Name: SCAD Testi Kullanarak Yara İzi Gelişimini Görselleştirme - Ex-situ Cilt Yara İzi Tahlili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Öğrenin, SCAD testi ile cilt yara izi gelişimini görselleştirmeyi ve fibroblast göçünü incelemeyi. Bu yöntem, yüksek verimli tarama ve terapötik stratejiler geliştirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SCAD metodolojisinin geliştirilmesine katkıda bulundukları için Jiang et al. 2020'nin tüm ortak yazarlarına teşekkür ederiz13. Dr. Steffen Dietzel'e ve Ludwig-Maximilans-Universität'teki Biyogörüntüleme çekirdek tesisine Multiphoton sistemine erişim için teşekkür ederiz. Y.R., Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), Avrupa Araştırma Konseyi Konsolidatör Bursu (ERC-CoG 819933) ve LEO Vakfı (LF-OC-21-000835) tarafından desteklenmiştir.

Aşağıda sunulan model, Jiang ve ark., 202013'te kısaca açıklandığı gibi SCAD testinin oluşturulmasının ayrıntılı bir adım adım açıklamasını sunmaktadır. SCAD numune hazırlıkları, uluslararası ve Yukarı Bavyera Hükümeti yönergelerine uygun olarak hayvanlar kurban edildikten sonra gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar, Münih Helmholtz Merkezi'nin hayvan tesisinde barındırıldı. Odalar, 12 saatlik bir ışık döngüsü ile optimum nem ve sabit sıcaklık ile korunmuştur. Hayvanlara yiyecek ve su ad libitum sağlandı.
1. SCAD doku hazırlığı
<ol><li>Yenidoğan yavruları doğum sonrası gün 0 veya 1. günde (P0 veya P1) kurban edin.</li>
	<li>Steril bir cerrahi neşter kullanarak iskelet kası tabakasına kadar en az 1,5 cm x 1,5 cm tam kalınlıkta dorsal sırt derisini dikkatlice tüketin.</li>
	<li>Steril kavisli forseps kullanarak cildi soyun ve yüzeysel fasyanın altta yatan panniculus karnoz kası ile bozulmamış olmasını sağlayın.</li>
	<li>Kirletici kanı temizlemek için eksize edilen dokuyu 50-100 mL soğuk DMEM/F-12 ortamı ile yıkayın.</li>
	<li>Doku ve hücre canlılığını korumak için Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>Cildi baş aşağı (üstte yüzeysel fasya) DMEM/F12 ortamı içeren 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Tek kullanımlık 2 mm'lik bir biyopsi punch kullanarak, tam kalınlıkta yuvarlak deri parçalarını tüketin, yüzeysel fasyanın SCAD dokuları oluşturmak için epidermise kadar altta yatan panniculus karnozus kası ile bozulmamış olmasını sağlayın.</li>
	<li>% 10 FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM esansiyel olmayan amino asitler ve 1x Penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 200 μL DMEM / F12 (fenol kırmızısı olmadan) komple medya-DMEM / F12 ortamını hazırlayın ve 96 delikli bir plakanın bireysel kuyucuklarına doldurun.</li>
	<li>Steril forseps kullanarak, bireysel SCAD dokusunu dikkatlice aktarın ve 96 delikli bir plakanın kuyularına baş aşağı (fasyaya bakacak şekilde) tamamen batırın.</li>
	<li>Plakayı standart koşullar altında tutulan bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın (37 ° C,% 21 (v / v) oksijen,% 5 (v / v) C02 ve% 95 nem).</li>
</ol>2. SCAD - Doku kültürü
<ol><li>Kültür SCAD'leri bir inkübatörde 5 güne kadar.</li>
	<li>Kültürün 2. ve 4. günlerinde, hücre ve doku canlılığı koşullarının devam etmesini sağlamak için medyayı 200μl taze önceden ısıtılmış DMEM / F12 komple medya ile değiştirin. Her ortam değişikliği sırasında arıtma bileşiklerini değiştirin. NOT: Dokuların kuyucuklara yapışmasını önlemek için kuyuda 10 μL ortam bıraktığınızdan emin olun.</li>
	<li>SCAD'leri aşağıdaki deneyler için hazırlayın: Canlı görüntüleme (bölüm 3) ve Doku Toplama ve 2D / 3D immünofloresan boyama (bölüm 4).</li>
