılarak ES hücrelerinin hedefli kurtarılması bir ay içinde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, saf veya farklılaşmış embriyonik kök hücrelerde yapı fonksiyonu çalışmaları yapmak için RMCE'nin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.