Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu tekniğinin genel amacı, fare beyninin tanımlanmış bir bölgesindeki mitokondriyal morfolojiyi, yapısı, dağılımı, hacmi ve sayıyı analiz etmektir. Bu yöntem, beyin mitokondri yapısı, sayısı ve dağılımındaki değişikliklerin nörodejeneratif ve nörogelişimsel bozukluklara önemli ölçüde katkıda bulunup bulunmadığı gibi nörobiyolojideki birçok önemli soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, düşük vakumlu taramalı elektron mikroskobu odasına yerleştirilmiş özel bir ultramikrotom ekleyerek seri kesitleri görüntüleme sürecini otomatikleştirmesidir.

Deneye başlamak için, önceden hazırlanmış glutaraldehit ile sabitlenmiş dokuları her biri 0.1 molar kakodilat tamponunda beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Dokuları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1 mililitre kakodilat tamponlu% 0.1 tanik asit ile sabitleyin. Sabitlemeden sonra, dokuları kakodilat tamponunda yıkayın.

0.3 gram potasyum ferrosiyanür ve 0.86 gram sodyum kakodilatı 10 mililitre damıtılmış suda çözün. Kullanmadan hemen önce 10 mililitre% 4 osmiyum tetroksit ekleyin ve% 2 osmiyum ferrosiyanür çözeltisi ile dokuları buz üzerinde 90 dakika boyayın. Boyamadan sonra, dokuyu damıtılmış suda yıkayın.

Numuneleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca taze hazırlanmış% 1 tiyokarbohidrazid veya TCH çözeltisi ile muamele edin. Ardından numuneleri yıkayın. Daha sonra, dokuları bir saat boyunca% 2 sulu osmiyum tetroksit ile boyayın.

Boyamadan sonra, dokuları damıtılmış suyla yıkayın. Numuneleri gece boyunca %1 uranil asetat içinde damıtılmış suda 4 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, dokuları damıtılmış suda durulayın ve bir fırında Welton'un kurşun aspartat lekesi ile inkübe edin.

Dokuların mümkün olan en iyi şekilde boyanması, görüntüleme için kritik öneme sahiptir, çünkü zayıf boyama, numune üzerinde görüntülemeyi zorlaştıran veya imkansız hale getiren bir şarj fenomenine neden olur. Mendili damıtılmış suda yıkayın. Numuneleri, her biri beş dakika boyunca soğutulmuş etanol çözeltileri kullanarak kademeli bir alkol serisinden kurutun, ardından her biri 10 dakika boyunca üç kez% 100 etanol dehidrasyonu yapın.

Numuneleri propilen oksit içinde her biri 15 dakika boyunca iki kez yıkayın. Dokuları 1: 1 gömme reçinesi ve propilen oksit karışımına yerleştirin, şişeyi kapatın ve dokuları gece boyunca inkübe edin. Propilen oksidin dokuz saatlik süre içinde buharlaşması için şişenin kapağını iki saat sonra açın.

Dokuları iki saat boyunca temiz şişelerde% 100 taze gömme reçinesine aktarın. Numuneleri, basılı kağıt etiketler içeren düz kalıplara taze gömme reçinesine gömün ve bir fırında kürleyin. Bir saat sonra doku yerleşimini ve hizalamasını kontrol edin ve gerekirse ayarlayın.

Numuneleri ilgilendiğiniz alana göre kesin ve jelleşen siyanoakrilat süper yapıştırıcı kullanarak bir alüminyum pime monte edin. Ardından, alüminyum pime iletken bir yol sağlamak için numuneyi bloğun kenarlarına kolloidal gümüş macun ile kaplayın. Doku örneklerini, oda içi ultramikrotom aşaması ve düşük kilovolt geri saçılan elektron detektörü ile donatılmış bir taramalı elektron mikroskobu sistemi kullanarak inceleyin.

Örnekleri bu ayarlarla görüntüleyin. Görüntüleri orijinal tescilli 16 bit'ten 8 bit TIFF formatına dönüştürmek için Görüntü, Tür ve ardından 8 bit'i seçerek analize başlayın. Bu adım sırasında otomatik kontrast ve/veya parlaklık dönüştürme işlemi görüntüler için ideal değilse, 16 bit görüntüleri yeniden açın ve Görüntü, Ayarla, Parlaklık/Kontrast düğmesine basın.

Tüm görüntüler için çalışan bir aralık seçin ve Uygula'ya basın. Ardından dönüşümü gerçekleştirin. Dilimler arasında kabul edilemez bir görüntü hareketi varsa, Eklentiler, Kayıt ve SIFT ile Doğrusal Yığın Hizalama'yı seçerek görüntü yığınlarını hizalayın ve hizalamayı katı gövde yerine yalnızca çeviri modu için ayarlayın.

Kayıttan önce Görüntü, Ayarla, Tuval Boyutu'nu seçerek tuval boyutunu büyütün. Alternatif olarak, istediğiniz bölgeyi seçip kırparak görüntüyü ilgi çekici bir alana küçültün. Gerekirse, ImageJ'yi kullanarak görüntüleri daha küçük, daha yönetilebilir bir boyuta ölçeklendirin ve ardından Görüntü ve Ölçekle'yi seçin.

Düşük yoğunluklu nöronal kültürler üzerinde yapılan konfokal mikroskopi, nöronal somada bulunan mitokondrinin retiküler bir ağ oluşturduğunu, distal nöritlerde bulunanların ise ayrı bir uzun morfoloji sergilediğini gösterdi. Seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu veya SBFSEM tekniği kullanılarak, fare beyninde mitokondri, dendritler ve aksonal varisler açıkça gözlendi. Fare beyin dokusunun nöritlerindeki üç günlük mitokondri rekonstrüksiyonları, dendritik ve aksonal mitokondri arasında boyut farkı gösterdi.

Temsili bir 2 boyutlu SBFSEM görüntüsünden elde edilen veriler, nöronal presinapslar içinde bulunan mitokondri hacminin veya boyutunun, ekstrasinaptik bölgede bulunanlardan önemli ölçüde daha küçük olduğunu ortaya koydu. SBFSEM analizi ile elde edilen görüntüler, bireysel mitokondrinin ultrastrüktürel özelliklerini görselleştirmek için daha fazla çözünürlük sağlar. Mitokondrinin hücresel bölmesini, sinaptik olmayan somatik mitokondri ve presinaptik mitokondri gibi kolayca tanımlanabilir yapılara yakınlığını belirleyerek sınıflandırmak mümkündür.

Bu teknik, üç gün boyama, iki gün reçine kürleme, bu analize uygun bir yığın üretmek için bir günlük görüntüleme ve analize hazırlık olarak görüntü işleme sonrası için yaklaşık iki ila dört saat olmak üzere yaklaşık yedi günde yapılabilir. Bu prosedür aynı zamanda, mitokondriyal kaçakçılık ve bunların fisyon ve füzyon dinamikleri hakkındaki soruları yanıtlamak için genetik olarak etiketlenmiş mitokondri ile canlı görüntüleme gibi mitokondriyi görüntülemek için diğer yöntemlerle birlikte de kullanılabilir.