</ol>3. SCAD'lerin canlı görüntülenmesi
<ol><li>Bir cam şişede PBS'de en az 30 mL% 2-3% (w / v) düşük erime noktalı agaroz çözeltisini, kaynayana kadar bir mikrodalgada ısıtarak hazırlayın.</li>
	<li>Hemen şişeyi aktarın ve sıvı agaroz çözeltisini 40 ° C'lik bir su banyosunda soğutun.</li>
	<li>SCAD dokusunu fasya/yara izi yukarı bakacak şekilde 35 mm'lik bir kabın ortasına aktarın.</li>
	<li>SCAD'yi oda sıcaklığında (RT) 40 °C sıvı agarozu bir Pasteur pipet kullanarak 35 mm'lik kabın üzerine yavaşça aktararak yerleştirin. Agaroz 2 dakika içinde polimerize olur.</li>
	<li>2 mL önceden ısıtılmış DMEM / F12 tam ortam ekleyin (fenol kırmızı göstergesi olmadan).</li>
	<li>37 °C, %21 (v/v) oksijen, %5 (v/v) C0 2 ve %95 neme ayarlanmış uygun bir inkübasyon sistemi ile donatılmış bir konfokal veya çoklu foton mikroskop kullanarak 48 saate kadar 0. gün SCAD'lerinin hızlandırılmış görüntülerini eldeedin.</li>
</ol>4. Doku hasadı ve 2D / 3D immünofloresan boyama
<ol><li>Ortamı steril PBS ile değiştirerek dokuları ilgili zaman noktalarında yıkayın.</li>
	<li>Steril forseps kullanarak, dokuları gece boyunca 4 ° C'de sabitlemek için bireysel SCAD'leri 500 μL% 2 paraformaldehit içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine dikkatlice aktarın.</li>
	<li>Dokuları PBS ile üç kez yıkayın ve 2D / 3D immünofloresan boyama işlemine devam edin.</li>
	<li>3D immünofloresan boyama<ol>
<li>RT'de 24 saat boyunca% 0.2 jelatin,% 0.5 Triton-X100 ve% 0.01 Thimerosal (PBSGT) ile desteklenmiş 500 μL PBS içeren 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde inkübe ederek dokuları geçirgenleştirin.</li>
		<li>Üreticinin talimatlarına göre yeterli miktarda birincil antikor hazırlayın ve SCAD dokularını RT'de 24 saat boyunca 150 μL PBSGT çözeltisinde inkübe edin. NOT: İmmün floresan için optimal antikor konsantrasyonu üretici tarafından bildirilmemişse, kontrol dokularında farklı konsantrasyonlar kullanılarak (örneğin, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000) önceden antikor titrasyonu yapılmalıdır.</li>
		<li>İlişkisiz primer antikoru çıkarmak için SCAD'leri PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.</li>
		<li>RT'de bir gecede PBS'de 1:1000 ilgili Alexa Fluor sekonder antikorları ile dokuyu inkübe edin.</li>
		<li>Fazla bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için dokuyu PBS'de 30 dakika boyunca üç kez nazikçe yıkayın.</li>
		<li>Konfokal veya multifoton görüntüleme için dokuyu 35 mm'lik cam tabanlı bir kaba aktarın. NOT: Suya daldırma hedeflerini kullanırken, görüntü elde etme sırasında sürüklenmeyi önlemek amacıyla dokuyu hareketsiz hale getirmek için SCAD'leri %2 düşük erime noktası agarozuna yerleştirin</li>
	</ol>
</li>
	<li>2D immünofloresan boyama<ol>
<li>Dokuyu bir kriyo-kalıba aktarın ve dokuyu tamamen daldırmak için optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile yavaşça doldurun.</li>
		<li>Dokunun yönünü yavaşça ayarlayın, bir enine kesit veya dikey bir bölüm elde etmek için hava kabarcıklarının olmamasını sağlayın.</li>
		<li>Kalıbı 20-30 dakika kuru buz üzerine yerleştirin ve bloğu gece boyunca -80 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Bıçak sıcaklığını -25 °C'ye ve numune bloğu sıcaklığını -17 °C'ye ayarlayın. Bir kriyostat kullanarak 6 μm kriyoseksiyon hazırlayın, bölümleri bir yapışma slaydına aktarın ve slaytları -20 °C dondurucuda saklayın.</li>
		<li>Slaytları PBS'de üç kez durulayın ve slaytları PBST'de (% 0.05 Ara ile desteklenmiş PBS) 1 saat boyunca% 5 Sığır Serum Albümini (BSA) ile inkübe edin.</li>
