Name: Mitokondriyal Morfolojinin Simülasyon Denetimli Öğrenme Yoluyla Analiz Edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T12:05:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Öğrenin, simülasyon denetimli makine öğrenmesiyle floresan mikroskobisi görüntülerinde mitokondri morfolojisini nasıl otomatik olarak analiz edebilirsiniz. Bu yöntem, manuel açıklama gerektirmeden segmentasyon doğruluğunu artırır ve hücre biyolojisi araştırmalarında önemli uygulamalara sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Arif Ahmed Sekh ile yapılan tartışmayı kabul ediyorlar. Zambarlal Bhujabal, kararlı H9c2 hücrelerinin oluşturulmasına yardımcı olduğu için kabul edilmektedir. Aşağıdaki fonları kabul ediyoruz: ERC başlangıç hibesi no. 804233 (K.A.'ya), Bilimsel Yenileme için Araştırmacı Projesi hibe no. 325741 (D.K.P.'ye), Kuzey Norveç Bölgesel Sağlık Otoritesi hibe no. HNF1449-19 (Å.B.B.) ve UiT'in Cristin Project ID 2061348 ile tematik finansman projesi VirtualStain (D.K.P., Å.B.B., K.A. ve A.H.).

NOT: Bölüm 1-4, bilinen deneysel koşullara sahip mitokondrinin mevcut mikroskopi görüntüleriyle çalışıyorsa atlanabilir.
1. Hücre kültürü
<ol><li>DMEM'deki H9c2 hücrelerini, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM galaktoz,% 10 FBS,% 1 streptomisin / penisilin ve 1 μg / mL puromisin ile desteklenmiş glikoz takviyesi olmadan büyütün. Deneylerden önce hücrelerin kültürde en az 7 gün boyunca galaktoza adapte olmasına izin verin. NOT: Burada kullanılan H9c2 hücreleri, floresan mitokondrileri eksprese etmek için genetik olarak modifiye edilmiş ve ayrıca bir puromisin direnç geni edinmiştir. Bu antibiyotiğin eklenmesi, direnç geni ve dolayısıyla floresan mitokondri ile hücrelerin büyümesini sağlar.</li>
	<li>Hücre akıcılığı yaklaşık% 80'e ulaştığında deney için H9c2 hücrelerini tohumlayın (parlak alan mikroskobu ile değerlendirilen T75 kültür şişesi). Devam etmeden önce ortamı ve tripsin miktarını en az 15 dakika boyunca 37 ° C'ye ısıtın. NOT: Deneyi iki veya daha fazla farklı hücre kültürü koşuluna paralel olarak gerçekleştirmek mümkündür. Miyoblastik hücrelerin kaybını önlemek için H9c2 hücre akıtması% 80'in üzerinde olmamalıdır. % 100 akıcılıkta, hücreler miyotüpler oluşturur ve farklılaşmaya başlar.</li>
	<li>Steril bir laminer akış başlığında çalışan hücreleri, 12 kuyucuklu bir plakanın kuyusuna her deneysel durum için #1.5 cam bir kapak parçası yerleştirerek tohumlamaya hazırlanın. Her koşulu ve deneysel ayrıntıları 12 delikli plaka üzerinde etiketleyin.</li>
	<li>Hücre kültürü şişesini inkübatörden davlumbazdaki çalışma yüzeyine taşıyın. Bir aspirasyon sistemi veya elektronik pipet kullanarak ortamı aspire edin ve ardından 5 mL PBS (oda sıcaklığı) ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış tripsini çalışma yüzeyine taşıyın ve son PBS yıkamasını aspire edin; Daha sonra, hücreleri ayırmak için önceden ısıtılmış tripsin ekleyin (T75 kültür şişesi için 1 mL). Kültür şişesini 37 ° C'de 2-3 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış ortamı, inkübasyonun sonuna doğru çalışma yüzeyine taşıyın. Hücrelerin parlak alan mikroskobu kullanarak ayrıldığını doğrulayın.<ol><li>Tüm hücreler ayrılmamışsa, kalan hücreleri ayırmak için şişenin yan tarafına birkaç dikkatli ama sağlam musluk uygulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kültür şişesini çalışma yüzeyine geri döndürün. Tripsin hareketini durdurmak için elektronik pipet kullanarak kültür şişesine 4 mL hücre kültürü ortamı ekleyin. Şişeye kültür ortamı eklerken, hücreleri ayırmak ve bir hücre süspansiyonuna toplamak için ortamı yüzey boyunca tekrar tekrar dağıtmak için pipeti kullanın.</li>
	<li>Şişeden hücre süspansiyonunu (5 mL) 15 mL'lik bir tüpe pipetleyin.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. Tüpü davlumbazda açın, süpernatantı aspirasyonla çıkarın ve hücre peletini 5 mL hücre kültürü ortamında yavaşça yeniden askıya alın.</li>
	<li>Otomatik bir hücre sayacında hücre süspansiyonunun küçük bir hacmini analiz ederek hücre sayısını değerlendirin. Kültür ortamının mililitresi başına canlı hücre sayısına dikkat edin.</li>
	<li>Yaklaşık 2 x 104 hücre/cm2'lik bir tohumlama yoğunluğu için hesaplanan hücre süspansiyonunun istenen hacmini (örneğin, kuyucuk başına 150 μL), önceden etiketlenmiş 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne taşıyın. Önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamını, kuyu sayısına bağlı olarak önceden hesaplanmış bir hacimde 15 mL santrifüj tüpüne ekleyin. 12 kuyucuklu plakalar için, her kuyucuk için toplam 1 mL hacim kullanın.</li>
	<li>Her bir kuyucuğa uygun hacmi dağıtmadan önce santrifüj tüpünün içeriğini birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek seyreltilmiş hücre süspansiyonunun düzgün bir şekilde karıştırıldığından emin olun. Hücre süspansiyonu kuyuya dağıtıldıktan sonra, hücreleri kuyucuklar boyunca daha iyi dağıtmak için plakayı her yönde dikkatlice kontrol edilen bir şekilde sallayın. 12 delikli plakayı ertesi güne kadar 37 ° C'de inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Büyümeyi değerlendirmek için hücreleri parlak alan mikroskobu ile kontrol edin. Hücreler yaklaşık% 80 akıcılığa kadar yeterli büyüme sağlamışsa, sonraki adımlara geçin; aksi takdirde, yeterli büyümeye ulaşılana kadar değerlendirmeyi günlük olarak tekrarlayın.</li>
</ol>2. Deneysel prosedür
<ol><li>Stok çözeltisi konsantrasyonlarına göre deney için gerekli malzemelerin miktarlarını hesaplayın. Dondurulmuş malzemeleri (30 mM CCCP stok çözeltisi) 37 ° C'de çözün ve hücre kültürü ortamını 37 ° C'de ön ısıtmaya ayarlayın.</li>
	<li>Çözüldükten sonra, stok çözeltisini (1:3.000) hücre kültürü ortamında seyrelterek 10 μM CCCP'lik bir çalışma çözeltisi oluşturun. NOT: Pipet hacimleri 1 μL'den küçük olmamalıdır.</li>
	<li>Gerekli tüm malzemeler hazırlandıktan ve önceden ısıtıldıktan sonra deneysel tedavilere başlayın. Hücre kültürü ortamını 12 delikli plakanın kuyucuklarından aspire edin ve ardından taze önceden ısıtılmış ortamı kontrol kuyularına ve önceden ısıtılmış ortamı 10 μM CCCP çözeltisi ile test durumu kuyularına hızlı bir şekilde uygulayın.</li>
	<li>12 delikli plakayı 37°C hücre inkübatöründe 2 saat boyunca inkübe edin. Kuluçka döneminde, fiksasyon çözeltisini hazırlayın.</li>
	<li>Fiksasyon çözeltisinin hazırlanması için,% 25 glutaraldehit (GA) stok çözeltisini% 0.2'ye (1: 125) seyreltmek için önceden yapılmış% 4 paraformaldehit (PFA) kullanın. Çözeltiyi 37°C'de ön ısıtmaya ayarlayın. 12 delikli bir plaka için, kuyu başına 500 μL yeterlidir. DİKKAT: PFA ve GA toksik kimyasallardır. Koruyucu donanıma sahip kimyasal bir başlıkta çalışın. Ayrıntılar için ilgili SDS'lerine bakın.</li>
	<li>Kuluçka süresi tamamlandığında, 12 delikli plakayı inkübatörden çıkarın ve çalışma yüzeyine yerleştirin. NOT: İş artık steril bir ortam gerektirmez.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamını kuyucuklardan aspire edin ve önceden ısıtılmış fiksasyon çözeltisini uygulayın. 12 delikli plakayı 20 dakika boyunca 37°C inkübatöre geri koyun.</li>
	<li>Kuluçkayı tamamladıktan sonra fiksasyon çözeltisini aspire edin ve her bir kuyucuğu oda sıcaklığında PBS ile iki kez yıkayın. Protokolün bu aşamasında deneyi duraklatmak ve daha sonra devam etmek mümkündür.<ol><li>Deney duraklatılırsa, kuyu başına 1 mL PBS ekleyin, 12 delikli plakayı plastik film (parafilm) ile kapatın ve 4 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Hücrelerin örtü kapaklarına boyanması ve monte edilmesi
<ol><li>DAPI (nükleer leke) stoğunu çözün ve açmadan önce mini bir santrifüjde döndürün. PBS'de DAPI stoğunu seyrelterek DAPI boyama çözeltisi hazırlayın (1:1.000).</li>
	<li>PBS'yi 12 delikli plakadan aspire edin ve her bir oyuğa 1 mL DAPI boyama çözeltisi uygulayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>DAPI boyama solüsyonunu aspire edin. Kuyu başına 2 mL PBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Buzlu cam mikroskop slaytlarını (cam slaytlar) %70 etanolde yıkayarak hazırlayın, ardından PBS'de üç yıkama yapın. Tüy bırakmayan kağıt havlular kullanarak slaytları dikkatlice kurutun ve toz veya yağ izlerini kontrol etmek için ışığa doğru yönlendirin. NOT: Bu adım için eldiven gereklidir.</li>
	<li>Cam slaytları deneysel ayrıntılarla etiketleyin. Montaj ortamını bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve mini bir santrifüjde aşağı doğru döndürün.</li>
	<li>Çalışma alanını düzenleyerek kapak fişlerini monte etmeye hazırlanın. Kapakları, etiketli cam slaytları, montaj ortamı, pipeti, 10 μL pipet uçları, tüy bırakmayan kağıt havluları ve cımbızları olan 12 delikli bir plakayı hazır bulundurun.</li>
	<li>Bir kapak kapağını monte etmek için hazırlanmış bir cam slaydına 10 μL montaj ortamı (ProLong Glass) uygulayın.</li>
	<li>Cımbız kullanarak 12 delikli plakadan kapak fişini alın ve hazırlanan tüy bırakmayan kağıt havluya kapak kapağının kenarına ve arkasına kısaca dokunarak örtü kapağındaki nemi alın. Kapak kaymasını montaj ortamının damlacığının üzerine yavaşça indirin.</li>
