Name: İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Öğrenin, insan pluripotent kök hücrelerinden bağırsak ve kolonik organoid üretim, bakım ve karakterizasyon yöntemlerini. Bu protokoller, gastrointestinal araştırmalarda tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+gastrointestinal+tract%3A+twenty+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress.</a> Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).</li>
<li>van Klinken, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+is+the+prominent+mucin+in+human+gallbladder+and+is+also+expressed+in+a+subset+of+colonic+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells.</a> American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).</li>
<li>Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Muc5b+mucin+gene%3A+cDNA+and+genomic+structures%2C+chromosomal+localization+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression.</a> Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).</li>
<li>Lau, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hedgehog+signaling+promotes+development+of+mouse+and+human+enteric+neural+crest+cells%2C+based+on+single-cell+transcriptome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses.</a> Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Munera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+colonic+organoids+via+transient+activation+of+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).</li>
<li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+fibroblasts+have+specialized%2C+diverse+transcriptional+phenotypes%3A+a+comprehensive+gene+expression+analysis+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts.</a> PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).</li>
<li>Yahagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-specific+expression+of+Hox+genes+along+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies%22%5BJournal%5D)">Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract.</a> Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).</li>
<li>Sarvestani, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+organoids+derived+from+patients+with+ulcerative+colitis+recapitulate+colitic+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity.</a> Nature Communications. 12 (1), 262(2021).</li>
<li>Holloway, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+intestinal+organoids+with+endogenous+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Jaitner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+determines+miRNA+expression+and+long-term+memory+in+the+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system.</a> Elife. 5, 17361(2016).</li>
<li>Teo, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+and+BMP4+synergistically+promote+formation+of+definitive+endoderm+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).</li>
<li>Fordham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+expanded+fetal+intestinal+progenitors+contributes+to+colon+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).</li>
<li>Tamminen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+commitment+and+maturation+of+human+pluripotent+stem+cells+is+independent+of+exogenous+FGF4+and+R-spondin1%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1.</a> PloS One. 10 (7), 0134551(2015).</li>
<li>Crespo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+colorectal+cancer+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing.</a> Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).</li>