		<li>150μl PGST'ye uygun miktarda birincil antikor ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin NOT: İmmün floresan için optimal antikor konsantrasyonu üretici tarafından bildirilmemişse, kontrol bölümlerinde farklı konsantrasyonlar kullanılarak (örneğin, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000, 1:1000) önceden antikor titrasyonu yapılmalıdır.</li>
		<li>İlişkisiz birincil antikoru çıkarmak için bölümleri PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.</li>
		<li>PBS'de 1:1000 ilgili Alexa Fluor sekonder antikorları ile dokuyu RT'de 2 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Fazla bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için dokuyu PBS'de 5 dakika boyunca üç kez nazikçe yıkayın.</li>
		<li>Slaytları DAPI içeren bir montaj ortamıyla monte edin ve slaytları RT'de karanlıkta kurulayın.</li>
		<li>Bölümleri bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Longaker, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+skin+wounds+in+the+fetal+environment+heal+with+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation.</a> Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).</li>
<li>desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+wound+healing%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and wound healing: an update.</a> Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).</li>
<li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).</li>
<li>Tripathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+scars+and+keloids%3A+a+review+and+current+treatment+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities.</a> Biomedical Dermatology. 4, 11(2020).</li>
<li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing--Aiming+for+perfect+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276 (5309), 75-81 (1997).</li>
<li>Correa-Gallegos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+repair+of+deep+wounds+by+mobilized+fascia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patch repair of deep wounds by mobilized fascia.</a> Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).</li>
<li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+wounds+and+its+burden%3A+An+updated+compendium+of+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).</li>
<li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), 2151(2015).</li>
<li>Leavitt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prrx1+fibroblasts+represent+a+pro-fibrotic+lineage+in+the+mouse+ventral+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis.</a> Cell Reports. 33 (6), 108356(2020).</li>
<li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li>
<li>Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparisons+of+the+morphology%2C+migration%2C+cell+adhesions%2C+and+actin+cytoskeleton+of+fibroblasts+in+four+different+three-dimensional+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li>
<li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653(2020).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807(2021).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+wound+healing%3A+an+emphasis+on+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%3A+Official+Journal+of+International+Society+for+Bioengineering+and+the+Skin+%28ISBS%29+%5Band%5D+International+Society+for+Digital+Imaging+of+Skin+%28ISDIS%29+%5Band%5D+International+Society+for+Skin+Imaging+%28ISSI%29%22%5BJournal%5D)">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li>
<li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+Animal+models+of+wound+healing%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li>
</ol>