	<li>Her kapak kapağı için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın. Cam slayt başına bir ila dört kapak kaymasına izin vermek için montaj ortamı damlacıklarını yerleştirin.</li>
	<li>Monte edilmiş kapakların hareket etmesini önlemek için cam kızakların düz bir yüzeyde olduğundan emin olun. Montaj ortamının ayarlanmasına izin vermek için cam slaytları gece boyunca oda sıcaklığında karanlık bir yere yerleştirin. Örnekler artık görüntüleme için hazırdır. Deney, protokolün bu aşamasında duraklatılabilir ve daha sonra devam ettirilebilir.</li>
	<li>Deney bu aşamada duraklatılırsa, numunelerin gece boyunca oda sıcaklığında ayarlanmasına izin verdikten sonra, ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün ve 4 ° C'de saklayın.</li>
</ol>4. Mikroskopi ve görüntüleme
<ol><li>Numuneleri nakliye için alüminyum folyo içinde örtün (zaten yapılmamışsa).</li>
	<li>Mikroskopi tesisine vardığınızda, PBS kalıntılarını cam slaytlardaki kapak fişlerinden temizlemek için mikroskop filtre kağıdı ile çift damıtılmışH2O kullanın. Cam slaytları parlak bir ışığa doğru tutarak kapak kapaklarında leke olmadığından emin olun.</li>
	<li>Mikroskop için başlangıç prosedüründen geçin. Uygun hedefi seçin (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27) ve daldırma ortamı ekleyin.</li>
	<li>Numuneyi numune tutucuya yerleştirin. Mikroskop yazılımında, EGFP floresan aydınlatmasını etkinleştirmek için "Bul" sekmesini kullanın ve oküler kullanarak, numunenin odaklanması için z seviyesini manuel olarak ayarlayın. Odağı bulduktan sonra floresan aydınlatmayı kapatın.</li>
	<li>Mikroskop yazılımındaki "Al" sekmesine geçin. Görüntüleme için kullanılacak floresan kanallarını seçmek için "Akıllı Kurulum" u kullanın. Bu deney için EGFP ve DAPI kanal hazır ayarları seçilmiştir.</li>
	<li>Optimize edilmiş sinyal gücü için bir kılavuz olarak yoğunluk histogramını kullanarak her kanal yoğunluğunu başlangıç ayarlarından ayarlayın. Görüntüleme artık başlayabilir.</li>
	<li>Görüntüleme için, görüntüleme konumlarının bir diziye yerleştirilmesi için yazılımın seçeneğini kullanın ve diziyi kapak fişinin ortasında, görüntülenecek toplam 12 konumla ortalayın. Dizideki her konumun hücreler içerdiğini doğrulayın. Hücre yoksa, konumu hücreli bir alana ayarlayın.</li>
	<li>Mikroskop yazılımının otomatik odaklamasını kullanarak dizideki her konumun odağını ayarlayın ve mümkün olduğunca çok sayıda mitokondrinin odakta olduğundan emin olmak için bunu manuel bir ince ayar ile takip edin. NOT: Bu manuel ayarlamalar için EGFP kanalı kullanılır.</li>
	<li>Her kapak fişi için bu yöntemi kullanarak görüntüleri elde edin. Görüntü dosyalarını kaydedin ve morfolojik analiz adımlarına geçin.</li>
</ol>5. Simüle edilmiş eğitim verileri oluşturma
<ol><li>10 kodunu indirin ve içeriği açın. Gerekli ortamı ayarlamak için README.md'daki yönergeleri izleyin.</li>
	<li>Bu projenin giriş klasörü olan "src" adlı klasöre gidin. İçindeki numaralı klasörler, aracı kullanmanın farklı adımlarına özgü kodlar içerir. Not: Kodun herhangi bir alt klasörüne gitmek için "cd <<path>>" komutunu kullanın. Herhangi bir python dosyasını çalıştırmak için "python <<dosya adı>>.py" komutunu kullanın. "Öğretici.pptx" adlı sunu, segmentasyon modelini kullanmak için eksiksiz bir yönergeler kümesi içerir.</li>
	<li>Bir kopyasını oluşturun veya "2. Mitokondri Simülasyonu Airy" yi yeniden adlandırın ve yeniden adlandırın (Airy, mevcut mikroskop olarak kullanılan konfokal bir mikroskoba en yakın PSF fonksiyonu olduğu için burada kullanılır). "Simülatör" adlı klasöre gidin. NOT: Bu klasör, eğitim verilerinin simülasyonuyla ilgili tüm dosyaları içerir. Simülasyon için ayarlanacak üç parametre kümesi vardır.</li>
	<li>İlk olarak, "simülatör / parti / bxx.csv" toplu yapılandırma dosyasındaki simülatör için, mitokondri sayısı, çapların aralığı ve yapıların uzunlukları, yapının sergilediği z ekseninin aralığı ve floroforların yoğunluğu dahil olmak üzere numune hakkında parametreleri ayarlayın.</li>
	<li>Ardından, optik sistemle ilgili parametreleri ayarlayın.<ol><li>Bu set, mikroskop türünü (hangi PSF modelinin seçileceğini belirleyen), sayısal diyafram açıklığını (N.A.), büyütmeyi (M), piksel boyutunu (μm cinsinden), floroforların emisyon dalga boyunu ve arka plan gürültü parametresini vb. İçerir.</li>
		<li>N.A.'nın optik parametrelerini, büyütmeyi ve veri kümesinin minimum dalga boyunu "simülatör/microscPSFmod.py" dosyasında ayarlayın.</li>
		<li>Piksel boyutu için istenen değeri ayarlayın ve veri kümesinin emisyon dalga boyunu parametre olarak "simülatör/process_matrix_all_z" dosyasındaki "generate_batch_parallel.py" işlevine ayarlayın.</li>
		<li>"Simülatör/save_physics_gt" dosyasındaki "generate_batch_parallel.py" fonksiyonunun son üç parametresini ayarlayın. Parametreler piksel boyutu (nm cinsinden), çıktı görüntüsünün boyutu ve max_xy.</li>
	</ol></li>
	<li>"Simülatör/generate_batch_parallel.py" dosyasında, çıktı görüntülerinin boyutu, her görüntüdeki kutucuk sayısı ve toplam görüntü sayısı gibi çıktı veri kümesiyle ilgili üçüncü parametre kümesini ayarlayın.</li>
	<li>Simülasyonu başlatmak için "simulator/generate_batch_parallel.py" dosyasını çalıştırın.</li>
	<li>Son boyutlu görüntüyü elde etmek için, "5. Veri Hazırlama ve Eğitim/veri hazırlama" ana klasöründedir ve bu klasöre gidin. NOT: Sentetik veri kümesinin her görüntüsü, 256 piksel x 256 piksellik son görüntü boyutunu veren 128 piksel x 128 piksellik dört simüle edilmiş görüntünün bir montajı oluşturularak oluşturulur. Bu ilk önce hem mikroskop görüntüleri ("çıktı" klasöründe) hem de zemin doğruluğu segmentasyonları ("çıktı / physics_gt" klasöründe) için birçok bireysel karo (yaklaşık 12.000) üretir.<ol><li>Toplu iş numarasının parametrelerini, parti başına görüntü sayısını ve gürültü aralığını "data_generator.py" olarak ayarlayın.</li>
		<li>Montaj görüntülerini oluşturmak için "data_generator.py" dosyasını çalıştırın.</li>
		<li>"Resim" ve "segment" adlı klasörleri "5. Veri Hazırlama ve Eğitim/datatrain/train" klasöründen "5. Veri Hazırlama ve Eğitim/veri hazırlama/veri".</li>
	</ol></li>
</ol>6. Derin öğrenme tabanlı segmentasyon
<ol><li>Simüle edilmiş görüntülerde segmentasyon modelini aşağıdaki gibi eğitin:<ol><li>Yeni bir mikroskop için segmentasyon modelini eğitmek için, "5. Veri Hazırlama ve Eğitim/Eğitim" klasörünü oluşturur ve "train_UNet.py" dosyasında toplu iş boyutunun parametrelerini, segmentasyon için omurga modelini, çağ sayısını ve eğitim için öğrenme hızını ayarlar.</li>
		<li>Eğitime başlamak için "train_UNet.py" komutunu çalıştırın. Eğitim süreci, simüle edilmiş doğrulama kümesindeki segmentasyonun performansına ilişkin metriği görüntüler. NOT: Eğitim tamamlandıktan sonra, model best_model"5. Veri Hazırlama ve Eğitim/Eğitim" klasörü.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek modeli, eğitilen model için istenen bir boyuta bölünmüş gerçek mikroskop görüntülerinde test edin.<ol><li>"6. Test Verilerini Hazırla", ve ". png" formatındaki veri dosyaları "png" klasörüne yerleştirilir.</li>
		<li>Görüntüleri eğitilen model için istenen bir boyuta bölmek üzere "split_1024_256.py" dosyasını çalıştırın. Bu, "veri" klasöründeki görüntülerin 256 piksel x 256 piksel boyutunda kırpmalarını oluşturur.</li>
		<li>Oluşturulan "veri" klasörünü "7. Test Segmentasyonu" klasörü.</li>
		<li>Klasöre gidin "7. Test Segmentasyonu"nu seçin ve kullanılacak kaydedilen modelin adını ayarlayın.</li>
		<li>Kırpmaları segmentlere ayırmak için "segment.py" dosyasını çalıştırın. Segmentlere ayrılmış görüntüler "çıktı" klasörüne kaydedilir.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Morfolojik analiz: "Glikoz" ve "CCCP" olmak üzere iki veri grubunun mitokondriyal morfolojisinin analizi
<ol><li>Analiz edilecek verileri düzenleyin (her görüntü için bir klasör, her klasör bir görüntünün segmentlere ayrılmış çıktı kırpmalarını içerir).</li>
	<li>"make_montage.py" adlı ek dosyayı indirin ve "7. Test Segmentasyonu".</li>
	<li>Parçalanmış çıktıyı görüntünün orijinal boyutuna geri dikmek için "make_montage.py" dosyasını çalıştırın.</li>
	<li>"9. Morfolojik Analiz", "src" klasörünün içinde.</li>
	<li>"pip install seaborn[stats] skan" komutunu kullanarak Skan16 ve Seaborn Python paketlerini ortama yükleyin. NOT: Segmentasyon maskeleri, her bir mitokondrinin topolojisinin analizini sağlamak için Skan adlı kütüphane kullanılarak iskeletleştirilir.</li>
	<li>Ek dosya " analyze_mitochondria.py " dosyasını "9. Morfolojik Analiz".</li>
	<li>Denemenin farklı gruplarının görüntülerini "7" klasörünün içindeki farklı klasörlere yerleştirin. Test Segmentasyonu".</li>
	<li>"analyze_mitochondria.py" dosyasındaki "piksel boyutu" ve "giriş yolu " parametrelerini ayarlayın.</li>
	<li>Analizi iskeletleştirmek ve grafiklerini oluşturmak için kodu çalıştırmak için " analyze_mitochondria.py" dosyasını çalıştırın.</li>
</ol>