<li>Lees, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+and+modify+epithelial+cell+protection+against+Salmonella+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li>
<li>Jung, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-2+induces+the+in+vitro+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids.</a> Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).</li>
<li>Woo, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+a+Wnt-telomere+feedback+loop+restores+intestinal+stem+cell+function+in+a+human+organotypic+model+of+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+APC+mutagenesis+and+familial+adenomatous+polyposis+using+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells.</a> PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroendocrine+cells+couple+nutrient+sensing+to+nutrient+absorption+by+regulating+ion+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport.</a> Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+structure-function+study+of+neurogenin3+disease-causing+alleles+during+human+pancreas+and+intestinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development.</a> Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).</li>
<li>Kumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineage-specific+transcription+factor+CDX2+navigates+dynamic+chromatin+to+control+distinct+stages+of+intestine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development.</a> Development. 146 (5), (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>%1 Sığır serum albümini (BSA) solüsyonu</td><td>YOK</td><td>YOK</td><td>YOK</td></tr><tr><td>15 mL Corning tüpü</td><td>Doğan</td><td>21008-918</td><td>YOK</td></tr><tr><td>%30 Sükroz</td><td>YOK</td><td>YOK</td><td>PBS'de yapılmıştır.</td></tr><tr><td>%5 Normal eşek serumu</td><td>Jackson İmmünoaraştırma Laboratuvarı</td><td>017-000-121</td><td>YOK</td></tr><tr><td>50 mL Corning tüpü</td><td>Doğan</td><td>21008-951</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Termo Bilimsel</td><td>A1110501</td><td>Hücre dekolmanı çözümü; 5 mL Accutase'i 10 mL'lik tüplere toplam 20 tüpe ayırın ve -20 &deg'de saklayın; 6 aya kadar C. 4 &deg; C kullanmadan önce bir gece bekletin.</td></tr><tr><td>Aktivasyon A</td><td>Hücre yönlendirme sistemleri</td><td>GFH6-100x10</td><td>Liyofilize tozu 100 &micro'da yeniden oluşturun; %0.1 sığır serum albümini (BSA) içeren steril PBS'de g/mL. Aliquot 38 &micro; Activin A'nın L'sini önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüplerine koyun ve -80 &deg; C (Tüplerin süresi, alındığı tarihten itibaren 12 ay sonra sona erer).</td></tr><tr><td>Activin 1. gün orta (RPMI 1640)</td><td>Corning</td><td>MT10041CV</td><td>Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA, Corning 11140050) kullanın ve 4 &dereceC'de saklayın. Temel 1. gün ortamı: 500 mL RPMI 1640 ve 500 mL NEAA. Activin Day 1 medium'u hazırlarken, 13 mL temel day 1 medium, 13 &micro; l Activin A (100 &micro; g/mL) ve 2 &micro; l BMP4 (100 &micro; g/mL). Baz besiyeri 3 haftaya kadar stabildir ancak büyüme faktörlerinin eklenmesinden hemen sonra kullanılmalıdır.</td></tr><tr><td>Activin 2. gün orta (RPMI 1640, %0,2 FBS hacim/hacim)</td><td>Hidrolik klon</td><td>SH30070.03T</td><td>Esansiyel olmayan amino asitler (Corning 11140050) kullanın ve 4 °C'de saklayın. Temel 2. gün ortamı: 500 mL RPMI 1640, 500 mL NEAA ve 1 mL %0.2 serum. Activin Day 2 medium'u hazırlarken, 12.5 mL temel day 2 medium ve 12.5 &micro ekleyin; Activin A'nın L (100 &mikro; g/mL). Baz besiyeri 3 haftaya kadar stabildir ancak büyüme faktörlerinin eklenmesinden hemen sonra kullanılmalıdır.