Tüm yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan eder.

Yaralanma sonrası skar oluşumunu anlamak için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bu konuda birçok ilerleme kaydedilmesine rağmen, gerçek mekanizmalar hala net değildir. Önceki tekniğin aksine, SCAD modeli tüm hücre tiplerini ve kutanöz tabakaları içerir, böylece doğal cildin karmaşıklığını korur18,19. Bu metodoloji, skar oluşumunu yönlendiren moleküler mekanizmaları anlamada önemli olan temel veri kümeleri üretebilir. Tahlil, basit, minimalist, ancak fibroblast m...

Yara iyileşmesi, ihlal edilen yaraların restorasyonu sürecidir. Omurgasızlarda doku yaralanmaları kısmi veya tam rejenerasyonla sonuçlanır. Buna karşılık, memeliler derin yaralanmalara yara izi bırakarak yanıt verirler; bu, ihlal edilen alanı en aza indiren ve aynı zamanda yaralı bölgeyi kalıcı olarak deforme eden yoğun matris lifleri tıkaçları ile yaraları hızlı bir şekilde kapatmak için uyarlanmış bir süreç 1,2,3. Memelilerde büyük deri yanıkları veya derin açık yaralar, hipertrofik veya keloid skarlar gibi patolojik fenotiplere neden olur 4,5. Bu coşkulu yara izleri, klinik ve küresel sağlık sistemleri üzerinde muazzam bir yüke neden olmaktadır. Sadece ABD'de, yara izi yönetimi yıllık yaklaşık 10 milyar dolara mal oluyor 6,7. Bu nedenle, skar oluşumunda rol oynayan temel süreçleri ve mekanizmaları daha iyi anlamak için ilgili metodolojilerin geliştirilmesi gerekmektedir.
Son yıllarda, farelerde yapılan çok çeşitli çalışmalar, belirli cilt bölgelerindeki kökenlerine bağlı olarak farklı fonksiyonel potansiyellere sahip heterojen fibroblast popülasyonlarını ortaya koymuştur 8,9,10. Arka deride, Rinkevich ve ark., 2015, EPF (Engrailed pozitif fibroblast) olarak adlandırılan Engrailed-1'in (En1) erken embriyonik ekspresyonuna sahip spesifik bir fibroblast popülasyonunun, yaralanma üzerine kutanöz skarlaşmaya katkıda bulunduğunu tanımlamıştır. Tersine, engrailed ekspresyon öyküsü olmayan başka bir fibroblast soyu olan Engrailed negatif fibroblast (ENF), skar oluşumuna katkıda bulunmaz8. R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) gibi floresan muhabir fare çizgilerine çapraz Cre-driven transgenik fare çizgileri kullanılarak bu En1 soylarının kader haritalanması, EPF ve ENF popülasyonlarının görselleştirilmesine olanak tanır.
Fibroblast göçünü birkaç gün boyunca in vivo olarak incelemek, etik ve teknik kısıtlamalarla sınırlıdır. Ayrıca, skarlaşmada rol oynayan yolları modüle etmek için bileşik, viral ve nötralize edici antikor kütüphanesi ekranları teknik olarak zordur. Daha önce kullanılan in vitro veya ex vivo modeller, gerçek cilt mikro ortamlarında fibroblast göçünü ve skar oluşumunu, skar gelişiminde homojenliği ve in vivo cilt ortamlarını taklit eden doku karmaşıklığını görselleştirme yeteneğinden yoksundur 11,12. Yukarıdaki sınırlamaların üstesinden gelmek için, SCAD (Bir Çanakta SCar benzeri doku) 13,14 olarak adlandırılan bir ex vivo skar testi geliştirdik. Bu basit tahlil, epidermis, dermis ve deri altı fasya bölgelerini içeren 2 mm tam kalınlıkta cildin eksize edilmesi ve serum takviyeli DMSO ortamında 5 güne kadar kültürlenmesiyle gerçekleştirilebilir. SCAD'den üretilen skarlar, in vivo skarların transkriptomik ve proteomik özelliklerini güvenilir bir şekilde çoğaltır. Ek olarak, floresan muhabir