İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

Aşağıdaki protokol, insan pluripotent kök hücrelerinden bir nesil insan bağırsak ve kolonik organoidleri tanımlamaktadır. Bu teknik, kullanıcının bağırsak deseninde yer alan yolları sorgulamasına izin verecektir. Bu teknik, kullanıcının izojenik olan bölgeye özgü organoidler üretmesine olanak tanır. Bu protokol, bağırsak paterninin kurulmasını ve sürdürülmesini düzenleyen faktörler hakkında fikir verebilir.

[Anlatıcı] Hücre sıcaklığına ulaşmasını sağlamak için hücre dışı bir matris veya ECM kaplı 24 oyuklu plakayı 30 dakika boyunca bir biyogüvenlik kabininin içine yerleştirerek başlayın. mTeSR1 tam orta hücre ayırma solüsyonunu ve gelişmiş DMEM'i 37 santigrat derecelik bir boncuk banyosuna yerleştirin ve 30 dakika ısınmalarına izin verin. Kaplama ortamını 50 mililitre konik bir tüpte 13 mililitre mTeSR1 ve 13 mikrolitre 10 milimolar Y-27632 Rho ile ilişkili protein kinaz veya ROCK inhibitörü ekleyerek hazırlayın. Altı oyuklu plakadan hücreleri toplamak için, ortamı üç ila dört kuyudan aspire edin ve kuyu başına iki mililitre gelişmiş DMEM ile bir kez yıkayın. Gelişmiş DMEM'i aspire edin ve her bir kuyucuğa bir mililitre hücre ayrışma solüsyonu dağıtın. Plakayı %5 karbondioksitli, 37 santigrat derecelik bir inkübatörde beş ila yedi dakika inkübe edin. Hücre süspansiyonunu hazırlamak için beş mililitrelik bir pipet kullanarak dört ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek herhangi bir hücre kümesini ayırın. Her kuyucuğa iki mililitre gelişmiş DMEM ekleyin. Dört ila beş kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 G'de döndürün. Hücre peletini aspire etmeden ortamı tüpten aspire edin. Ve hazırlanan mTeSR1 artı ROCK inhibitörü ortamından altı mililitre ekleyin. Üç ila dört kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yavaşça yeniden süspanse edin. Ardından süspansiyonu 50 mililitrelik tüpün içindeki mTeSR1 ve ROCK inhibitör ortamının geri kalanına aktarın. Dört ila beş kez kuvvetlice yeniden askıya alın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri kaplamadan hemen önce ECM'yi 24 oyuklu plakadan aspire edin. İki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri tekrar süspanse edin ve her bir oyuğa 0,5 mililitre hücre süspansiyonu dağıtın. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı saat yönünde üç kez, saat yönünün tersine üç kez, ileri ve geri üç kez ve yan yana üç kez hafifçe sallayın. Plakayı 37 santigrat derece, %5 karbondioksit inkübatörüne aktarın ve 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra, harcanan besiyeri aspire edin. Kuyu başına 0,5 mililitre mTeSR1 ekleyin ve aynı koşullar altında 24 saat tekrar inkübe edin. Mililitre başına 100 mikrogram Activin A stok solüsyonunu ve mililitre BMP4 başına 100 mikrogramı konik bir tüp içinde Activin birinci gün ortamına seyrelterek Activin'in birinci gün tam ortamını hazırlayın. Ortamı 37 santigrat derecelik bir boncuk banyosunda ısıtın. 24 oyuklu plakadan mTeSR1 ortamını aspire edin ve kuyu başına 0,5 mililitre Activin birinci gün ortamı ekleyin. Plakayı 37 santigrat derece, %5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin ve 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra hücreleri kontrol edin. Activin'in ikinci tam ortamını mililitre başına 100 mikrogram Activin A stok solüsyonunu konik bir tüp içinde Activin ikinci gün ortamına seyrelterek hazırlayın ve tüpü 37 santigrat derecelik bir boncuk banyosuna yerleştirin. 24 oyuklu farklılaşma plakasını karbondioksit inkübatöründen çıkarın ve harcanan ortamı çıkarın. Kuyu başına 0,5 mililitre önceden ısıtılmış Activin ikinci gün ortamı dağıtın ve plakayı 24 saat boyunca karbondioksit inkübatörünün içine geri yerleştirin. Mililitre başına 100 mikrogram Activin A stok solüsyonunu konik bir tüp içinde Activin üçüncü gün ortamına seyrelterek Activin üçüncü gün ortamını hazırlayın ve tüpü 37 santigrat derecelik bir boncuk banyosuna yerleştirin. Harcanan ortamı çıkarın ve kuyu başına 0,5 mililitre Activin üçüncü gün ortamı dağıtın. Kesin endodermin orta arka bağırsak sferoidlerine farklılaşmasıyla başlamak için, 50 mililitrelik konik bir tüpe FGF4 ile 25 mililitre orta arka bağırsak indüksiyon ortamı ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir boncuk banyosuna koyun. Tam orta arka bağırsak indüksiyon ortamını hazırlamak için, ortam ısındıktan sonra 7,5 mikrolitre CHIR99021 ekleyin. Harcanan ortamı çıkarın, kuyucuk başına 0,5 mililitre orta arka bağırsak indüksiyon ortamı dağıtın ve 37 santigrat derecede, %5 karbondioksitte 24 saat inkübe edin. Ertesi gün tek tabaka içindeki hücrelerin yoğunlaşması meydana geldikten sonra, harcanan ortamı taze bir orta arka bağırsak indüksiyon ortamı ile değiştirin ve plakayı 24 saat boyunca inkübasyon için geri yerleştirin. Ortamı değiştirirken yüzen sferoidlerin atılmasını önlemek için, eski ortamı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Sferoidleri 12.5 mililitre taze orta arka bağırsak indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin, aynı 24 oyuklu plakaya kuyucuk başına 0.5 mililitre ekleyin ve inkübatörde 24 saat inkübe edin. Arka bağırsak indüksiyonunun dördüncü gününde, ortamı 15 mililitrelik bir tüpe toplayarak plaka kuyucuklarından yüzen sferoidleri toplayın ve ardından bir dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Kesin endoderm indüksiyonunun etkinliği, FOXA2 ve SOX17 için immünofloresan boyama yapılarak değerlendirildi. Ön HOX faktörü HOXD3'ün mRNA ekspresyonunun, Noggin ile tedavi edilen insan bağırsak organoidlerinde veya HIO'larda en yüksek, epitelyal büyüme faktörü veya EGF ile tedavi edilen HIO'larda daha az ve BMP ile tedavi edilen insan kolonik organoidlerinde veya HCO'larda en düşük olduğu bulundu. Tersine, HOXA13 ve HOXD13 mRNA ekspresyonlarının HIO'larda düşük ve HCO'larda yüksek olduğu bulundu. HCO epitelinin uygun şekilde paternlenip desenlenmediğini belirlemek için SATB2, CDX2 ve CDH1 için immünofloresan boyama yapıldı.