</td></tr><tr><td>Activin 3. Gün orta (RPMI 1640, %2 FBS hacim/hacim)</td><td>Hidrolik klon</td><td>SH30070.03T</td><td>Esansiyel olmayan amino asitler (Corning 11140050) kullanın ve 4 °C'de saklayın. Temel 3. gün ortamı: 500 mL RPMI 1640, 500 mL NEAA ve 10 mL %2 serum. Activin Day 3 medium'u hazırlarken, 12.5 mL temel day 3 ve 12.5 &micro ekleyin; Activin A'nın L (100 &mikro; g/mL). Baz besiyeri 3 haftaya kadar stabildir ancak büyüme faktörlerinin eklenmesinden hemen sonra kullanılmalıdır.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Keçi</td><td>Termo Bilimsel</td><td>A11055 Serisi</td><td>1:500 seyreltme (İkincil antikor)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Eşek anti-Tavşan</td><td>Termo Bilimsel</td><td>A21206 Serisi</td><td>1:500 seyreltme (İkincil antikor)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Eşek anti-Fare</td><td>Termo Bilimsel</td><td>A10036 Serisi</td><td>1:500 seyreltme (İkincil antikor)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Eşek anti-Fare</td><td>Termo Bilimsel</td><td>A31571 Serisi</td><td>1:500 seyreltme (İkincil antikor)</td></tr><tr><td>Temel kalıp</td><td>Balıkçı</td><td>22-363-552</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Temel bağırsak ortamı (ileri DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12491015</td><td>&nbsp; Temel bağırsak ortamını hazırlarken, 2 mM L-Glutamin (Corning A2916801), 500 mL 100 U/mL Penisilin-Streptomisin (Gibco 15-140-122) ve 7.5 mL elde etmek için 500 mL DMEM, 500 mL N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL B27 (Gibco), 500 mL L-Glutamin ekleyin; 1 M HEPES, 15 mM HEPES almak için.&nbsp; Baz besiyeri 3 haftaya kadar stabildir ancak büyüme faktörlerinin eklenmesinden hemen sonra kullanılmalıdır.</td></tr><tr><td>Biorad CFX96 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi</td><td>Biorad Hakkında</td><td>YOK</td><td>Diğer qRT-PCR sistemleri kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Hücre Geri Kazanım Çözümü</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>ECM'yi bozan çözüm</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Yeniden Hücre</td><td>4000410</td><td>10 mM'de 2.15 mL DMSO ekleyerek sulandırın. 50 &micro hazırlayın; L alikotları ve -20 &dereceC.&nbsp; Tozu 4 &deg; C, ışıktan korunuyor.</td></tr><tr><td>CTRL HIO desen oluşturma ortamı</td><td>YOK</td><td>YOK</td><td>Temel bağırsak ortamı ve 100 ng/mL EGF.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542 Serisi</td><td>1:100 seyreltme (İkincil antikor)</td></tr><tr><td>DE tek katmanlı</td><td>YOK</td><td>YOK</td><td>Tek katman önceki adımlarda oluşturuldu (Bölüm 4.4).</td></tr><tr><td>Dağıtmak</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td>Liyofilize tozu Gelişmiş DMEM'de (Gibco MT15090CV) 1 mg/mL nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. Bir Millipore filtre sterilizasyon tüpü kullanarak vakumlayarak sterilizasyon için çözeltiyi filtreleyin. 10 mL alikot (1 mg/mL) yapın ve -20 &deg; 6 aya kadar C. 4 &deg; C kullanmadan önce bir gece bekletin.</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Termo Bilimsel</td><td>236-EG-01M</td><td>100 ng/mL EGF hazırlarken 500 &micro; g/mL steril PBS'de. Daha sonra 1 mg EGF'ye 2 mL steril PBS ekleyin ve 500 &micro; g/mL EGF çözeltisi. Aliquot 100 &micro; 20 tüpte L EGF.