<ol><li>Sekh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physics-based+machine+learning+for+subcellular+segmentation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Machine+Intelligence%22%5BJournal%5D)">Physics-based machine learning for subcellular segmentation in living cells.</a> Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).</li>
<li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-morphosis%3A+Mitochondrial+fusion%2C+fission%2C+and+cristae+remodeling+as+key+mediators+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mito-morphosis: Mitochondrial fusion, fission, and cristae remodeling as key mediators of cellular function.</a> Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+macrophage+mitochondria+dynamics+in+vivo+reveals+cellular+activation+phenotype+for+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Imaging of macrophage mitochondria dynamics in vivo reveals cellular activation phenotype for diagnosis.</a> Theranostics. 10 (7), 2897-2917 (2020).</li>
<li>Xu, X., Xu, S., Jin, L., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+analysis+of+Otsu+threshold+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recognition+Letters%22%5BJournal%5D)">Characteristic analysis of Otsu threshold and its applications.</a> Pattern Recognition Letters. 32 (7), 956-961 (2011).</li>
<li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Schindelin, J. MorphoLibJ: MorphoLibJ v1.2.0. Zenodo. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/50694#.Y8qfo3bP23A">https://zenodo.org/record/50694#.Y8qfo3bP23A</a> (2016).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., et al. Trainable_Segmentation: Release v3.1.2. Zenodo. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/59290#.Y8qf13bP23A">https://zenodo.org/record/59290#.Y8qf13bP23A</a> (2016).</li>
<li>Chu, C. H., Tseng, W. W., Hsu, C. M., Wei, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+analysis+of+the+mitochondrial+network+morphology+with+applications+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research.</a> Frontiers in Physics. 10, 289(2022).</li>
<li>Xue, F., Li, J., Blu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+three-dimensional+point+spread+function+computation+for+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America+A%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate three-dimensional point spread function computation for fluorescence microscopy.</a> Journal of the Optical Society of America A. 34 (6), 1029-1034 (2017).</li>
<li>Lanni, F., Gibson, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+by+a+circular+aperture+as+a+model+for+three-dimensional+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America+A%22%5BJournal%5D)">Diffraction by a circular aperture as a model for three-dimensional optical microscopy.</a> Journal of the Optical Society of America A. 6 (9), 1357-1367 (1989).</li>
<li>Sekh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physics+based+machine+learning+for+sub-cellular+segmentation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Machine+Intelligence%22%5BJournal%5D)">Physics based machine learning for sub-cellular segmentation in living cells.</a> Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).</li>
<li>Liu, Y., Song, X. D., Liu, W., Zhang, T. Y., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+deprivation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+PC12+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glucose deprivation induces mitochondrial dysfunction and oxidative stress in PC12 cell line.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 7 (1), 49-56 (2003).</li>
<li>Dott, W., Mistry, P., Wright, J., Cain, K., Herbert, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+bioenergetics+in+a+skeletal+muscle+cell+line+model+of+mitochondrial+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial bioenergetics in a skeletal muscle cell line model of mitochondrial toxicity.</a> Redox Biology. 2, 224-233 (2014).</li>
<li>Ishihara, N., Jofuku, A., Eura, Y., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+morphology+by+membrane+potential%2C+and+DRP1-dependent+division+and+FZO1-dependent+fusion+reaction+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial morphology by membrane potential, and DRP1-dependent division and FZO1-dependent fusion reaction in mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (4), 891-898 (2003).</li>
<li>Miyazono, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupled+mitochondria+quickly+shorten+along+their+long+axis+to+form+indented+spheroids%2C+instead+of+rings%2C+in+a+fission-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner.</a> Scientific Reports. 8, 350(2018).</li>
<li>Ganote, C. E., Armstrong, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+CCCP-induced+mitochondrial+uncoupling+and+cyclosporin+A+on+cell+volume%2C+cell+injury+and+preconditioning+protection+of+isolated+rabbit+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Effects of CCCP-induced mitochondrial uncoupling and cyclosporin A on cell volume, cell injury and preconditioning protection of isolated rabbit cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (7), 749-759 (2003).</li>
<li>Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+Python+library+to+analyse+skeleton+images+confirms+malaria+parasite+remodelling+of+the+red+blood+cell+membrane+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton.</a> PeerJ. 2018, 4312(2018).</li>
<li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fight+club%3A+Assessment+of+2D+and+3D+single-molecule+localization+microscopy+software%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fight club: Assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software.</a> Nature Methods. 16, 387-395 (2019).</li>
<li>Yin, Z., Kanade, T., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+phase+contrast+optics+to+restore+artifact-free+microscopy+images+for+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">Understanding the phase contrast optics to restore artifact-free microscopy images for segmentation.</a> Medical Image Analysis. 16 (5), 1047-1062 (2012).</li>
<li>Malm, P., Brun, A., Bengtsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulation+of+bright-field+microscopy+images+depicting+pap-smear+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Simulation of bright-field microscopy images depicting pap-smear specimen.</a> Cytometry. Part A. 87 (3), 212-226 (2015).</li>
<li>Bifano, T., Ünlü, S., Lu, Y., Goldberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberration+compensation+in+aplanatic+solid+immersion+lens+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Express%22%5BJournal%5D)">Aberration compensation in aplanatic solid immersion lens microscopy.</a> Optical Express. 21 (23), 28189-28197 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar bu makale ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Protokoldeki kritik adımlarla ilgili önlemleri "geometri üretimi" ve "simülatör parametreleri" ile ilgili paragraflarda tartışıyoruz. "Transfer öğrenme" başlıklı paragraf, çoklu mikroskoplara adapte olurken daha yüksek verim için yapılan değişiklikleri tartışmaktadır. "Parçacık analizi" ve "diğer hücre altı yapıların oluşturulması" ile ilgili paragraflar, bu yöntemin gelecekteki uygulamalarına atıfta bulunmaktadır. "Biyolojik gerçeklikten fark" ile ilgili paragraf, simülasyonların gerçek verilerden farklı olmasının farklı nedenlerini ve bu nedenlerin uygulamamızı etkileyip etkilemediğini tartışmaktadır. Son olarak, "yoğun paketlenmiş yapılar" paragrafında yöntemimiz için zorlu bir senaryoyu tartışıyoruz.
Geometri oluşturma Mitokondrinin 3B geometrisini oluşturmak için, iskeletler olarak b-spline eğrilerinden oluşturulan basit bir 2B yapı, sentetik veri kümesinin oluşturulması için iyi çalışır. Bu sentetik şekiller, 2D hücre kültürlerinde gözlenen mitokondri şekillerini yakından taklit eder. Bununla birlikte, kalp dokusu gibi 3D dokular söz konusu olduğunda, mitokondrinin şekli ve düzenlenmesi oldukça farklıdır. Bu gibi durumlarda, segmentasyon modelinin performansı, simüle edilen görüntülere yönsellik eklenmesiyle iyileşebilir.
Simülatör parametreleri Simülatörün parametrelerini ayarlarken, çıkarımı çalıştıracak verilerinkilerle eşleştiklerinden emin olmak için dikkatli olunmalıdır, çünkü bunun yapılmaması segmentasyonda daha düşük performansa neden olabilir. Bu parametrelerden biri sinyal-gürültü oranı (SNR) aralığıdır. Test edilecek verilerin SNR aralığı, benzetimli veri kümesinin değerleriyle eşleşmelidir. Ayrıca, kullanılan PSF hedef test verilerininkiyle eşleşmelidir. Örneğin, konfokal PSF'den model tarafından eğitilmiş görüntüler, epi-floresan mikroskoptan gelen görüntüleri test etmek için kullanılmamalıdır. Dikkat edilmesi gereken bir diğer parametre, test verilerinde ek büyütme kullanılmasıdır. Test verilerinde ek büyütme kullanılmışsa, simülatör de uygun şekilde ayarlanmalıdır.
Transfer öğrenme Transfer öğrenme, başka bir görevde kullanılmak üzere bir görevde eğitilmiş öğrenilmiş bir modelden yararlanma olgusudur. Bu fenomen, farklı mikroskop verisi türleriyle ilgili sorunumuz için de geçerlidir. Bir tür mikroskopi verisi üzerinde eğitilen segmentasyon modelinin ağırlıkları (kaynak koduyla birlikte verilir), başka bir optik mikroskop verisi türünde kullanılacak bir segmentasyon modelini başlatmak için kullanılabilir. Bu, eğitim veri kümesinin önemli ölçüde daha küçük bir alt kümesi (10.000'e kıyasla 3.000 görüntü) üzerinde eğitim yapmamızı sağlar, böylece simülasyonun hesaplama maliyetlerini azaltır.
Partikül analizi Partikül analizi, parçalı maskeler üzerinde de yapılabilir. Bu, bireysel mitokondrinin alanı ve eğriliği vb. Hakkında bilgi sağlayabilir. Bu bilgi aynı zamanda mitokondrinin nicel karşılaştırması için metrik olarak da hizmet edebilir (bu deney için kullanılmaz). Örneğin, şu anda, nokta morfolojisini, mitokondrinin uzunluğuna dayanan bir eşik kullanarak tanımlıyoruz. Bazı durumlarda, küçük çubuk benzeri mitokondrileri puncta veya nokta benzeri mitokondriden daha iyi ayırmak için eliptikliği dahil etmek yararlı olabilir. Alternatif olarak, bazı biyolojik koşullar mitokondrinin kıvrılmasına neden olursa, mitokondriyal popülasyonu analiz etmek için eğrilik nicelemesi ilgi çekici olabilir.
Diğer hücre altı yapıların oluşturulması Hücre altı yapıların fizik temelli segmentasyonu mitokondri ve veziküller1 için gösterilmiştir. Veziküller farklı şekiller sergilese de, boyutları daha küçüktür ve bir floresan mikroskobu ile gözlemlendiğinde basit küreler olarak görünürler. Bu nedenle, veziküllerin geometrisi, uygun bir çap aralığındaki küresel yapılar kullanılarak simüle edilir. Bu, fonksiyondaki bir değişikliğin, yapıların geometrisini (mitokondri durumunda silindirler ve veziküller durumunda küreler) ve ilgili parametreleri (protokol bölümünde adım 5.4) ürettiği anlamına gelir. Geometrik olarak, endoplazmik retikulum ve mikrotübüller de boru şeklindeki yapılar olarak simüle edilmiştir17. Endoplazmik retikulumun 150 nm çapında ve mikrotübüllerin ortalama dış çapı 25 nm ve iç içi boş tüpün 15 nm çapında modellenmesi, bu yapıların şekillerinin yaklaşık olarak anlaşılmasını sağlar. Bu hücre altı yapıların her biri için değişecek bir başka parametre de florofor yoğunluğudur. Bu, floroforların bağlandığı biyomolekülün dağılımına ve bağlanma olasılığına göre hesaplanır.
Biyolojik zemin gerçeğinden farkı Derin öğrenme modelinin simülasyon denetimli eğitimi için kullanılan simüle edilmiş veriler, gerçek verilerden birçok yönden farklıdır. (i) Simüle edilen verilerde spesifik olmayan etiketlemenin olmaması, gerçek verilerde genellikle serbest yüzen floroforlar bulunduğundan, gerçek verilerden farklıdır. Bu, gerçek görüntüde daha yüksek bir ortalama arka plan değerine neden olur. Bu fark, SNR ile eşleştirilerek ve arka plan değeri gözlemlenen gerçek değerlerle eşleşecek şekilde ayarlanarak azaltılır. (ii) Hücre altı yapıların hareketi ve fotokinetik, sistemdeki iki dinamik kaynağıdır. Canlı hücrelerdeki hareketli yapılar (birkaç milisaniye aralığında hareket eden) hareket bulanıklığına neden olur. Bulanıklaştırma etkisinden kaçınmak için gerçek veri toplama sırasında pozlama süresi kısalır. Öte yandan, zaman atlamayı simüle etmiyoruz ve hareketsiz yapıları varsaymıyoruz; Bu varsayım, gerçek verilerdeki maruz kalma süresi küçük olduğunda geçerlidir. Bununla birlikte, bu varsayım, gerçek verilerin pozlama süresi hareket bulanıklığına neden olacak kadar büyükse, çıktıda bir hataya neden olabilir. Öte yandan, fotokinetik, nanosaniyeler ila mikrosaniyeler arasındadır ve simülasyonda atlanabilir, çünkü deneylerin olağan maruz kalma süreleri, fotokinetiğin etkilerini ortalamak için yeterince uzundur (milisaniye sırasına göre). (iii) Mikroskop görüntülerindeki gürültünün farklı kaynakları vardır ve bu kaynakların farklı olasılık yoğunluğu fonksiyonları vardır. Bu bireysel gürültü kaynaklarını modellemek yerine, sabit bir arka plan üzerinde Gauss gürültüsü olarak yaklaşıyoruz. Bu fark, düşük sinyal-arka plan oranı koşulları (2-4 aralığında) ve floroforların makro yoğunluğu 1 ile uğraşırken veri dağılımını önemli ölçüde değiştirmez. (iv) Görüntülemedeki eserler sapmalardan, sürüklenmelerden ve sistematik bulanıklıklardan kaynaklanabilir. Mikroskobun iyi hizalandığını ve gerçek verilerde analiz için seçilen bölgelerin bu eserlerden yoksun olduğunu varsayıyoruz. Bu eserlerin bazılarını PSF 18,19,20'de modelleme olasılığı da vardır.
Yoğun paketlenmiş yapılar Çakışan çubukları ağlardan ayırt edememenin zorlukları, 2D mikroskopi verilerinin segmentasyonunda kalıcı bir sorundur. Mitokondrilerin yoğun bir şekilde paketlendiği Şekil 5'te son derece zorlu bir senaryo sunulmuştur, bu da segmentasyon modelinde ve aşağıdaki analizde optimal olmayan sonuçlara yol açmaktadır. Bu zorluğa rağmen, iskeletleşmeyi inceltmek için bu gibi durumlarda morfolojik operatörlerin kullanılması, tüm mitokondriyal morfoloji kategorilerinde önemli değişikliklerin hala tespit edilmesine izin verirken, bu aşırı bağlı ağların kırılmasına yardımcı olabilir. Ek olarak, görüntüleme için geniş alan mikroskobu yerine konfokal bir mikroskop kullanılması, odak dışı ışığı ortadan kaldırarak bu sorunu kısmen hafifletmek için bir yöntemdir. Ayrıca, gelecekte, kesişen (yani fiziksel olarak bir ağ oluşturan) mitokondrileri, tek bir düzlemdeki projeksiyonları birbiriyle örtüşen çubuk benzeri mitokondriden ayırt etmek için 3B segmentasyon yapmak yararlı olacaktır.
Derin öğrenme segmentasyonu, mikroskopi kullanıcılarının analiz yeteneklerini genişletmeyi teklif eden, böylece daha önce yönetilemeyen karmaşık verilerin ve büyük nicel veri kümelerinin otomatik analizini yapma olasılığını açan umut verici bir araçtır.

Bu yazıda, floresan mitokondri belirteçlerini eksprese eden sabit kardiyomiyoblastların floresan mikroskopi görüntülerinde hücre altı segmentasyon1 için fizik tabanlı bir makine öğrenme aracının faydasını göstereceğiz.
Mitokondri, memeli hücrelerinde ana enerji üreten organellerdir. Spesifik olarak, mitokondri oldukça dinamik organellerdir ve genellikle uzunluk ve dallanma bakımından sürekli değişen ağlarda bulunur. Mitokondrinin şekli işlevlerini etkiler ve hücreler ortamdaki bir değişikliğe uyum sağlamak için mitokondriyal morfolojilerini hızla değiştirebilir2. Bu fenomeni anlamak için, mitokondrinin noktalar, çubuklar veya ağlar olarak morfolojik sınıflandırması oldukça bilgilendiricidir3.
Mitokondrinin segmentasyonu, hücrelerdeki mitokondriyal morfolojinin analizi için çok önemlidir. Mitokondrinin floresan mikroskopi görüntülerini segmentlere ayırmak ve analiz etmek için mevcut yöntemler, manuel segmentasyona veya geleneksel görüntü işleme yaklaşımlarına dayanmaktadır. Otsu4 gibi eşik tabanlı yaklaşımlar, mikroskopi görüntülerindeki yüksek gürültü seviyeleri nedeniyle daha az doğrudur. Tipik olarak, mitokondrinin morfolojik analizi için görüntüler çok sayıda mitokondri içerir ve bu da manuel segmentasyonu sıkıcı hale getirir. MorphoLibJ5 gibi matematiksel yaklaşımlar ve Weka6 gibi yarı denetimli makine öğrenimi yaklaşımları oldukça talepkardır ve uzman bilgisi gerektirir. Mitokondri7 için görüntü analizi tekniklerinin gözden geçirilmesi, derin öğrenme tabanlı tekniklerin görev için yararlı olabileceğini göstermiştir. Gerçekten de, kendi kendine sürüş gibi uygulamalar için günlük yaşam görüntülerinde görüntü segmentasyonu, derin öğrenme tabanlı modellerin kullanılmasıyla devrim yarattı.
Derin öğrenme, büyük miktarda veriden öğrenen algoritmalar sağlayan makine öğreniminin bir alt kümesidir. Denetimli derin öğrenme algoritmaları, temel doğruluk (GT) etiketleriyle açıklama eklenmiş büyük görüntü kümelerinden ilişkileri öğrenir. Floresan mikroskopi görüntülerinde mitokondrileri segmentlere ayırmak için denetimli derin öğrenmenin kullanılmasındaki zorluklar iki katlıdır. İlk olarak, denetimli derin öğrenme, büyük bir eğitim görüntüleri veri kümesi gerektirir ve floresan mikroskobu durumunda, bu büyük veri kümesini sağlamak, daha kolay kullanılabilir geleneksel kamera tabanlı görüntülerin kullanıldığı zamana kıyasla kapsamlı bir görev olacaktır. İkincisi, floresan mikroskopi görüntüleri, eğitim görüntülerindeki ilgili nesnelerin GT ek açıklamalarını gerektirir; bu, uzman bilgisi gerektiren sıkıcı bir iştir. Bu görev, floresan olarak etiketlenmiş hücre altı yapılara sahip hücrelerin tek bir görüntüsü için uzmanın zamanının saatlerini veya günlerini kolayca alabilir. Ayrıca, ek açıklamalar arasındaki farklılıklar bir sorun teşkil eder. Manuel ek açıklama ihtiyacını ortadan kaldırmak ve derin öğrenme tekniklerinin üstün performansından yararlanabilmek için, burada simüle edilmiş görüntüler üzerinde eğitilmiş derin öğrenme tabanlı bir segmentasyon modeli kullanılmıştır. Fizik tabanlı simülatörler, mikroskopta görüntü oluşum sürecini taklit etmek ve kontrol etmek için bir yol sağlar ve bilinen şekillerin görüntülerinin oluşturulmasına izin verir. Fizik tabanlı bir simülatör kullanarak, bu amaçla mitokondrinin simüle edilmiş floresan mikroskopi görüntülerinden oluşan büyük bir veri kümesi oluşturuldu.
Simülasyon, şekil oluşturma için parametrik eğriler kullanarak geometri oluşturma ile başlar. Yayıcılar, şeklin yüzeyine, yoğunluk deneysel değerlerle eşleşecek şekilde eşit olarak dağıtılmış bir şekilde rastgele yerleştirilir. Mikroskobun 3B nokta yayılma fonksiyonu (PSF), Gibson-Lanni model9'un hesaplama açısından verimli bir yaklaşımı8 kullanılarak hesaplanır. Simüle edilmiş görüntüleri deneysel görüntülerle yakından eşleştirmek için, hem karanlık akım hem de çekim gürültüsü, fotoğraf gerçekçiliği elde etmek için taklit edilir. Fiziksel GT, ikili bir harita şeklinde oluşturulur. Veri kümesini oluşturma ve simülasyon modelini eğitme kodu10 kullanılabilir ve bu sanal veri kümesini oluşturma adımı Şekil 1'de özetlenmiştir.
Sabit kardiyomiyoblastların konfokal mikroskopi görüntülerini analiz ederek tamamen simüle edilmiş bir veri kümesi üzerinde eğitilmiş derin öğrenme tabanlı segmentasyonun faydasını sergiliyoruz. Bu kardiyomiyoblastlar, mitokondriyal dış zarda bir floresan belirteci ifade ederek, floresan mikroskobu görüntülerinde mitokondrinin görselleştirilmesine izin verdi. Burada örnek olarak verilen deneyi yapmadan önce, hücreler glikozdan mahrum bırakıldı ve kültürde 7 gün boyunca galaktoza adapte edildi. Büyüme ortamındaki glikozun galaktoz ile değiştirilmesi, kültürdeki hücreleri daha oksidatif olmaya zorlar ve böylece enerji üretimi için mitokondrilerine bağımlı hale gelir11,12. Ayrıca, bu hücreleri mitokondriyal hasara karşı daha hassas hale getirir. Mitokondriyal morfoloji değişiklikleri, hücre kültürü ortamı13'e karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) gibi bir mitokondriyal ayırma ajanı eklenerek deneysel olarak indüklenebilir. CCCP, mitokondriyal membran potansiyeli (ΔΨm) kaybına yol açar ve böylece mitokondride daha tübüler (çubuk benzeri) bir morfolojiden daha küresel (nokta benzeri) bir morfolojiye14 kadar değişikliklere neden olur. Ek olarak, mitokondri CCCP tedavisi sırasında şişme eğilimindedir15. Galaktoza adapte olmuş kardiyomiyoblastlar mitokondriyal uncoupler CCCP ile tedavi edildiğinde mitokondri değişikliklerinin morfolojik dağılımını gösteriyoruz. Mitokondrinin derin öğrenme segmentasyonları, onları noktalar, çubuklar veya ağlar olarak sınıflandırmamızı sağladı. Daha sonra farklı mitokondriyal fenotiplerin dal uzunluklarını ve bolluğunu değerlendirmek için nicel metrikler elde ettik. Analizin adımları Şekil 2'de özetlenmiştir ve hücre kültürü, görüntüleme, derin öğrenme tabanlı segmentasyon için veri kümesi oluşturma ve mitokondrinin nicel analizinin ayrıntıları aşağıda verilmiştir.

