Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi

Mitokondriyal disfonksiyon birçok nörodejeneratif hastalığın altında yatan. Protokolümüz aksonlarda mitokondriyal dinamiklerin incelenmesinde, aksonal dejenerasyoniçeren nörolojik hastalıkların incelenmesini kolaylaştıran önemli bir araç tır. Mitokondriyal etiketleme, canlı hücre görüntüleme ve indüklenen pluripotent kök hücre teknolojisini birleştirerek protokolümüz insan aksonlarındaki mitokondriyal ticareti karakterize etmek ve morfolojilerini analiz etmek için kullanılabilir.

Kök hücre kültürlerinde ve bu hastalıkların tedavisinde potansiyel tedavi hedefleri sağlayan nörodejeneratif hastalıkların hayvan modellerinde bozulmuş mitokondriyal taşıma ve morfoloji görülebilir. Kültürün otuz beş gün sonra, 37 santigrat derece iki dakika hücre ayırma çözeltisi 1 mg / ml ile küçük kümeler halinde insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden farklı nörosferler ayrıştırın. Kuluçka sonunda santrifüj ile hücre kümeleri toplamak ve NDM bir mililitre pelet resuspend.

Poliornit ve laktoz dehidrogenaz yükselterek virüssüz azaltılmış büyüme faktörü bazal membran matris kaplamalı 35 milimetre cam alt tabakları orta yüz mikrolitre hücre yaklaşık beş kümeleri. Sonra B27 ile desteklenen NDM bir mililitre ekleyin, siklik adenozin monofosfat, insülin benzeri büyüme faktörü, insan beyin kaynaklı nörotrofik faktör ve glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör her kültüre. Ön beyin nöronların aksonları boyunca mitokondriyi görselleştirmek için ilk olarak NDM'de 50 nanomolar kırmızı floresan boya ile nöronları 37 derece santigrat derecede üç dakika boyunca sıcak NDM'de iki yıkıntı ile lekeleyin.

Daha sonra, bir floresan mikroskobun sahnesine kültür yerleştirin ve 40X hedefi seçin. Faz-alan altında morfolojik özelliklerine göre akson ları tanımlar. Aksonları boyunca mitokondriyal hareketin yönünü ayırt etmek için açıkça nöronların hücre organları belirlemek.

Hücre gövdesi ve akson ayırt ettikten sonra maruz kalma süresi ve akson mitokondri odak ayarlamak ve akson içinde mitokondriyal taşıma her beş saniyede toplam beş dakika boyunca yakalamak. ImageJ açık Fiji mitokondriyal taşıma analiz etmek ve Bio-Formats eklentisi seçin. Tiff serisinin hızlandırılmış görüntülerini almak ve standart ImageJ'i seçmek ve tüm serileri açmak için Bio-Formats içe aktarıcısını kullanın.

Otomatik ölçeklendirme kanalları işaretleyin ve pikseldeki görüntülerin kare numarasını ve boyutunu not etmeye özen göstermek için Tamam'ı tıklatın. Tüm 60 kare için parlaklık ve kontrast ayarlandıktan sonra hücre gövdesinden terminal akson bir çizgi çizmek için parçalı çizgi kullanın. Kymograph oluşturmak için birden fazla Kymograph eklentisi seçin ve çizgi genişliğini seçin.

Hareketli mitokondri açık tsp050607 için mesafe, zaman değerleri ve hızı ölçmek için. makro eklentisinde txt. Ve mitokondriyal hareketin iz üzerinde alt bölgeden üstün bir çizgi çizin.

Çizgiye karşılık gelen parçalı hızları okumak için makrolar eklentisinde tsp okuma hızları açık çizgi çizdikten sonra. Daha sonra özgün görüntüyü açın ve ölçek çubuğu boyunca bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın. Çizginin uzunluğunu ölçmek ve dx'i şimdi ve piksellerden mikrometrelere uzaklığı dönüştürmek için analiz et'i seçin.

Ardından pikselden saniyeye kadar olan süreyi değiştirin. ImageJ'de aksoniçindeki mitokondriyal uzunluk ve alanı analiz etmek için nokta JAR eklentisinin düzleştirmesini yapın ve ilgi çekici akson görüntüsünü açın. 32 bit görüntüyü sekiz bit'e dönüştürün ve akson'u izlemek için parçalı çizgi aracını kullanın.

Jar eklentisini düzeltin ve filament geniş çizginin genişliğini 50 piksele ayarlayın. Düzleştirilmiş bir akson oluşturmak ve görüntü eşiğini ayarlamak için akson'u tekrar izleyin. Ölçümü ayarlamak için ölçümleri ayarla çevre uygun elips ve şekil tanımlayıcılarını analiz et ve çizgi işlevini kullanarak orijinal görüntüdeki ölçek çubuğunu gösterildiği gibi ölçün.

Analiz altında ve ölçek ayarlamak için piksel bilinen mesafe ve ölçek ayarlamak için uzunluk birimi mesafe girin. Ardından, ölçek ayarını tüm görüntülere ayarlamak için genel olarak seçin. Son olarak alanı belirlemek için parçacıkları analiz et ve analiz et ve elde edilen ölçümü görüntülemek için ekran sonuçlarını seçin.

Telensefalik glutamaterjik nöronlar içine farklılaşma sonra hücreleri onların T-B-R bir ve beta üç tubulin marker ekspresyonu ile karakterize edilebilir. Kırmızı floresan boya ve zaman atlamalı görüntüleme ile boyama mitokondri aksonal taşıma değerlendirilmesi sağlar. Tek bir mitokondri statik kalabilir veya bir akson içinde anterograd veya retrograd yönde hareket edebilir.

Akson boyunca mitokondriyal hareketin hızı gösterildiği gibi ölçülebilir. Örneğin ticari olarak mevcut analiz yazılımı kullanılarak, s-p-g-3-A nöronlarında yabani tip nöronlara göre hareketli mitokondri yüzdesi önemli ölçüde azalmıştır. Mitokondriyal alan uzunluğu ve en boy oranı aksonanaliz etmek için görüntü analizi yazılımı düzleştirilmiş ve eşik ayarlayarak seçilebilir.

Mitokondriyal alan çevre uzunluğu genişliği ve en boy oranı daha sonra düzleştirilmiş akson elde edilebilir. Örneğin hem mitokondriyal uzunluk hem de en boy oranı S-P-G 15 nöron aksonlarda, kontrol yabani tip aksonlar ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalır. Hücreleri nazikçe yıkamak ve hücrelerin görüntülemeden önce yirmi dakika boyunca stabilize olmasını sağlamak için orta ve mikroskop inkübatörünü ısıtmak önemlidir.

Canlı hücre görüntülemeden sonra kültürler sabit lenebilir ve diğer ilgi proteinlerinin ekspresyonunu incelemek için immünoleme tabi tutulabilir. Canlı insan sinirlerinde mitokondriyal dinamikleri incelemek zordur. Bu teknik nörolojik hastalıklarda mitokondriyal dinamikler ve sinir dejenerasyonu çalışmaları için benzersiz bir araç sağlar.