</td></tr><tr><td>Fisherbrand 6 cm Şeffaf Kapaklı Petri Kapları</td><td>Balıkçı</td><td>FB0875713A</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Fisherbrand Hücre Kaldırıcı</td><td>Balıkçı</td><td>08-100-240</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Fisherbrand Sınıf B Şeffaf Cam Dişli Şişeler, Kapaklar Takılı</td><td>Balıkçı</td><td>03-338B</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tek Kullanımlık Borosilikat Cam Pastör Pipet</td><td>Balıkçı</td><td>13-678-2D0</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Floromount G Kızak Montaj Ortamı</td><td>VWR</td><td>100241-874</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Gibco gelişmiş DMEM</td><td>Gibco</td><td>12-491-023</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Keçi anti-E-Cadherin</td><td>R& D sistemleri</td><td>AF648 Serisi</td><td>1:400 seyreltme (Birincil antikor)</td></tr><tr><td>Keçi anti-SOX17</td><td>R& D sistemleri</td><td>AF1924</td><td>1:500 seyreltme (Birincil antikor)</td></tr><tr><td>HCO'lar modelleme ortamı</td><td>YOK</td><td>YOK</td><td>Temel bağırsak ortamı, 100 ng/mL EGF ve 100 ng/mL BMP2. BMP2 hazırlarken, BMP2 şişelerine (100 &mikro; g). Alikot 25 &mikro; 4 tüpte BMP4 çözeltisi L.&nbsp; Baz besiyeri 3 haftaya kadar stabildir ancak büyüme faktörlerinin eklenmesinden hemen sonra kullanılmalıdır.</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>YOK</td></tr><tr><td>İnsan Pluripotent Kök Hücreleri (hPSC)</td><td>Pluripotent Kök Hücre Tesisi</td><td>YOK</td><td>Matrigel kaplı 24 oyuklu bir plakaya ekilen hücreler (Thermo Scientific 73520-906).</td></tr><tr><td>Buz gibi soğuk %4 Paraformaldehit çözeltisi (PFA)</td><td>YOK</td><td>YOK</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Buz gibi Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>YOK</td><td>YOK</td><td>pH 7.4 olmalıdır.</td></tr><tr><td>ImmEdge Hidrofobik Bariyer Kalemi</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>101098-065</td><td>YOK</td></tr><tr><td>İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler (iPSC'ler)</td><td>Pluripotent Kök Hücre Tesisi (Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi)</td><td>YOK</td><td>Diğer hESC veya iPSC hatları kullanılabilir, ancak protokolün her hücre hattı için optimize edilmesi gerekir.</td></tr><tr><td>Leica mikrotomu</td><td>YOK</td><td>YOK</td><td>YOK</td></tr><tr><td>LSM 880 Serisi</td><td></td><td></td><td>Konfokal mikroskop</td></tr><tr><td>Matrigel Bazal Membran Matrisi</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Matrigel hESC onaylı Matris</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>4 x 6 oyuklu tabaklar için yeterli seyreltilmiş Matrigel yapmak için yeterli hacimlere karşılık gelen 4 x Matrigel alikotları hazırlayın.</td></tr><tr><td>Orta arka bağırsak indüksiyon ortamı (RPMI 1640)</td><td>Corning</td><td>MT10041CV</td><td>Esansiyel olmayan amino asitler (Corning 11140050), %2 FBS hacim/hacim (Hyclone SH30070.03T), 3 &mikro; M CHIR99021 ve 500 ng/mL FGF4. Baz besiyeri 3 haftaya kadar stabildir ancak büyüme faktörlerinin eklenmesinden hemen sonra kullanılmalıdır.</td></tr><tr><td>Orta arka bağırsak sferoidleri</td><td>YOK</td><td>YOK</td><td>YOK</td></tr><tr><td>MilliporeSigma Steriflip Steril Tek Kullanımlık Vakum Filtre Üniteleri</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGP00525</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Fare anti-CDX2</td><td>Biyogeneks</td><td>MU392-UC</td><td>1:300 seyreltme (Birincil antikor)</td></tr><tr><td>Fare anti-FOXA2</td><td>Abnova/Novus</td><td>H00003170-M01</td><td>1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>mTeSR1 tam büyüme ortamı</td><td>Kök Hücre teknolojileri</td><td>85870</td><td>Kontaminasyonu önlerken bir 400 mL mTeSR ortamına (85870) 100 mL mTeSR takviyesi (85870) ve 50 mL'lik tüplere alikot ekleyin. 4&deg'de saklayın; C kullanana kadar.