<table><tbody><tr><td>12 oyuklu plaka</td><td>FALCON</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Sulu Glutaraldehit EM Sınıfı %25 Elektron</td> <td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>16200</td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert.A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Parlak Alan mikroskobu</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>Bilgisayar</td><td>yok</td><td>Linux</td><td>/ Windows İşletim Sistemi çalıştırıyor olmalı ve NVIDIA GPU'ya sahip olmalıdır. en az 4 GB bellek</td></tr><tr><td>Lameller</td><td>VWR</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (leke)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Cam Slaytlar (buzlu kenar)</td><td>epredia AA00000112E01MNZ10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H9c2 mCherry-EGFP-OMP25</td><td></td><td></td><td>Satın alınan hücre hattından türetilen kurum içi kararlı hücre hattı</td></tr><tr><td>İnkübatör Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Konfokal Mikroskop</td></tr><tr><td>Montaj Ortamı (Cam)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit Çözeltisi, PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J19943-K2'de %4</td><td></td></tr><tr><td>1.4</td><td>Zeiss</td><td>420782-9900-000</td> NA ile Plan-Apochromat 63x yağ (M27<td></td>)</tr><tr><td>objektif Steril laminer akış başlığı</td><td>Labogene</td><td></td><td>SCANLAF MARS</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Vacusafe aspirasyon sistemi</td><td>VACUUBRAND</td><td>20727400</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.6</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mitokondriyal morfolojinin simülasyon denetimli Öğrenme yoluyla analiz edilmesi