fare çizgileriyle kesişen ilgili transgenik fare çizgilerinden (örneğin, En1 fareler) üretilen SCAD'ler, fibroblast göç dinamiklerinin ve yara izi gelişiminin benzeri görülmemiş bir çözünürlükte görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca, bu model herhangi bir yüksek verimli uygulama için kolayca uyarlanabilir (örneğin, bileşik kütüphanesi, antikor kütüphanesi veya viral tarama)13,14. Bu makalede, skar gelişiminde hücresel ve matris dinamiklerini incelemek için SCAD'ler ve ardından aşağı akış işleme uygulamaları oluşturmak için optimize edilmiş bir protokolü açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>% 10 Tween 20, Noniyonik Deterjan</td><td>Biorad Laboratuvarları</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini, Soğuk etanol fract</td><td>Sigma</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, fenol kırmızısı-500 mL</td><td>LIFE Technologies</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Gibco</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Cryostar NX70 Kriyostat</td><td>Termo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epredia SuperFrost Plus Yapışma slaytları</td><td>Fisher scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>Yapışma slaytları</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ısı inaktive edilmiş, AB onaylı, Güney Amerika Menşei-500 mL</td><td>LIFE Technologies</td><td>&nbsp; </td><td></td>10500064</tr><tr>DAPI <td>Life Technologies</td><td>ile Fluoromount-G</td><td>00 4959 52</td><td>DAPI Forsepsli montaj ortamı</td></tr>, <tr><td>kılavuz pimli ince noktalarla kavislipaslanmaz çelik (cımbız)125 mm uzunluk</td><td>Fisher Scientific</td><td>12381369</td><td></td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin</td><td>Sigma</td><td>G2500-100G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi-100 mL</td><td>LIFE Technologies</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, kalsiyum, magnezyum, fenol içermez kırmızı-500 mL</td><td>LIFE Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>CO2 ve O2 için Ibidi Gaz inkübasyon sistemi</td> <td>Ibidi</td><td>11922</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Isıtma sistemi</td><td>Ibidi</td><td>10915</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 dik mikroskop - Multifoton uyarma 680&ndash; 1300 nm</td><td>Leica</td><td></td><td>25x suya daldırma objektifi ile donatılmıştır (HC IRAPO L 25x/1.00&thinsp; W) ayarlanabilir bir lazerle (Spectra-Physics, InSight DS&thinsp;+&thinsp; Tek)</td></tr> <tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>LIFE Technologies</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agaroz, 25 g</td><td>Biozym / Lonza</td><td>859081</td><td></td></tr><tr><td>OCT Gömme Matrisi</td><td>Carlroth</td><td>6478.1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit, %16 W/V AQ. 10 x10 mL</td><td>VWR Uluslararası</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td><td>Stiefel</td><td>270130</td><td></td></tr><tr><td>Düz Keskin/Keskin Diseksiyon Makası 11.4 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>15654444</td><td></td></tr><tr><td>Thimerosal Bioxtra, %97&ndash; % 101</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8784-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axioimager M2 dik mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