</td></tr><tr><td>Murray'in Clear çözümü (BABB olarak da bilinir)</td><td>Murray'in</td><td>YOK</td><td>1:2 benzil benzoat ve benzil alkol.</td></tr><tr><td>NOG HIO desen ortamı</td><td>YOK</td><td>YOK</td><td>Temel bağırsak ortamı, 100 ng/mL EGF ve 100 ng/mL NOGGIN (Dağıtım 25 &mikro; 250 &micro'da g NOGGIN; l %0.1 BSA ile steril PBS).</td></tr><tr><td>NükleoSpin RNA'sı</td><td>Takara</td><td>740955.25</td><td>Diğer RNA izolasyon kitleri kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Nunclon delta yüzey doku kültürü kabı 24 kuyucuklu (Nunc)</td><td>Termo Bilimsel</td><td>73521-004</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Matrigel ile kaplanmış Nunclon delta yüzey doku kültürü kabı 24 oyuklu</td><td>Termo Bilimsel</td><td>73521-004</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Nunclon delta yüzey doku kültürü kabı 6 kuyucuklu (Nunc)</td><td>Termo Bilimsel</td><td>73520-906</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Nunclon delta yüzey doku kültürü kabı 6-kuyu kaplamalı&nbsp; Matrigel.</td><td>Termo Bilimsel</td><td>73520-906</td><td>YOK</td></tr><tr><td>HIO'lar, CTRL HIO'lar ve HCO'lar için büyüme ortamı</td><td>YOK</td><td>YOK</td><td>Temel bağırsak ortamı ve 100 ng/mL EGF (Nihai konsantrasyon)</td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Salin, %0,5 Triton X (PBS-T)</td><td>YOK</td><td>YOK</td><td>YOK</td></tr><tr><td>Astar</td><td>Entegre DNA Teknolojileri A.Ş. (IDT)</td><td>YOK</td><td>Primerler protokoldeki Tablo 2'de listelenmiştir.</td></tr><tr><td>Tavşan anti-CDX2</td><td>Hücre Markası</td><td>EPR22764Y</td><td>1:100 seyreltme (Birincil antikor)</td></tr><tr><td>Tavşan anti-SATB2</td><td>Hücre Markası</td><td>EP281 Serisi</td><td>1:100 seyreltme (Birincil antikor)</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan BMP-4 Proteini</td><td>R& D sistemleri</td><td>314-BP-010</td><td>Liyofilize tozu 100 &micro'da yeniden oluşturun; g/mL, %0.1 sığır serum albümini (BSA) içeren steril 4 mM HCl'de. 45.83 mL moleküler suya 4.17 mL HCl çözeltisi ekleyin, toplamda 50 mL 1 M HCl. Sonra 200 &micro ekleyin; L 1 M HCl ila 49.8 mL moleküler dereceli su, toplam 50 mL 4 mM HCl'ye eşittir. Daha sonra 50 mL 4 mM HCl'ye 0,05 g BSA ekleyin ve steril hale getirmek için süzün. Aliquot steril 4 mM HCl %0.1 BSA'dan 33 mikrosantrifüj tüpüne toplam ve -20 &derece; l steril 4 mM HCl %0.1 BSA BMP4 şişelerine (10 &mikro; g) 100 &micro'da BMP4 çözeltisi yapmak; g/mL.</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan FGF-4 Proteini</td><td>R& D sistemleri</td><td>235-F4-01M</td><td>100 &micro'da yeniden oluşturun; % 0.1 sığır serum albümini içeren steril PBS'de g / mL. %0.1 BSA yapmak için 50 mL PBS'ye 0.05 g BSA ekleyin. Filtre 0.22 &micro; BSA'yı sterilize etmek için M BSA. 5 tüpte 10 mL %0.1 BSA alikot. 10 mL steril %0.1 BSA içine 1 mg FGF-4 ekleyin. Aliquot 250 &micro; L'yi önceden soğutulmuş 40 mikrosantrifüj tüpüne koyun ve -80 &dereceC'de saklayın.</td></tr><tr><td>ROCK inhibitörü Y-27632</td><td>Tocris Hakkında</td><td>1254</td><td>Nihai konsantrasyon 10 mM'dir (10 mmol/L). DMSO'da 10 mM'de tekrar süspanse edin ve filtre sterilize edin. Her şişeye 3 mL steril PBS ekleyin. Aliqout 100 &micro; 30 tüpte L ROCK inhibitörü ve -20 &dereceC'de saklayın.</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA Sentez Kiti</td><td>Termo Bilimsel</td><td>11-754-250</td><td>YOK</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus mikroskop slaytları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T Bileşiği</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>YOK</td></tr></tbody></table>