Analyzing Mitochondrial Morphology Through Simulation Supervised Learning

Hücre floresan mikroskobu görüntülerinde mitokondri gibi hücre altı organellerin kantitatif analizi, bu küçük ve morfolojik olarak çeşitli yapıların segmentasyonundaki doğal zorluklar nedeniyle zorlu bir görevdir. Bu makalede, sabit hücrelerin floresan mikroskopi görüntülerinde mitokondriyal morfolojinin nicelleştirilmesi için makine öğrenimi destekli bir segmentasyon ve analiz boru hattının kullanımını göstereceğiz. Derin öğrenme tabanlı segmentasyon aracı, simüle edilmiş görüntüler üzerinde eğitilmiştir ve denetimli derin öğrenme için temel doğruluk ek açıklamaları gereksinimini ortadan kaldırır. Bu aracın, floresan mitokondri belirteçlerinin kararlı bir ekspresyonu ile sabit kardiyomiyoblastların floresan mikroskopi görüntüleri üzerindeki faydasını gösteriyoruz ve mitokondriyal morfolojide değişiklikleri indüklemek için spesifik hücre kültürü koşullarını kullanıyoruz.

Floresan mitokondri belirteçlerini eksprese eden sabit kardiyomiyoblastların konfokal görüntülerinde mitokondrinin derin öğrenme segmentasyonlarından elde edilen sonuçlar, bu yöntemin faydasını göstermektedir. Bu yöntem, sadece yeniden eğitim gerektiren diğer hücre tipleri ve mikroskopi sistemleri ile uyumludur.
Floresan mitokondrili galaktoza adapte H9c2 kardiyomiyoblastları 2 saat boyunca CCCP ile veya CCCP olmadan tedavi edildi. Hücreler daha sonra sabitlendi, nükleer bir boya ile boyandı ve floresan mikroskobu analizi için cam slaytlara monte edildi. Hem kontrol hem de CCCP ile tedavi edilen hücrelerin görüntülerini elde etmek için bir konfokal mikroskop kullanıldı. Analizimizi, koşul başına yaklaşık 60 hücre ile 12 konfokal görüntü üzerinde gerçekleştirdik. Her görüntüdeki mitokondrinin morfolojik durumu daha sonra belirlendi ve ölçüldü. Eğitilen modelden elde edilen segmentasyon maskeleri, bu deney için her bir mitokondrinin topolojisinin analizini sağlamak için iskeletleştirildi. Bireysel mitokondrinin dal uzunluğu sınıflandırma için parametre olarak kullanıldı. Bireysel mitokondriler aşağıdaki kuralla morfolojik sınıflara ayrıldı. Spesifik olarak, uzunluğu 1.500 nm'den az olan herhangi bir mitokondriyal iskelet bir nokta olarak kabul edildi ve daha uzun mitokondri ayrıca ağ veya çubuk olarak kategorize edildi. İki veya daha fazla dalın kesiştiği en az bir kavşak varsa, bu bir ağ olarak tanımlandı; Aksi takdirde, mitokondri bir çubuk olarak sınıflandırıldı. Morfoloji sınıflarıyla etiketlenmiş mitokondriyal iskeletlerin yer aldığı örnek bir görüntü Şekil 3'te gösterilmiştir.
Şekil 4A'daki mitokondriyal morfoloji kategorizasyonu, CCCP 2 saat boyunca uygulandığında önemli değişiklikleri tespit etmenin mümkün olduğunu göstermektedir; Bu, CCCP ile tedavi edilen hücreler için noktalardaki artışla en açık şekilde gösterilmiştir.
Şekil 4B'deki ortalama dal uzunluğu, morfolojideki saptanabilir ve önemli değişiklikleri göstermek için başka bir yoldur. Hem çubuklar hem de ağlar, beklendiği gibi, hücreler CCCP ile tedavi edildiğinde kontrole göre önemli ölçüde azaldı. Noktaların ortalama dal uzunluklarındaki önemli artış, mitokondrinin CCCP'ye maruz kaldığında maruz kaldığı şişlik göz önüne alındığında da bekleniyordu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig01.jpg"> Şekil 1: Floresan mikroskopi görüntülerinin simülasyonu için boru hattı. İşlem hattı (i) 3B geometri üretimi, (ii) yayıcılar ve fotokinetik öykünme, (iii) 3B PSF evrişimi, (iv) gürültü toplama ve (v) ikileştirmeyi içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig02.jpg"> Şekil 2: Mitokondriyal morfolojinin makine öğrenimi tabanlı analizinin adımları . (1) Bölümlendirilecek görüntüler önce segmentasyon modeli için kabul edilebilir boyutlarda kırpılır. (2) Derin öğrenme tabanlı segmentasyon, görüntü kırpmalarına uygulanır. (3) Parçalanmış çıktı mahsulleri orijinal boyutlarına geri dikilir. (4) Montajlı segmentasyonlar iskeletleştirilmiştir. (6) Morfolojik analiz, iskeletleştirmelerden elde edilen topolojiye göre yapılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig03.jpg"> Şekil 3: Mitokondriyal iskelet, mikroskopi görüntülerinin segmentasyon çıktısı üzerine bindirilmiştir. (A) Segmentasyon çıktısı. (B) Düz çizgi iskeleti (bir dalın başlangıç ve bitiş noktaları arasındaki Öklid mesafesi) segmentasyon çıktısının üzerine bindirilir. İskeletin renk kodlaması mitokondri sınıfını tasvir eder. Ağlar kırmızı, çubuklar yeşil ve noktalar mor renklidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig04.jpg"> Şekil 4: Mitokondriyal morfolojinin analizi. (A) Toplam mitokondriyal uzunluğa dayanan farklı morfolojik kategorilerin göreceli yüzdesine genel bir bakış. (B) Deney koşulları ile morfolojik kategoriler arasındaki ortalama mitokondriyal dal uzunluğunun karşılaştırılması. X ekseni morfolojik kategorizasyonları görüntüler ve y ekseni mitokondri ortalama dal uzunluğunu nanometre (nm) cinsinden görüntüler. P-değerleri biçimindeki istatistiksel anlamlılık * p &lt; 0,05, ** p &lt; 0,01, *** p &lt; 0,001 ve **** p 0,0001 &lt; olarak gösterilmiştir . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig05v2.jpg"> Şekil 5: Segmentasyonun başarısızlığı durumu. Yüksek yoğunluklu mitokondri, segmentasyon modeli için zorlu bir senaryodur. Renkli iskelet, görüntüde tespit edilen en uzun tek mitokondri gösterir. Uzunluk ölçümlerinden geçerek, bu senaryolar tespit edilebilir ve morfolojik operatör aşındırıcısını kullanarak segmentasyon sonuçlarını iyileştirmek için üzerinde çalışılabilir (tespit edilen iskeleti zayıflatır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig05laregv2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu makalede, sabit hücrelerin floresan mikroskopi görüntülerinde mitokondri morfolojisini analiz etmek için simülasyon denetimli makine öğreniminin nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