scad testi kullanarak yara İzi gelişimini görselleştirme - ex-situ cilt yara İzi tahlili

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Memelilerin derin doku yaralarının kapatılmasına verdiği küresel yanıt, özel fasya fibroblastlarının aracılık ettiği skar oluşumu ve doku kasılması yoluyladır. Yara izi oluşumunun ve bozulmuş yara iyileşmesinin klinik önemine rağmen, yara iyileşmesinde fasya fibroblast dinamiklerini anlamamız, fibroblast koreografisinin ve dinamiklerinin cilt yaraları gibi karmaşık ortamlarda doğrudan görselleştirilmesini sağlayan ilgili testlerin bulunmaması nedeniyle üstünkörüdür. Bu yazıda, cilt yaralarının karmaşık ortamını taklit eden SCAD veya "Bir Çanakta SCar benzeri doku" kullanılarak ex-situ cilt izleri oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlilde, 2 mm tam kalınlıkta cilt eksize edilir ve 5 gün boyunca ortamda baş aşağı kültürlenir, bu süre zarfında yara izleri ve cilt kontraktürleri eşit olarak gelişir. Bu metodoloji, fibroblast soyuna özgü transgenik fare modelleri ile birleştiğinde, tüm yara onarım süreci boyunca bireysel fibroblast soylarının görselleştirilmesini sağlar. Genel olarak, bu protokol araştırmacıların yara onarımının temel süreçlerini ve mekanizmalarını anlamalarına, modülatörlerin yara iyileşmesi sonuçları üzerindeki etkilerini doğrudan keşfetmelerine yardımcı olur.

SCAD'lerin üretimi üç temel adıma ayrılabilir: P0-P1 farelerinden arka cildin toplanması, tam kalınlıkta biyopsi punchlarının üretilmesi ve ardından 96 kuyucuklu plakalarda 5 güne kadar bireysel scads kültürü. Bir okuma olarak, bu tahlil yara izinin mekansal ve zamansal yönlerini analiz etmek için daha fazla uygulanabilir. Uzamsal analiz, gelişmekte olan skar dokusundaki hücresel ve matris bileşenlerinin mekansal lokalizasyonunu incelemek için dokuların 2D ve 3D bağışıklık etiketlemesini kullanır. Mekansal zamansal çalış...

Bu protokol, "Bir Çanakta SCar benzeri doku" veya SCAD olarak adlandırılan bir cilt-fasya eksplantının oluşumunu tanımlar. Bu model, skar oluşumu sırasında tek fibroblastların benzeri görülmemiş bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.

SCAD Testi Kullanarak Yara İzi Gelişimini Görselleştirme - Ex-situ Cilt Yara İzi Tahlili

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

Daha önce in vitro veya ex vivo modellerde dermal hücre bileşenleri ve cilt dokusunun karmaşıklığı yoktur. Bu ex situ SCAD testi, belirli bir sınırlamanın üstesinden gelir ve yaralı hayvanın dışındaki yara izlerinin gelişiminin incelenmesini sağlar. SCAD testi, cilt mikro ortamlarında fibroblast göçünün ve skar oluşumunun görselleştirilmesini sağlar.Skar oluşumunun mekanik temelini anlamak için aktivatörlerin veya inhibitörlerin tarama kütüphanelerini sağlar. Temel süreci ve yara onarımında yer alan molekül seyrini anlamada SCAD modelini kullanan düz kütüphanelerin yüksek verimli tarama testleri. SCAD testinin cilt eksplantları kullanılarak gerçekleştirilmesi kolaydır.Tutarlı bir yara izi için, doğum sonrası sıfır gün veya birinci gün cildinin seçilmesi önerilir. Doğum sonrası sıfır veya birinci gün yenidoğan yavruyu feda ettikten sonra, iskelet kası tabakasına kadar 1.5 x 1.5 santimetre tam kalınlıktaki dorsal sırt derisini dikkatlice çıkarmak için steril bir cerrahi neşter kullanın. Steril kavisli forseps kullanarak cildi soyun ve yüzeysel fasyanın altta yatan panniculus karnoz kası ile bozulmamış olmasını sağlayın.Kirletici kanı çıkarmak için eksize edilen dokuyu 50 ila 100 mililitre soğuk DMEM F-12 ortamı ile yıkayın. Ardından, doku ve hücre canlılığını korumak için dokuyu Hanks dengeli tuz çözeltisi ile yıkayın. DMEM F-12 ortamı içeren 10 santimetrelik bir Petri kabında cildi yüzeysel fasyayla baş aşağı yerleştirin.Daha sonra, tek kullanımlık iki milimetrelik bir biyopsi punch kullanarak, kabuklu dokular oluşturmak için tam kalınlıkta yuvarlak deri parçalarını tüketin, yüzeysel fasyanın epidermise kadar altta yatan panniculus karnozus kası ile bozulmamış olmasını sağlayın. 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna fenol kırmızısı olmadan 200 mikrolitre taze DMEM F-12 tam ortam ekleyin. Steril forseps kullanarak, bireysel kabuklu dokuyu baş aşağı 96 delikli bir plakanın kuyularına aktarın ve tamamen batırın.Plakayı standart koşullar altında tutulan bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Kültürün ikinci ve dördüncü günlerinde, kuyuda 10 mikrolitre bırakan ortamı çıkarın ve devam eden hücre ve doku canlılık koşullarını korumak için tedavi bileşikleriyle birlikte taze önceden ısıtılmış DMEM F-12 tam ortamı ekleyin. SCAD'lerin canlı görüntülenmesi için, bir mikrodalga fırında ısıtılarak bir cam şişede PBS'de 30 mililitre 2 ila% 3 düşük erime noktalı agaroz çözeltisi hazırlayın.Kaynattıktan sonra, şişeyi hemen aktarın ve sıvı agaroz çözeltisini 40 santigrat derecelik bir su banyosunda soğutun. Daha sonra, SCAD dokusunu fasya veya yara izi yukarı bakacak şekilde 35 milimetrelik bir kabın merkezine aktarın. Ardından, 1000 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak 40 santigrat derece sıvı agarozu yavaşça dokuya dökerek SCAD'yi oda sıcaklığında gömün.Agarose iki dakika içinde polimerize olur. Polimerizasyondan sonra, iki mililitre önceden ısıtılmış DMEM F-12 tam ortam ekleyin. Daha sonra, makalede açıklanan uygun inkübasyon sistemleriyle donatılmış bir konfokal veya çoklu foton mikroskobu kullanarak, sıfır gününden birinci güne kadar hızlandırılmış görüntüler elde edin.Doku hasadı için, ortamı steril PBS ile değiştirerek dokuları ilgili zaman noktalarında yıkayın. Steril forseps kullanarak, dokuları gece boyunca dört santigrat derecede sabitlemek için her SCAD'yi 500 mikrolitre% 2 paraformaldehit içeren 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ertesi gün, metin yazısında açıklandığı gibi iki veya üç boyutlu immünofloresan boyamaya geçmeden önce dokuları PBS ile üç kez yıkayın.SCAD'lerin sıfır ve beşinci günlerdeki temsili tam montajlı parlak alan görüntüleri burada gösterilmektedir. Masson'un dikey doku kesitlerini trikrom boyaması, sıfır ve beş günlerinde skar çekirdeğinde doku skarlaşması, doku kasılması ve hücre dışı matriks birikiminin imzalarını ortaya koymaktadır. SCAD'lerin sıfır ve beş günlerinde immünofloresan boyaması gösterilmiştir.Erken ve geç evre skardan, kökleşmiş pozitif fibroblast yeşil ve kökleşmiş negatif fibroblast kırmızı renkte gösterilir. Üç boyutlu görüntüleme için, dokular agaroz çözeltisine gömüldü ve PBSGT ile kaplandı. Temsili görüntüler, N-kadherin proteininin beş günlük SCAD'nin skar bölgesinde özel lokalizasyonunu göstermektedir.Bir inkübasyon odası ile donatılmış üç boyutlu hızlandırılmış görüntüleme kurulumu, fibroblast sürülerinin ilk 12 saat boyunca veya skar gelişiminin erken aşamalarında ilerlemesinin erken olaylarını gösterdi. Bireysel fibroblastların skar gelişimi üzerindeki tek hücreli izlenen hücresel yörüngelerinin grafiksel gösterimi burada sunulmuştur. SCAD dokusunu kuyu plakasının içine baş aşağı yerleştirmek çok önemlidir, böylece fasyanın yukarı bakması sağlanır.Bunun yapılmaması, geçiş modellerinde kaçınılmaz değişikliklere neden olur. Bu prosedür, kimyasal modülatörler, nötralize edici antikorlar veya viral yöntemler kullanarak tedaviler veya kültür için dermal tabakaların incelenmesine izin verir. Bu, çeşitli tıbbi ortamlarda patolojik fibrotik yanıtların değerlendirilmesinde yardımcı olur.Konneksin-43 ve N-kadherinin ekspresyonunu, yaralama üzerine fasya mobilizasyonunda rol oynayan anahtar moleküller olarak gösterdik. SCAD metodolojisi, skarlaşmayı ve fibrozu azaltmak için yeni terapötik stratejilerin tanımlanmasına izin verir.