İnsan pluripotent kök hücre kaynaklı bağırsak ve kolonik organoidlerin Üretimi, bakımı ve karakterizasyonu

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

Orta/arka bağırsak indüksiyon aşaması sırasında başarılı sferoid üretimi, başarılı modellemenin göstergesidir. Desenlemenin doğru olduğunu doğrulamak için yüzen sferoidlerde ve tek katmanda CDX2 için IF boyama gerçekleştirin. Kesin endoderm (DE) aşamasında boyama, DE indüksiyonunun etkinliğini gösterebilse de, verimli DE indüksiyonu olmadan sferoid üretimi mümkün değildir. DE indüksiyonunun etkinliğini test etmek için, FOXA2 ve SOX17 için IF boyama ve/veya RT-qPCR gerçekleştirin.
Modelleme aşa...

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing ...

Aşağıdaki protokol, insan pluripotent kök hücrelerinden bir nesil insan bağırsak ve kolonik organoidleri tanımlamaktadır. Bu teknik, kullanıcının bağırsak deseninde yer alan yolları sorgulamasına izin verecektir. Bu teknik, kullanıcının izojenik olan bölgeye özgü organoidler üretmesine olanak tanır. Bu protokol, bağırsak paterninin kurulmasını ve sürdürülmesini düzenleyen faktörler hakkında fikir verebilir.[Anlatıcı] Hücre sıcaklığına ulaşmasını sağlamak için hücre dışı bir matris veya ECM kaplı 24 oyuklu plakayı 30 dakika boyunca bir biyogüvenlik kabininin içine yerleştirerek başlayın. mTeSR1 tam orta hücre ayırma solüsyonunu ve gelişmiş DMEM'i 37 santigrat derecelik bir boncuk banyosuna yerleştirin ve 30 dakika ısınmalarına izin verin. Kaplama ortamını 50 mililitre konik bir tüpte 13 mililitre mTeSR1 ve 13 mikrolitre 10 milimolar Y-27632 Rho ile ilişkili protein kinaz veya ROCK inhibitörü ekleyerek hazırlayın. Altı oyuklu plakadan hücreleri toplamak için, ortamı üç ila dört kuyudan aspire edin ve kuyu başına iki mililitre gelişmiş DMEM ile bir kez yıkayın. Gelişmiş DMEM'i aspire edin ve her bir kuyucuğa bir mililitre hücre ayrışma solüsyonu dağıtın. Plakayı %5 karbondioksitli, 37 santigrat derecelik bir inkübatörde beş ila yedi dakika inkübe edin. Hücre süspansiyonunu hazırlamak için beş mililitrelik bir pipet kullanarak dört ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek herhangi bir hücre kümesini ayırın. Her kuyucuğa iki mililitre gelişmiş DMEM ekleyin. Dört ila beş kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 G'de döndürün. Hücre peletini aspire etmeden ortamı tüpten aspire edin. Ve hazırlanan mTeSR1 artı ROCK inhibitörü ortamından altı mililitre ekleyin. Üç ila dört kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yavaşça yeniden süspanse edin. Ardından süspansiyonu 50 mililitrelik tüpün içindeki mTeSR1 ve ROCK inhibitör ortamının geri kalanına aktarın. Dört ila beş kez kuvvetlice yeniden askıya alın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri kaplamadan hemen önce ECM'yi 24 oyuklu plakadan aspire edin. İki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri tekrar süspanse edin ve her bir oyuğa 0,5 mililitre hücre süspansiyonu dağıtın. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı saat yönünde üç kez, saat yönünün tersine üç kez, ileri ve geri üç kez ve yan yana üç kez hafifçe sallayın. Plakayı 37 santigrat derece, %5 karbondioksit inkübatörüne aktarın ve 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra, harcanan besiyeri aspire edin. Kuyu başına 0,5 mililitre mTeSR1 ekleyin ve aynı koşullar altında 24 saat tekrar inkübe edin. Mililitre başına 100 mikrogram Activin A stok solüsyonunu ve mililitre BMP4 başına 100 mikrogramı konik bir tüp içinde Activin birinci gün ortamına seyrelterek Activin'in birinci gün tam ortamını hazırlayın. Ortamı 37 santigrat derecelik bir boncuk banyosunda ısıtın. 