Mitokondriyal Morfolojinin Simülasyon Denetimli Öğrenme Yoluyla Analiz Edilmesi

The quantitative analysis of subcellular organelles such as mitochondria in cell fluorescence microscopy images is a demanding task because of the ...

Sabit hücrelerin floresan mikroskopi görüntülerinde mitokondrileri analiz etmek için simülasyon denetimli bir makine öğrenme aracının kullanımını gösteriyoruz. Mikroskopi görüntülerinde mitokondrileri segmentlere ayırmak için mevcut yöntemler, Ostu veya manuel segmentasyon gibi otomatik eşik tabanlı yöntemleri içerir. Eşik tabanlı teknikler, sinyal-arka plan oranının düşük olduğu yerlerde düşük performans gösterir.Tipik olarak, morfolojik analiz için görüntüler çok sayıda mitokondri içerir ve bu da manuel segmentasyonu sıkıcı hale getirir. Denetimli derin öğrenme yöntemleri, segmentasyonu yüksek doğrulukla gerçekleştirir, ancak eğitim için çok sayıda girdi temel-doğruluk çifti verisi gerektirir. Bu yaklaşım, mikroskopi görüntüleri çiftleri ve bunların 2D yer-doğruluk şekil maskesini oluşturmak için fizik tabanlı bir simülatör kullanır, böylece manuel ek açıklama ihtiyacını ortadan kaldırır.Simüle edilmiş görüntüler üzerinde eğitilen model daha sonra gerçek mikroskop görüntülerinde mitokondrileri segmentlere ayırmak için kullanılır. Bu görevin yüksek doğrulukla otomatikleştirilmesini sağlayan ve eğitim için açıklamalı bir temel doğruluk veri kümesi gerektirmeyen derin öğrenme tabanlı bir segmentasyon aracı kullanıyoruz. Simülasyon, şekil oluşturma için parametrik eğriler kullanarak geometri oluşturma ile başlar.Yayıcılar eşit olarak dağıtılır ve üretilen şeklin yüzeyine, yoğunluk deneysel değerlerle eşleşecek şekilde rastgele yerleştirilir. Mikroskobun 3D PSF'si Gibson-Lanni modeli kullanılarak hesaplanır. Simüle edilmiş görüntüler ve deneysel görüntüler arasında fotogerçekçilik elde etmek için, hem karanlık hem de çekim seslerini taklit ediyoruz.Fizik temel-gerçeği, ikili bir harita şeklinde üretilir. CCCP tedavisinin konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenen sabit kardiyommiyoblastların mitokondri morfolojisi üzerindeki etkisini değerlendiriyoruz. Hücre kültürü.Steril bir laminer akış davlumbazında çalışan hücreleri, 12 kuyucuklu bir kuyucuk içine her deneysel durum için bir kapak kayması yerleştirerek tohumlamaya hazırlanın. Her bir kuyucuğa uygun hacmi dağıtmadan önce santrifüj tüpünün içeriğini birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek seyreltilmiş hücre süspansiyonunun düzgün bir şekilde karıştırıldığından emin olun. Deneysel prosedür.12 kuyucuklu plakanın kuyucuklarından hücre kültürü ortamını aspire edin, ardından kontrol kuyularına ve önceden ısıtılmış ortama 10 mikromolar CCCP çözeltisi ile önceden ısıtılmış taze medyayı test durumu kuyularına hızlı bir şekilde uygulayın. 37 Santigrat hücre inkübatöründe iki saat boyunca inkübe edin. Hücre kültürü ortamını kuyucuklardan aspire edin ve önceden ısıtılmış fiksasyon çözeltisini uygulayın.Hücrelerin örtü kaymalarına boyanması ve monte edilmesi. Bir kapak kayması monte etmek için hazırlanmış bir cam slaydına 10 mikrolitrelik montaj ortamı ekleyin. Cımbız kullanarak kapak kaymasını 12 kuyucuklu plakadan alın ve kenara ve kapağın arkasına hazırlanan tiftik içermeyen kağıt havluya kısa bir süre dokunarak kapak kaymalarından nemi alın.Montaj ortamının bekleyen damlacığı üzerindeki kapak kaymasını yavaşça indirin. Mikroskop ve görüntüleme. Okülerleri kullanarak, numunenin odaklanması için Z seviyesini manuel olarak ayarlayın.Yazılım içinde edinilen sekmeye geçin. Görüntüleme için kullanılacak floresan kanalını seçmek için akıllı kurulumu kullanın. Kapak kapağının ortasında ortalanmış dizi, görüntülenecek toplam 12 pozisyon ile.RA'yı kapak kaymasının ortasına ortalanmış olarak konumlandırın. Birden fazla konumu otomatik bir şekilde görüntülemek mümkündür. Simüle edilmiş eğitim verileri oluşturma.Kodu indirin ve içeriği açın. Yönergeleri izleyin ve ortamı ayarlamak için benioku adımlarını izleyin. src"Bir kopya oluşturun veya 2 klasörünü kullanın.mitokondri simülasyonu havadar"ve yeniden adlandırın. Bu klasör, eğitim verilerinin simülasyonuyla ilgili tüm dosyaları içerir. Simülasyon için ayarlanacak üç parametre kümesi vardır.İlk olarak, toplu yapılandırma dosyasında simülatör için mitokondri sayısı, çap aralığı, Z ekseni aralığı ve florofor yoğunluğu parametrelerini ayarlayın. Ardından, dosya mikroskobuPSFmode'da sayısal diyafram, büyütme ve veri kümesinin minimum dalga boyunun optik parametrelerini ayarlayın. py"Yangın generate_batch_parallel piksel boyutu ve emisyon dalga boyu için istenen değeri ayarlayın.py"Çıktı görüntülerinin boyutu, her görüntüdeki kutucuk sayısı ve dosya generate_batch_parallel toplam görüntü sayısı gibi çıktı veri kümesiyle ilgili üçüncü parametre kümesini ayarlayın. py"Dosyayı generate_batch_parallel çalıştırın. py" simülasyonunu başlatmak için.Son boyutlu görüntüyü elde etmek için, 5 adlı klasörün bir kopyasını oluşturun. Veri hazırlama ve eğitim/veri hazırlama" ve içine gidin. Toplu iş numarası parametrelerini ve parti başına görüntü sayısını, dosyaya eklenecek gürültü aralığını Data_generator ayarlayın.py"Dosyayı Data_generator çalıştırın. py"montaj görüntülerini oluşturun. image" ve segment" adlı klasörleri datatrain/train" klasörüne kopyalayın.Derin öğrenme tabanlı segmentasyon. Yeni bir mikroskop görüntü ayarı için segmentasyon modelini eğitmek için, train" adlı klasöre gidin ve bach boyutu, segmentasyon için omurga modeli, çağların sayısı ve train_unet adlı dosyanın içindeki eğitim için öğrenme hızı parametrelerini ayarlayın. py"Dosyayı train_unet çalıştırın.py" eğitimine başlamak. Eğitim süreci, simüle edilmiş doğrulama kümesindeki segmentasyon modelini değerlendirmek için metriği görüntüler. Eğitim tamamlandıktan sonra, model best_model olarak kaydedilir.h5"in train" adlı klasörde, modeli mikroskop görüntüleri üzerinde test etmek için, görüntülerin tren modeli tarafından istenen boyuta bölünmesi gerekir. Bunun için 6 adlı klasöre gidin. Test verilerini hazırlayın "ve verilerin PNG formatındaki dosyalarını PNG klasörüne kopyalayın" ve dosyayı split_1024_256 çalıştırın.py"Bu, veri klasöründeki görüntülerin 256 x 256 boyutlarında kırpmalarını oluşturacaktır. Görüntü kırpmalarını segmentlere ayırmak için 7 adlı klasöre gidin. Segmentasyonu test et" seçeneğini belirleyin ve segment adlı dosyayı çalıştırın.py", kullanılacak kaydedilen modelin adını ayarladıktan sonra. Segmentlere ayrılmış görüntüler çıktı klasörüne kaydedilir. Morfolojik analiz.make_montage adlı dosyayı yerleştirin. py" adlı klasöre 7. Segmentasyonu test et" seçeneğini kullanın ve parçalanmış çıktıyı görüntünün orijinal boyutuna geri dikmek için dosyayı çalıştırın.9 adlı yeni bir klasör oluşturun. Morfolojik Analiz"kaynak klasörde ve içine gidin. Pip install seaborn skan" komutunu kullanarak skan ve seaborn kütüphanelerini kurun "Segmentasyon maskeleri, bireysel mitokondrinin topolojisini analiz etmeyi sağlamak için skan" adlı kütüphane kullanılarak iskeletleştirilir.Dosyayı 9 klasörüne yerleştirin. Morfolojik Analiz"Deneyin farklı gruplarının görüntülerini 7 klasörünün içindeki farklı klasörlere yerleştirin. Test segmentasyonu"Analiz için grafikler oluşturmak üzere dosyayı çalıştırın. Sonuç -ları.Yapılacak nicel analiz, araştırma sorularına veya hipotezine bağlıdır. Deneyimizde, mitokondrinin üç farklı morfolojisiyle, yani noktalarla ilgilendik: noktalar "küçük mitokondri bitleri, çubuklar" lif benzeri veya mitokondri benzeri dizeler ve çok dallı ağlar "Morfolojiyi tanımlamak için, önce segmentasyon çıktısını iskeletleştiriyoruz ve farklı sınıfların dal bağlantılarını analiz ediyoruz. İki grup galaktoz uyarlanmış hücre, kontrol grubu ve CCCP ile tedavi edilen grup için analiz sonuçlarını gösteriyoruz.CCCP'ye maruz kaldığında şişen mitokondri göz önüne alındığında, beklenen noktaların ortalama dal uzunluklarında önemli bir artış görüyoruz. Hem çubukların hem de ağ sınıflarının bireysel uzunluklarındaki mitokondri yüzdesi, hücreler CCCP ile tedavi edildiğinde kontrole göre önemli ölçüde azalır, böylece hipotezimizi doğrular. Yöntemimiz için zorlu bir senaryo, görüntünün yoğun bir şekilde mitokondri paketlediği zamandır.Pembe renk, görüntüde tespit edilen en uzun tek mitokondriyonu gösterir ve bu da segmentasyon sonuçlarındaki artan hatadan kaynaklanır. Bu başarısızlık vakaları, mitokondri uzunluklarının kontrolü ve morfolojik operatörler kullanılarak tespit edilebilir. Uygulamamız, mitokondriyal morfolojinin analizini nasıl yaptığımızın bir örneği olsa da, etrafındaki böyle bir analiz ve araştırma sorularının mitofajinin ve ilgili biyolojik deneylerin çeşitli yönleri için formüle edilebileceğine inanıyoruz.

analyzing-mitochondrial-morphology-through-simulation-supervised

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Memeli beyin dokusundan mitokondriyal görselleştirme ve analiz zorlu bir iştir. Burada, bu kritik enerji üreten organelin morfolojik ve hacimsel analizi hakkında bilgi edinmek için seri blok yüz taramalı elektron mikroskobundan (SBFSEM) elde edilen üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon analizinin nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz.

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Bozulmuş mitokondriyal taşıma ve morfolojisi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda rol oynamaktadır. Sunulan protokol, kalıtsal spastik paraplejide mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı ön beyin nöronlarını kullanır. Bu protokol, aksonların boyunca mitokondriyal ticaretinin karakterizasyonuna ve nörodejeneratif hastalıkların incelenmesini kolaylaştıracak morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.

Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi beyin organoidlerinin üretimi ve mitokondriyal hastalıkların modelinde kullanımları için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Mitokondriyal Hastalık Modellemesi için İnsan Beyni Organoidlerinin Üretimi

Mitokondriyal ağ son derece karmaşıktır ve analiz edilmesini çok zorlaştırır. Yeni bir MATLAB aracı, hızlandırılmış görüntülerde canlı konfokal görüntülenen mitokondriyi analiz eder, ancak bireysel manuel dikkat gerektiren büyük bir çıktı hacmine neden olur. Bu sorunu çözmek için, hızlı dosya analizine olanak tanıyan rutin bir optimizasyon geliştirildi.

İzoforma Özgü Retinoik Asit Reseptörleri ile Canlı Nöronal Mitokondri Homeostaz Modülasyonunun Optimize Edilmiş Otomatik Analizi

Bu çalışma, fare beyin dokusunda immün boyama ve görüntü analizine dayalı olarak mitokondri morfolojisini analiz etmek için bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, bunun Parkinson hastalığı modellerinde protein agregasyonunun neden olduğu mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri nasıl tespit etmesine izin verdiğini de açıklar.

Bir Parkinson Hastalığı Modelinde Mitokondriyal Morfolojinin Histolojik İncelemesi

Bu protokol, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak mitokondriyal üst yapı görselleştirme ve analizi için kültürlenmiş SH-SY5Y hücrelerinin ve birincil sıçan hipokampal nöronlarının yayılması, farklılaşması ve boyanması için bir iş akışı sunar.

Nöronal Hücre Modellerinde Mitokondriyal İç Membran Üst Yapısını Görselleştirmek için Canlı Hücre STED Görüntülemenin Kullanılması

Bu protokol, yaşlanma sırasında C. elegans'ın çoklu dokularında mitokondriyal morfolojiyi görüntülemek için standart bir yaklaşım sağlar.

Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

Bu çalışmada, adım adım bir protokol açıklıyoruz ve canlı hücrelerde mitokondrinin morfolojik özelliklerini belirlemek için numune hazırlama, görüntü elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere temel ayrıntıları vurguluyoruz. Bu yöntem, çeşitli koşulları incelemek için mitokondriyal morfolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılır.

Canlı Hücrelerde Mitokondriyal Morfolojinin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Belirlenmesi

Burada, zaman içinde mitokondriyal fisyon ve füzyon aktivitesindeki 3 boyutlu değişikliklerin nicelleştirilmesinde yararlı olan bir ImageJ eklentisi olan mitokondriyal olay yerelleştiricisini (MEL) açıklıyoruz. Ayrıca, ImageJ'de analizden önce mikrografların temizlenmesi için yararlı olan bir görüntü işleme hattını da açıklıyoruz.

Mitokondriyal Morfolojideki Değişikliklerin Dinamik ve Üç Boyutlu Floresan Mikrografları ile Anlaşılması

Beyin organoidleri, Mitokondriyal Ensefalomiyopati, Laktik Asidoz ve İnme benzeri ataklar (MELAS) çalışmaları için değerli bir model görevi görerek, bunların altında yatan patofizyolojiye dair içgörüler sunar ve ilaç taraması için bir platform sağlar. Hastalığa neden olan genlerin değişen seviyelerde heteroplazmisine sahip hücre dizilerinden türetilen organoidler, önemli fenotipik farklılıklar sergiler.

Beyin Organoidleri Kullanılarak Mitokondriyal Hastalığın Modellenmesi: Mitokondriyal Ensefalomiyopati, Laktik Asidoz ve İnme Benzeri Epizodlara Odaklanma

Öğrenin, simülasyon denetimli makine öğrenmesiyle floresan mikroskobisi görüntülerinde mitokondri morfolojisini nasıl otomatik olarak analiz edebilirsiniz. Bu yöntem, manuel açıklama gerektirmeden segmentasyon doğruluğunu artırır ve hücre biyolojisi araştırmalarında önemli uygulamalara sahiptir.

Mitokondriyal Morfolojinin Simülasyon Denetimli Öğrenme Yoluyla Analiz Edilmesi

Daha fazla video keşfet