visualizing-scar-development-using-scad-assay-an-ex-situ-skin

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Vaskülarizasyon başarılı doku mühendisliği yaklaşımları anahtarıdır. Bu nedenle, güvenilir teknolojileri doku yapıları vasküler ağların gelişimini değerlendirmek için gereklidir. Burada görselleştirmek ve in vivo damarlanmayı ölçmek için basit ve maliyet-etkin bir yöntem mevcut.

A Tam Cilt Hata Modeli Biyomateryallerin vaskülarizasyonunu değerlendirin<em&gt; In Vivo</em

Memeli gelişimi sırasında, erken gebelik derisi yaraları iz bırakmadan iyileşir. Burada, E16.5 (yara izi) ve E18.5 (yara izi bırakan) fare embriyolarının kutanöz dorsumunda güvenilir ve tekrarlanabilir bir fetal skarsız yara iyileşmesi modelini detaylandırıyoruz.

Scarless Yara Repair Fare Fetal Cilt Modeli

Göç etme kapasitesi, mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler) dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinin temel bir işlevidir. Bununla birlikte, hasardan sonra göç kapasitesindeki değişiklikleri ölçmek zordur. Bu protokol, hasardan sonra MSC göç kapasitesindeki değişiklikleri ölçmek için titiz istatistikler kullanan, kolayca uyarlanabilir bir geçiş testini açıklar.

Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Bu çalışmada bir vitro modeli (arsenik etkisi hücresel geçiş gibi nasıl çevre kirletici maddeleri belirlemek için yara iyileşme sıfırdan testin) bir mekanizma olarak odaklanır. Bu içinde vitro tahlil değişiklikleri için in vivo deneyler önce hücresel göç hızlı ve erken belirtileri sağlar sonuçlar gösterilmektedir.

Vitro Cilt hücre göç arsenik etkilerini göstermek için tahlil kaşı

Burada, primer fibroblastlar kullanarak in vitro çizik testve farelerde in vivo deri yara iyileşmesi test için bir protokol salıyoruz. Her iki tahliller in vitro ve in vivo yara iyileşmesini değerlendirmek için basit yöntemlerdir.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Bu protokol, in vivo koşullarına benzeyen bir in vitro insan hipertrofik skar dokusu modeli oluşturmak için makromoleküler kalabalık kullanımını açıklar. Kalabalık bir makromoleküler ortamda ekili zaman, insan deri fibroblastlar fenotipleri, biyokimya, fizyoloji ve skar dokusu andıran fonksiyonel özellikleri sergiler.

Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli

Cilt içindeki farmasötik bileşikleri görselleştirmek ve ölçmek için tutarlı bir Raman saçılma görüntüleme metodolojisi açıklanmaktadır. Bu yazıda deri dokusu hazırlığı (insan ve fare) ve topikal formülasyon uygulaması, uzaysal zamansal konsantrasyon profillerini ölçmek için görüntü elde etme ve topikal ilaç dağıtımını değerlendirmek için ön farmakokinetik analiz açıklanmaktadır.

Tutarlı Raman Saçılma Görüntüleme Kullanarak Ciltteki Farmasötik Bileşiklerin Görselleştirilmesi ve Ölçülmesi

Bu çalışma, iki boyutlu (2D) çizik yara migrasyon testini ve üç boyutlu (3D) küresel filizlenme testini, RNA ekstraksiyonu ve immünositokimya dahil olmak üzere ilgili aşağı akış analiz yöntemleriyle birlikte, in vitro anjiyogenezi incelemek için uygun testler olarak sunmaktadır.

Çizik Yara Migrasyon Testi ve Sferoid Filizlenme Testinden Yararlanarak Anjiyogenezin Fonksiyonel ve Moleküler Düzeyde İncelenmesi

Bu protokol, insan benzeri yara izini simüle etmek için mekanotransdüksiyon sinyalini artıran bir hipertrofik yara izi oluşturan murin modelinin nasıl oluşturulacağını açıklayacaktır. Bu yöntem, bir farede iyileşen bir kesi boyunca mekanik gerilimi artırmayı ve ayrıntılı histolojik ve biyoinformatik analizler için tekrarlanabilir, aşırı skar dokusu oluşturmak için özel bir cihaz kullanmayı içerir.

Mekanotransdüksiyon Odaklı, İnsan Benzeri Hipertrofik Yara İzinin Bir Fare Modeli

Burada, cilt segmentasyonu için ücretsiz bir ImageJ tabanlı makro olan SCAnED kullanarak cilt bölümlerindeki bağışıklık ve bağışıklık olmayan hücreleri tanımlamak ve ölçmek için yarı otomatik bir protokol sunuyoruz.

SCAnED - Epidermal ve Dermal Cilt Bölmelerinde Yarı Otomatik Hücre ve Çekirdek Tespiti için Açık Kaynaklı Bir Cilt Segmentasyon Makrosu

Öğrenin, SCAD testi ile cilt yara izi gelişimini görselleştirmeyi ve fibroblast göçünü incelemeyi. Bu yöntem, yüksek verimli tarama ve terapötik stratejiler geliştirmeye olanak tanır.

SCAD Testi Kullanarak Yara İzi Gelişimini Görselleştirme - Ex-situ Cilt Yara İzi Tahlili

Daha fazla video keşfet