24 oyuklu plakadan mTeSR1 ortamını aspire edin ve kuyu başına 0,5 mililitre Activin birinci gün ortamı ekleyin. Plakayı 37 santigrat derece, %5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin ve 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra hücreleri kontrol edin. Activin'in ikinci tam ortamını mililitre başına 100 mikrogram Activin A stok solüsyonunu konik bir tüp içinde Activin ikinci gün ortamına seyrelterek hazırlayın ve tüpü 37 santigrat derecelik bir boncuk banyosuna yerleştirin. 24 oyuklu farklılaşma plakasını karbondioksit inkübatöründen çıkarın ve harcanan ortamı çıkarın. Kuyu başına 0,5 mililitre önceden ısıtılmış Activin ikinci gün ortamı dağıtın ve plakayı 24 saat boyunca karbondioksit inkübatörünün içine geri yerleştirin. Mililitre başına 100 mikrogram Activin A stok solüsyonunu konik bir tüp içinde Activin üçüncü gün ortamına seyrelterek Activin üçüncü gün ortamını hazırlayın ve tüpü 37 santigrat derecelik bir boncuk banyosuna yerleştirin. Harcanan ortamı çıkarın ve kuyu başına 0,5 mililitre Activin üçüncü gün ortamı dağıtın. Kesin endodermin orta arka bağırsak sferoidlerine farklılaşmasıyla başlamak için, 50 mililitrelik konik bir tüpe FGF4 ile 25 mililitre orta arka bağırsak indüksiyon ortamı ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir boncuk banyosuna koyun. Tam orta arka bağırsak indüksiyon ortamını hazırlamak için, ortam ısındıktan sonra 7,5 mikrolitre CHIR99021 ekleyin. Harcanan ortamı çıkarın, kuyucuk başına 0,5 mililitre orta arka bağırsak indüksiyon ortamı dağıtın ve 37 santigrat derecede, %5 karbondioksitte 24 saat inkübe edin. Ertesi gün tek tabaka içindeki hücrelerin yoğunlaşması meydana geldikten sonra, harcanan ortamı taze bir orta arka bağırsak indüksiyon ortamı ile değiştirin ve plakayı 24 saat boyunca inkübasyon için geri yerleştirin. Ortamı değiştirirken yüzen sferoidlerin atılmasını önlemek için, eski ortamı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Sferoidleri 12.5 mililitre taze orta arka bağırsak indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin, aynı 24 oyuklu plakaya kuyucuk başına 0.5 mililitre ekleyin ve inkübatörde 24 saat inkübe edin. Arka bağırsak indüksiyonunun dördüncü gününde, ortamı 15 mililitrelik bir tüpe toplayarak plaka kuyucuklarından yüzen sferoidleri toplayın ve ardından bir dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Kesin endoderm indüksiyonunun etkinliği, FOXA2 ve SOX17 için immünofloresan boyama yapılarak değerlendirildi. Ön HOX faktörü HOXD3'ün mRNA ekspresyonunun, Noggin ile tedavi edilen insan bağırsak organoidlerinde veya HIO'larda en yüksek, epitelyal büyüme faktörü veya EGF ile tedavi edilen HIO'larda daha az ve BMP ile tedavi edilen insan kolonik organoidlerinde veya HCO'larda en düşük olduğu bulundu. Tersine, HOXA13 ve HOXD13 mRNA ekspresyonlarının HIO'larda düşük ve HCO'larda yüksek olduğu bulundu. HCO epitelinin uygun şekilde paternlenip desenlenmediğini belirlemek için SATB2, CDX2 ve CDH1 için immünofloresan boyama yapıldı.

generation-maintenance-characterization-human-pluripotent-stem-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

İnce bağırsak kriptlerinden insan enteroidlerini ve hem cerrahi dokudan hem de biyopsilerden toplanan kolon kriptlerinden kolonoidleri oluşturmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu metodolojik makalede, insan enteroidlerinin ve kolonoidlerinin başarılı bir şekilde büyümesi ve sürdürülmesi için gerekli olan kültür modalitelerini sunuyoruz.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

Bu iletişim kuralı insan bağırsak organoids floresan mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı aşağıdaki farmakolojik tedavide epitel bariyer geçirgenliği ölçümü açıklar ve cep mikroskobu canlı.

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Bu protokol, insan pluripotent hücrelerinin bağırsak organoidlerine farklılaşmasına izin verir. Protokol, hücreleri kesin endoderm, arka bağırsak endodermi ve ardından bağırsak epiteli popülasyonuna farklılaştırarak normal insan gelişimini taklit eder. Bu, protokolü hem bağırsak gelişimini hem de hastalık modelleme uygulamalarını incelemek için uygun hale getirir.

Gelişimsel ve Hastalık Modelleme Uygulamaları için hiPSC Kaynaklı Bağırsak Organoidlerinin Üretilmesi

Biyopsi kaynaklı intestinal organoidler ve çip üzerinde organ teknolojileri, bölgeye özgü bağırsak işlevselliğini özetlemek için mikrofizyolojik bir platformda birleştirilir.

Bağırsak Bölgesine Özgü İşlevselliği Modellemek için İnsan Organoidlerini ve Çip Üzerinde Organ Teknolojisini Birleştirme

Murin ince bağırsak kriptlerini ve kültür bağırsak 3D organoidlerini kriptlerden izole etmek için bir protokol tarif ediyoruz. Ek olarak, bir alt epitelyal hücresel nişin yokluğunda tek bir bağırsak kök hücresinden organoidler üretmek için bir yöntem tarif ediyoruz.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

Burada, sıçan bağırsak organoidleri üretmek ve bunları birkaç aşağı akış uygulamasında kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Sıçanlar genellikle tercih edilen bir klinik öncesi modeldir ve sağlam bağırsak organoid sistemi, in vivo çalışmalara eşlik edecek bir in vitro sistem ihtiyacını karşılar.

Sıçan Bağırsak Organoidlerinin Üretimi ve Manipülasyonu

Organoidler, hastalık modellemesi için değerli araçlar haline geldi. Hücre dışı matris (ECM), organoid üretimi sırasında hücre kaderini yönlendirir ve doğal dokuya benzeyen bir sistem kullanmak model doğruluğunu artırabilir. Bu çalışma, hayvan kaynaklı ECM ve kseno içermeyen hidrojellerde indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilmiş insan bağırsak organoidlerinin üretimini karşılaştırmaktadır.

İnsan Kök Hücre Bakımı ve Bağırsak Organoid Üretimi için Bazal Membran Matrislerinin Karşılaştırmalı Çalışması

Doğal insan bağırsağının yapısını ve işlevini daha iyi özetlemek için insan bağırsak organoidleri innerve edilmelidir. Burada, bir enterik sinir sistemini bu yapılara dahil etmek için bir yöntem sunuyoruz.

İnsan Bağırsak Organoidlerinin İnnervasyonu

Burada, standart matris gömülü organoid kültürlerinden apikal bağırsak organoidleri oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, EdU'nun daha sonra aktif olarak çoğalan hücrelere dahil edilmesini ve EdU-pozitif hücrelerin yarı otomatik olarak nicelleştirilmesini ana hatlarıyla belirtir.

Apikal Out İntestinal Organoidlerin Oluşumu ve EdU-Etiketleme Kullanılarak Organoid Proliferasyon Hızının Değerlendirilmesi

Biz kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri ve yama-aracılı sitokin teslimat hücre enjeksiyon birleştirerek nakledilen hücrelerin bütünleşmesini geliştiren bir dağıtım yöntemi, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt etmek için, üç yeni ve daha etkin protokollere sunuyoruz.

Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş

Öğrenin, insan pluripotent kök hücrelerinden bağırsak ve kolonik organoid üretim, bakım ve karakterizasyon yöntemlerini. Bu protokoller, gastrointestinal araştırmalarda tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği artırır.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet