Name: Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Öğrenin fare beynindeki mitokondri morfolojisini seri blok-yüz taramalı elektron mikroskopi ile analiz etmeyi. Bu yöntem nörodejeneratif hastalıklarda mitokondri yapısındaki değişiklikleri incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik yardım sağladığı için Sidney Walker'a teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden (1R01EY024712-01A1) bir hibe ile desteklenmiştir.

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürleri Virginia Tech Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Dikkat: Bu protokolde kullanılan çeşitli parçaların kullanımında ve atarken aşırı önlemler alınmalıdır. Kullanmadan önce, kurumsal düzenlemeler ve iş sağlığı ve güvenliği uygulamaları yerel özellikle bir ağır metal ve radyoaktivite kaynağı ve kurşun nitrat hem uçucu ve son derece zehirli olan osmiyum tetroksit, uranil asetat, için, kurulmuş ve takip edilmelidir bir ağır metal zehir. Tiyokarbohidrazid (TCH) yanlış kullanılırsa, patlayıcı ve zehirli gazlar üretmek için ayrıştırmak. Birçok kurum bu reaktifler rutin kullanılmaktadır ve yardım sağlayabilir hangi bir EM çekirdek tesisine sahip olacak. Beyin Dokusu ve SBFSEM Görüntüleme 1. Hazırlık <ol><li> % 5 isoflura - 4 kullanarak - (4 aylık ~ 2) C57 siyah fare (C57BL / 6J suşu) genç uyutmakne kurumsal yönergeleri izleyerek. kas tonusu, istemli hareketlerin ve kuyruk tutam gibi caydırıcı uyaranlara yanıtları eksikliği kaybı izleyerek anesthetization onaylayın. </li><li> Bir diseksiyon tepsi üzerinde fare Pin ve ventral orta hat boyunca deri üzerinde bir kesi yapmak. fare göğüs kafesini maruz deride daha kesiler olun. diyaframı insizyon ve dikkatli bir şekilde kalpte ortaya çıkarmak için çevresi boyunca göğüs boşluğunu teşrih ve sağ atrium bir kesi yapmak. </li><li> Bir kelebek kanül kullanılarak, sol ventrikül kanüle. kan kaybı karaciğer renkte bir değişiklik ile teyit edilene kadar, fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.2 içinde 20 ml - transkardiyal 10 kullanılarak fare serpmek. Not: Karaciğer renk değişikliği kan kaybından kapsamını belirlemek için bir rehber olarak kullanılır. kırmızımsı kahverengi karaciğer renk değişiklikleri pembe soluk onaylayın. </li><li> % 2 Glutaraldehit 20 ml - transcardially 10 kullanarak fare serpmekaldehid ve% 4 paraformaldehid içinde hızlı bir şekilde beyin dokusu düzeltmek için, 0.10 M kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) içinde yapılır. Sabitleme kuyruk sertleşme gözlemleyerek tarafından izlenir. pH ayarı, ve su ile 100 ml hacmi oluşturmak için hidroklorik asit ilave, 80 ml su içinde bir sodyum kakodilat içinde 2.14 g çözülerek 0.10 M kakodilat tamponu (pH 7.2) hazırlayın: edin. </li><li> Perfüzyon sonrasında, fare decapitate 4 O ° C&#39;de 48 saat süre ile 0.10 M sodyum kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) ihtiva eden% 2 glutaraldehid ve% 4 paraformaldehid içinde fiksasyonu takiben beyin, teşrih </li><li> 48 saat sonra, bir vibratome kullanarak 400 mikron koronal kesitler yapmak ve daha sonra dikkatli bir şekilde diseksiyon mikroskobu 42 uyarınca (örneğin, hipokampus) beyindeki ilgili bölgeyi incelemek. Dikkatle doku Döşeme ve yönlendirmesini korunması için bir resim çekin. Not: SBFSEM doku boyama Mesaj işleme yöntemleri ağır metal boyama yöntemleri çeşitli birleştirirSipariş çözünürlüğü artırmak için ve Deerinck ve ark 40 tarafından daha önce geliştirilen yönteme dayanır. </li><li> glutaraldehid ile sabitlenmiş dokular 3 defa 5 dakika 0.1 M kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) içinde, her bir yıkama. </li><li> 0.1 M sodyum kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) içinde tannik asit çözülmesiyle% 0.1 tanik asit çözeltisi hazırlayın. çözülene kadar girdap ve gerekirse, 0.45 um&#39;lik bir filtreden filtre. </li><li> Oda sıcaklığında 60 dakika - Postfix&#39;i kakodilat olan dokular 30 1 mi reaktifi, inkübasyon yolu ile tanik asit,% 0.1 tamponlu. Not: kuluçka süresi doku büyüklüğüne bağlıdır, ancak 30 dakika çoğu dokuda en iyi şekilde çalışır. </li><li> dokular 3 defa 5 dakika kakodilat tamponu içinde her birinin (pH 7.2) yıkanır. </li><li> H2O damıtılmış 10 ml (dH 2 O) 0.3 g potasyum ferrosiyanat ve 0.86 g sodyum kakodilat eritin. Buz üzerinde potasyum ferrosiyanat çözüm tutun. Kullanımdan hemen önce,% 4 ozmiyum tetroksit (10 ml OsO 4) ekleyin. </li><li> % 2 os ile dokuları LekeBuz üzerinde 90 dakika süreyle MIUM-ferrosiyanür çözeltisi. DH 2 O 3 kez, 5 dakika her yıkayın </li><li> 10 ml dH 2 O 0.1 gr TCH çözerek% 1 tiyokarbohidrazid (TCH) çözümü hazırlayın tamamen çözünene kadar her 10 dakikada bir dönen 60 ° C&#39;de çözülür. TCH tutarken kurumasına yüksek sıcaklık veya izin çözüm metallerin kullanımını, ısınmayı önlemek için özen özellikle güvenlik önlemlerine uyunuz. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca taze hazırlanmış% 1 TCH olan örnekleri tedavi edin. DH 2 O 3 kez, 5 dakika her yıkayın </li><li> DH 2 O% 2 OsO 4% 4 seyreltilir, 1 saat süre ile inkübe edilerek% 2 sulu ozmiyum tetroksit ile leke dokular. DH 2 O. ile dokular 3 defa, 5 dakika her yıkayın </li><li> 4 ° C&#39;de dH 2 O içinde% 1 uranil asetat örnekleri O / N inkübe edin. </li><li> (Deerinck ve arkadaşları 40 tarafından tarif edildiği gibi) Walton kurşun aspartat çözeltisi hazırlayın. <ol><li> 250 ml dH 2 O 0.998 g L-aspartat çözülürpH 5.5 ulaşıncaya kadar ve sonra da damla damla 10 N potasyum hidroksit (KOH) ekleyin. pH ayarlaması sonra 30 dakika boyunca 60 ° C, asit stok ve ısı aspartik 10 ml talebi nitrat, 0.066 g ekleyin. </li></ol></li><li> DH 2 O dokuları yıkayın ve 60 ° C fırın içinde 30 dakika boyunca Walton kurşun aspartat boyasıyla inkübe edin. DH 2 O 3 kez, 5 dakika her yıkayın </li><li> % 100 etanol ile, ardından, her biri 5 dakika için% 20,% 50,% 75,% 85 ve% 95 etanol soğutulmuş solüsyonlar kullanılarak alkolün kademeli dizi 3 kez 10 dakika her biri numune kurutmak. Not: açılan etanol havadan su emer gibi yeni açılmış şişeden% 100 etanol kullanın ve başarısız olmasına gömme neden olur. Uzun inkubasyon büyük doku örnekleri ile gerekli olacaktır. </li><li> Yıkama örnekleri 2 kez 15 dakika propilen oksidin her. </li><li> (Süksinik anhidrit dodesenil) 25 ml reçine, 10.5 ml DDSA kullanarak plastik gömme reçine, 15.5 ml NMA (nadik metil anhidrit) ve 1 ml yapınDMP-30 (2,4,6-Tris dimetilaminometil fenol). sallayarak reçineyi karıştırın. Spin ve reçine kabarcıklar çözülene kadar bekletin. Not: Bu standart orta sertlikteki reçetedir. Elektron mikroskopisi (EM) plastik reçine diğer tipleri kullanılabilir ancak tüm reçineler SBFSEM için çalışmaz gibi önceden bir esansiyel olmayan kontrol numunesi ile test edilmesi gerekir. </li><li> - 10 saat, propilen oksit, yaklaşık 8 arasında bir süre boyunca buharlaşır, böylece 2 saat sonra, ilk başta daha sonra kapaksız kapaklı bir küçük şişe içinde, gömme reçine ve propilen oksidin 50 karışımı: 50 dokuların O / N inkübe edin. </li><li> 2 saat boyunca temiz şişelerde% 100 taze gömme reçine dokuları aktarın. </li><li> Düz kalıpların taze gömme reçinesi içinde yerleştirme örnekleri, kağıt etiketler basılmış ve 48 saat boyunca 60 ° C&#39;de bir fırında tedavi içeren. yaklaşık 1 saat sonra, tekrar doku yerleşimi ve hizalamayı kontrol ve gerekirse ayarlayın. </li><li> ilgi alanına örnekleri Trim ve gellin kullanarak bir alüminyum pim üzerine monteg siyanoakrilat superglue veya iletken epoksi reçine, daha sonra kolloidal gümüş ile kaplama alüminyum pin bir iletken yolu sağlamak için bloğun kenarlarına yapıştırın. </li><li> Bir in-bölme ultramicrotome evre ve düşük kV geri-saçılmalı elektron detektörü 32 ile donatılmış bir tarama elektron mikroskobu sistemi kullanılarak doku örneklerinin incelenmesi. Not: taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanın Araca ve site eğitim alın ve yetkili kullanıcı olmak. Alternatif olarak, küçük projeler için bir araştırmacı veya çekirdek tesisi ile işbirliği mümkün olabilir. SEM röntgen oluşturmak gibi Radyasyon eğitimi de gerekli olabilir. </li><li> örneklerin görüntü için aşağıdaki ayarları kullanın: 2.25 kV, 5 de - 10 nm / piksel çözünürlük, 80 arasında saha boyutları ile - x 250 mikron, y (diğer tarla mümkün boyutları) ve 50 dilim kalınlığı - 100 nm, 20 saat süre - 16 600 dilim - 250 toplamda. Not: Ayarlar farklı mikroskoplar arasında önemli ölçüde farklılık, indireysel örnekleri ve istenen çözünürlük. Bu ayarlar birçok örnekler için kolayca yorumlanabilir görüntüleri üretmek gerekir. </li></ol> 2. Görüntüleme DataSet Analizi Not: Resim J / Fiji yazılım veri kümesini analiz etmek için kullanılan ve TrakEM2 eklentisi dayanmaktadır edilir. Ön işleme aşamaları yazılımı kullanarak çeşitli yapılabilir ve geniş ya da deneyim düzeyine bağlı minör olabilir ve yığınlar aldı. açık kaynak kodlu yazılım kullanarak ana dönüşümler burada açıklanmıştır (1.50b ver ImageJ, FIJI 1 Ekim 2015 indir). <ol><li> yazılımda açılması ve menü Eşyaları Görüntü → Tipi → 8 bit seçerek orijinal patentli 16-bit görüntülerden 8 bit TIFF formatında görüntüleri dönüştürmek. <ol><li> Bu adım sırasında otomatik kontrast / parlaklık dönüşüm görüntüler için ideal değilse, 16-bit görüntüleri yeniden ve basın Görüntü Parlaklık / Kontrast → ayarla →. Tüm fotoğraflar için çalışan bir dizi seçin ve basın uygulayın. Sonra c gerçekleştirinonversion. Not: Bazı SEM&#39;ler, bu adım mikroskop üreticisi yazılımını gerektirebilir. </li><li> Nedeniyle dilimleri arasında kabul edilemez görüntü hareketi, Gerekirse (örn., Nedeniyle şarj drift), / kayıt görüntü yığınlarını (menü öğeleri Eklentiler Doğrusal StackAlignmentWithSIFT → → Kayıt) hizalayın. En kayıt yazılımı olarak, &quot;çeviri sadece&quot; modunda ziyade &quot;rijit gövde&quot; için ayarlayın. Birçok yaklaşımlar ve yazılım işe yarayabilir: Not birçok uygulama için SIFT kayıt plug-in eserleri ve sanal bir yığın sürümü var. <ol><li> Gerekirse, kayıt öncesi (Görüntü → canvassize → ayarlayın) ya da (Crop → Görüntü) ilgi alanına azaltmak tuval boyutunu büyütmek. Bazı sürüklenme veya meyletme oluşabilir ve diğer eklentileri veya yazılım çalışırken daha iyi sonuçlar doğurabilir: Not. Manuel seçenekleri de (örneğin. ImageJ / FIJI, Eklentiler → Kayıt → ManualLandmarkSelection) bulunmaktadır. </li></ol></li><li> desir Eğered, daha küçük, daha yönetilebilir boyuta ölçekli görüntüleri (örn.% 25) ImageJ (Görüntü → Ölçeği) kullanarak. </li></ol></li><li> yazılım, Dosya → ithalat → görüntü sırası başlatın ve ardından tiff dosyaları seçin. </li><li> (Boş) Yeni → TrakEM2 Dosya → seçerek eklenti başlatın. İki pencere açılacaktır; bir projeye ve area_lists yönetir ve diğer izleme yönetir ve tuval &quot;olarak adlandırılır. </li><li> tuval ithalatına sağ tıklama yaparak eklenti içine görüntü yığınını yükleyin. ithalat seçin ve ithalat yığının üzerine tıklayın. Pop-up seçeneklerinde sanal yığınlarının kutusunu işaretleyin. Not: Görüntü yığınları zaten yazılım açıldı rağmen, onlar da eklenti açılmalıdır. Sanal yığınları kutusu işaretlendiğinde ise bilgisayar daha sorunsuz çalışabilir. </li><li> Eşleşme oluşturulur ve yığın yüklendikten sonra, sağ eklenti pencerenin altında proje adı için tıklayın. Sağ şablon col &#39;yeni bir proje&#39; üzerine tıklayınUMN ve bu proje için &#39;yeni çocuk eklemek&#39; seçeneğini seçin. Sağ &#39;area_list&#39; seçmek için tekrar tıklayın. </li><li> Tuval üzerine sağ tıklayarak orijinal elektron mikroskobu ayarları ile kabul projenin Z ekseni ölçeği ayarlama, sonra ekranı tıklayın ve kalibrasyonu seçin. Ayrıca, eklenti penceresindeki tüm katmanları seçerek Z-ölçek ayarlamak, doğru ölçek Z ve kalınlığı seçmek için tıklatın. </li><li> Tıklayın ve &#39;proje&#39; ve proje tuval penceresinde &#39;Z boşluk&#39; sekmesi altında &#39;alan listeleri&#39; oluşturmak için bölüm nesneleri içine tüm &#39;çocuk&#39; sürükleyin. </li><li> &#39;Alan listesini seçin ve sağ seçin ve bir renk ayarlamak için tıklayın. Şimdi, elektron mikroskobu görüntüleri, mitokondri gibi nesneleri izlemek için boya fırçası aracını kullanın. Kullan &#39;Shift + tık&#39; kapalı bir daire içinde doldurmak için, &#39;Ctrl + kaydırma&#39; ve uzaklaştırmak için, ve bir silgi içine boya fırçası imlecini açmak için &#39;Alt + tık&#39;. </li><li> 15 mikron - ~ 10 iki alanları seçin10 tarafından - resmin sol üst köşesinde ve sağ alt köşesinde 15 mikron ve her veri kümesi içinde mitokondri tarafsız örnekleme izin vermek için bu alanlarda tüm mitokondri tespit. </li><li> &#39;Tuval&#39; Açık, gözlemlemek ve bölümler boyunca mitokondri iz. Not: Mitokondri benzer büyüklükteki oldukça karanlık / yoğun görünen organeller, çapı ve gevşek silindirik. iç zarı tarafından oluşturulan benzersiz kristalarında bu organel içinde kolaylıkla ayırt edilebilir. </li><li> izleme bittiğinde, sağ, Z uzay sekmesinin altında area_list tıklayın &#39;3D göster&#39; seçeneğini seçin. Bu takip görüntünün 3 boyutlu rekonstrüksiyon görüntülemek için 3D görüntüleyici eklenti başlatacak. <ol><li> mitokondriyal hacim ölçümleri, 3D görüntüleyici seçin nesne gerçekleştirmek için, &#39;Düzenle&#39; sekmesine tıklayın ve &#39;Object Properties&#39; seçiniz. mitokondriyal hacim tahmini birkaç diğer ölçümlerle birlikte listelenir. </li></ol></li></ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler. Emily K Benson, Renovo Neural Inc.'in ücretli bir çalışanıdır ve Grahame J Kidd, seri blok yüzlü SEM hizmetleri ve analizinin ticari sağlayıcısı olan Renovo Neural Inc.'de 3DEM'in Bilimsel Direktörü olarak görev yapmaktadır.

Sinir sisteminin karmaşıklığı, yeterli çözünürlüğe sahip mitokondri gibi büyük doku hacimleri yeniden ve morfolojisi ve organellerin dağılımı analiz önemli bir sorun teşkil etmektedir. Nöronlar, oligodendrosit ve üç boyutlu olarak uzatılmış çok sayıda süreçlerle astrositlerin dahil olmak üzere birden hücreler, beyin dokusu 43 içinde etkileşimde. Mitokondri hücreleri ve uzak süreçlerin soma hem de bulunduğu için, mitokondriyal morfolojisi sinir sistemi (Şekil 1) son derece pleomorfik olup. Yet...

Mitokondri hücre iskeleti ile sıkı etkileşim içinde, onların şekil ve hücresel ipuçları ve ihtiyaçlarına bağlı olarak konumunu değiştirmek dinamik organelleri vardır ve bu tür nöronlar 1 kalsiyum kanal akımlarının gibi hücresel olaylara yanıt olarak. Diğer hücre organelleri sırayla kendi dinamiklerini ve metabolizmasını 2 düzenleyen endoplazmik retikulum, örneğin ile mitokondri de etkileşim. Mitokondriyal morfolojisi yani farklı hücre tiplerinde heterojenitesini gösterir. organelle şekli bu levhalar, çuvallar ve oval 3 oluşan için boru şeklinde değişir. Mitokondriyal füzyon ve fisyon döngüsü proteinleri yer, boyut, şekil ve mitokondri 4 dağılımını düzenler gösterilmiştir. Ayrıca, mitokondriyal şekil değişimleri nörodejenerasyon, nöronal plastisite, kas atrofisi, kalsiyum sinyali, reaktif oksijen türleri üretimi gibi ömrü ve hücre ölümü karıştığı THA ile ilişkilidirT hücre spesifik mitokondriyal morfolojisi normal hücresel fonksiyonun 5-11 bakımı için kritiktir. Mitokondri önemli bioenergetic fonksiyonu TCA döngüsü yoluyla tam besin dağılımı (yani, glükoz, yağlı asitler ya da amino asitler) içerir ve OXPHOS 12 geçiş yolu, metabolik reaksiyonlar bir dizi yürüterek adenosin trifosfat (ATP) üretmektir. İnsan beyni vücut ağırlığının sadece% 2 ancak ~ o organı 13 zorlu bir derece enerji verme üretilen toplam enerjinin% 20&#39;sini tüketir oluşturmaktadır. İnsanlarda mitokondriyal fonksiyon bozukluğu, nörolojik belirtiler 14-17 çok sayıda yol açtığı şaşırtıcı değildir. Genetik ~ 1 bir prevalans ile bozuklukların klinik heterojen bir grup olan mitokondriyal hastalıkların 17,18, ATP nesil açar bozan OXPHOS bileşenleri mutasyonlar: 5.000 birey ve m en yaygın nedenlerinden biridirçocuklarda ve erişkinlerde etabolic bozukluklar. Mitokondri türevi ATP açığı, beyin, kalp ve iskelet kasları ağırlıklı bu hastalarda 14,17,18 de etkilenen gibi yüksek enerji gerektiren organları ile çoklu organ sistemleri etkiler. Son yıllarda, birçok çalışma nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların 15-17,19,20 hem mitokondriyal disfonksiyon için kanıtlar sağlamıştır. mitokondri temel ve beyin gelişimi ve işlevi için kritik olduğundan, hem sağlıklı ve hastalıklı devletlerin altında beyin mitokondriyal morfoloji, yapısı, büyüklüğü, sayısı ve dağılımında değişikliklere analiz protokolleri geliştirmek zorunludur. Mitokondriyal hedeflenen yeşil floresan proteini (GFP) sıçan modelleri beyin 21,22 mitokondriyal hareketleri ve lokalizasyon görselleştirmek için üretilmiştir. Bu mitokondriyal hareketliliği ve genel dağılımını incelemek son derece yararlı bir araç olsa da, includ bazı dezavantajları vardırE sınırlı çözünürlük ve floresan mikroskobu duyarlılığı. Bu nitelikler zor nispeten küçük ölçekli mitokondri izlemek için yapmak. Benzer şekilde, seri transmisyon elektron mikroskobu başarıyla sinaptik mitokondri 23 görüntülemek için kullanılan, ancak bu yöntem çok zaman alıcı değil. Mitokondriyal morfoloji, sürekli fizyon ve füzyon döngülerine tabi olarak son derece dinamik olduğu bilinmektedir ve çoğu hücrelerde mitokondri son derece bağlı bir ağ 24-26 korumak olduğunu. Nöronlar çok onlar bu neurites yollarını (Şekil 1) yapmak gibi ayrı gerekebilir birden dendritler ve genişletilmiş akson ve hücre gövdesinde bağlı bir retiküler ağ oluşturmak mitokondri hücreleri polarize edilir. Bu boyut ve şekil son derece çeşitli beyin mitokondri yapar. Örneğin, bir seri bloğu yüz tarama elektron mikroskobu kullanılarak (SBFSEM) tekniği, daha önce gözlenen extrasynaptic mitochondr hacmi ya da boyut olarak farklılıkon altı 27 kat olarak sinir uçlarında bulunan mitokondri ia kadar olabilir. Sesi gerçekleştirmek için çeşitli yaklaşımlar vardır ultramicrotome SEM 30 toplama seri bölüm TEM 29, otomatik bant içeren, 28 analizleri, iyon ışın SEM 31 ve SBFSEM 32 duruldu. SBFSEM analizi, beyin 1 mm&#39;ye kadar alanda mitokondri gibi morfolojik şekil, boyut, dağıtım ve organellerin sayısal verisi sağlamak için çözünürlüğü sahip olduğu avantajlara sahiptir. Teknik çalışma bir önceki EM deneyim eksikliği birçok biyolojik laboratuvarlar yetenekleri dahilinde veri toplama ve analizi ile, aynı zamanda en az talep ediyor. Seri bölüm benzeri görüntüler üretmek için ticari araçların gelişi dokuların 3D ultrastrüktürel analiz yapmıştır ayrıca hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde 28 tarafsız bir hacimsel analizini veren bir rutin teknik, </&gt; Sup. SBFSEM sonra ilk nöronal devrenin 34 rekonstrüksiyonu analizinde önemli bir araç olarak bu tekniği kurduk 1981 yılından bu yana 33. Birden çalışmalarda Leighton tarafından tanıtılan bir fikrine dayanan, 2004 32 nörobiyoloji alanında tanımlanan ve kullanılmıştır. Ayrıca, birçok küçük ölçekli projeler için, hücresel organellere 27,35-39 belirlemek için yeniden analiz sağlar. Bu yana, edinilen görüntüler alçak gerilim geri saçılım elektron türetilmiştir, bilinen farklı ağır metal boyama tekniklerini birleştiren yeni boyama protokolleri çözünürlüğü 40 artırmak için geliştirilmiştir. Bu yazıda, 3D elektron mikroskopi görüntüleme ve daha önce bize ve diğerleri 38,39,41 tarafından kullanılmış olan yöntemlere dayalı beyin mitokondri hacimsel analizini kullanan bir protokol sağlar. Doku sonrası işleme yöntemleri, daha önce Deerinck ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir kullanılan40.

<table><tbody><tr><td>C57BL / 6J fareler</td><td>Jackson laboratuvarı &nbsp;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone, ticari adı Fluriso</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon tepsisi</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td>S65105&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon makası</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Kelebek kanül</td><td>Exel International</td><td>26704</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tampon salin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Filtre (0.45 mikron)</td><td>EMD Millipore</td><td>NC0813356</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom kesit sistemi</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Vibratom 3000</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Kakodilat</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Tanik Asit</td><td>EMS</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Ferrosiyanür</td><td>J.T. Baker</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum Tetroksit %4 Çözelti</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Tiyokarbohidrazid</td><td>EMS</td><td>21900</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A93100</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit</td><td>Acros Organics</td><td>43731000</td><td></td></tr><tr><td>Kurşun Nitrat</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>EMbed-812 GÖMME KİTİ EMS</td><td></td><td>14120</td>, <td>Embed 812 ve nbsp; reçine, DDSA, NMA ve DMP-30 içerir.</td></tr><tr><td>Gluteraldehit% 25 EM Sınıf</td><td>Polibilimler A.Ş.</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>EMS</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Uranil Asetat</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Propilen Oksit</td><td>EMS</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Gömme Kalıbı</td><td>EMS</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum numune pimi</td><td>EMS</td><td>70446</td><td></td></tr><tr><td>Kolloidal Gümüş Sıvı</td><td>EMS</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş Bıçağı</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Süper Yapıştırıcı (Loctite Jel Kontrolü)</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>Hırdavat/el sanatları mağazaları bu ürünü taşır</td></tr><tr><td>İletken epoksi</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>16043</td><td></td></tr><tr><td>Taramalı elektron mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Sigma VP</td><td></td></tr><tr>SEM <td>Gatan Inc.</td> <td>için oda ultramikrotomunda</td><td>3View2</td><td>Diğer SEM'ler için tasarlanabilir</td></tr><tr><td>Pim hazırlama için kırpma mikroskobu</td><td>Gatan Inc.</td><td>3View sisteminin</td><td></td>bir parçası olarak sağlanır</tr><tr><td>Düşük kV geri saçılan elektron dedektörü</td><td>Gatan Inc.</td><td>3V-BSED</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ / Fiji işleme paketi&nbsp;</td><td>ImageJ ver 1.50b, FIJI indir 1 Ekim 2015</td><td><a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">http://rsb.info.nih.gov/ij/<</td></tr><tr>td colspan="4"><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a> </td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td></tr></tbody></table>

seri blok-yüz taramalı elektron mikroskop kullanarak beyin mitokondri analizi



Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

İnsan beyni ağırlıklı bir yakıt kaynağı olarak glikoz dayanan bir yüksek enerji tüketen organdır. Glukoz adenosin trifosfat (ATP) şeklinde hücresel enerji üretmek için glikoliz, tri-karboksilik asit (TCA) döngüsü ve oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) yollar ile beyin mitokondrilerde katabolize edilir. mitokondriyal ATP üretimi düşüklüğü belirgin nörolojik ve myopatik semptomlar ile klinik mevcut mitokondriyal bozukluklar neden olur. Mitokondrial kusurlar da nöro bozuklukları (örneğin otizm spektrum bozukluğu) ve nörodejeneratif bozukluklarda mevcut (örneğin, amiyotrofik lateral skleroz, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları). Böylece, sağlıklı ve hastalık durumları hem altında mitokondriyal morfolojisi, yapısı ve dağıtım 3D analizini gerçekleştirmek için alanında artan bir ilgi var. Beyin mitokondriyal morfoloji özellikle bazı mitokondri ile bu son derece çeşitlidirsinaptik bölge geleneksel ışık mikroskobu çözünürlüğü sınırının altındadır &lt;200 nm çaplı aralığında olmak. beyinde mitokondriyal hedeflenen yeşil floresan proteinini (GFP) ifade anlamlı konfokal mikroskopi ile organel algılama arttırır. Ancak, büyük ölçekli mitokondri görüntüleri oversaturating olmadan nispeten küçük ölçekli mitokondri saptanmasının duyarlılığı üzerindeki kısıtlamaları aşmak değil. seri geçirimli elektron mikroskobu başarıyla nöronal sinaps mitokondri karakterize etmek için kullanılmış olsa da, bu teknik son derece zaman alıcı birden fazla numune karşılaştırırken özellikle olduğunu. Seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBFSEM) tekniği, doku ve veri toplama görüntüleme blokları kesit bir otomatik süreç gerektirir. Burada, hızla yeniden ve mitokondriyal morfolojisi görselleştirmek için kemirgen beyin tanımlanmış bir bölgenin SBFSEM gerçekleştirmek için bir protokol sağlar. bu teknolojinique da tanımlanan bir beyin bölgesi mitokondriyal sayısı, hacmi, boyutu ve dağılımı üzerindeki doğru bilgi temin etmek için kullanılabilir. Elde edilen görüntü çözünürlüğü (genellikle 10 nm altında) yüksek olduğundan herhangi bir brüt mitokondriyal morfolojik bozukluklar da tespit edilebilir.

Beyin mitokondriyal morfolojisi ve boyutu farklı nöronal alt bölümlerinde heterojen olduğunu göstermektedir. Lentivirüs mitokondriyal hedefli yeşil flüoresan protein ifade ile dönüştürülmüş düşük yoğunluklu nöronal kültürlerinde mikroskopisi uzak neurites kalanların ayrı uzatılmış morfoloji (Şekil 1 AB) sergilemek ise nöronal soma ikamet eden mitokondri, bir retiküler ağ oluştururlar olduğunu gösterdi. SBFSEM teknik kullanılarak, mitokondriyal morfolojisi, boyut, hacim v...

Memeli beyin dokusundan mitokondriyal görselleştirme ve analiz zorlu bir iştir. Burada, bu kritik enerji üreten organelin morfolojik ve hacimsel analizi hakkında bilgi edinmek için seri blok yüz taramalı elektron mikroskobundan (SBFSEM) elde edilen üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon analizinin nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz.

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Seri blok yüzey taramalı elektron mikroskobu tekniğinin genel amacı, fare beyninin tanımlanmış bir bölgesindeki mitokondriyal morfolojiyi, yapıyı, dağılımı, hacmi ve sayısını analiz etmektir. Bu yöntem; beyindeki mitokondri yapısı, sayısı ve dağılımındaki değişikliklerin nörodejeneratif ve nörogelişimsel bozukluklara önemli ölçüde katkıda bulunup bulunmadığı gibi nörobiyolojideki birçok temel sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, düşük vakumlu taramalı elektron mikroskobu haznesine entegre edilmiş özel bir ultramikrotom kullanarak seri kesitlerin görüntüleme sürecini otomatikleştirmesidir.Deneye başlamak için, önceden hazırlanmış glutaraldehit ile fikse edilmiş dokuları 0,1 molar kakodilat tamponu ile beşer dakikadan üç kez yıkayın. Dokuları, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1 mililitre kakodilat tamponlu %0,1 tannik asit ile post-fikse edin. Post-fikse işleminin ardından dokuları kakodilat tamponu ile yıkayın.0,3 gram potasyum ferrosiyanid ve 0,86 gram sodyum kakodilatı 10 mililitre distile su içerisinde çözün. Kullanımdan hemen önce 10 mililitre %4 osmiyum tetroksit ekleyin ve dokuları %2 osmiyum ferrosiyanid çözeltisi ile buz üzerinde 90 dakika boyunca boyayın. Boyama işleminden sonra dokuyu distile su ile yıkayın.Numuneleri, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca yeni hazırlanmış %1'lik tiyokarbahidrazid veya TCH çözeltisi ile işleme tabi tutun. Ardından numuneleri yıkayın. Daha sonra, dokuları bir saat boyunca %2'lik sulu osmiyum tetroksit ile boyayın.Boyamadan sonra dokuları distile su ile yıkayın. Numuneleri 4 °C'de, distile su içinde %1 uranil asetat ile gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, dokuları distile su ile durulayın ve bir fırında Welton'un kurşun aspartat boyası ile inkübe edin.Dokuların mümkün olan en iyi boyamalarını elde etmek görüntüleme için kritik öneme sahiptir, çünkü yetersiz boyama örnekte görüntülemeyi zorlaştıran veya imkansız hale getiren bir yüklenme fenomenine yol açar. Dokuyu distile su ile yıkayın. Örnekleri, her biri beşer dakika boyunca soğutulmuş etanol çözeltilerinden oluşan kademeli bir alkol serisiyley dehydrate edin ve ardından üç kez 10'ar dakika boyunca %100 etanol ile dehydratasyon işlemini gerçekleştirin.Numuneleri propilen oksitte, her biri 15 dakika sürecek şekilde iki kez yıkayın. Dokuları, gömme reçinesi ve propilen oksitten oluşan 1:1'lik bir karışıma yerleştirin, tüpün kapağını kapatın ve dokuları gece boyunca inkübe edin. Propilen oksidin dokuz saatlik süre boyunca buharlaşması için, iki saat sonra tüpün kapağını açın.Dokuları, temiz tüplerdeki %100 taze gömme reçinesine iki saat boyunca aktarın. Örnekleri, üzerinde basılı kağıt etiketler bulunan düz kalıplardaki taze gömme reçinesine gömün ve fırında kürleyin. Bir saat sonra doku yerleşimini ve hizalamasını kontrol edin ve gerekirse ayarlama yapın.Numuneleri ilgi alanına göre kırpın ve jelleştirilmiş siyanoakrilat hızlı yapıştırıcı kullanarak bir alüminyum pine monte edin. Ardından, alüminyum pine iletken bir yol sağlamak için bloğun yan taraflarını kolloidal gümüş pasta ile kaplayın. Doku örneklerini, oda içi ultramikrotom tablası ve düşük kilovoltlık geri saçılmış elektron dedektörü ile donatılmış bir taramalı elektron mikroskobu sistemi kullanarak inceleyin.Numuneleri bu ayarlar ile görüntüleyin. Görüntüleri orijinal tescilli 16-bit formattan 8-bit TIFF formatına dönüştürmek için Görüntü, Tür ve ardından 8-bit seçeneklerini belirleyerek analize başlayın. Eğer bu adım sırasında otomatik kontrast ve/veya parlaklık dönüştürme görüntüler için ideal değilse, 16-bit görüntüleri yeniden açın ve Görüntü, Ayarla, Parlaklık/Kontrast sekmesine basın.Tüm görüntüler için uygun olan bir aralık seçin ve Uygula'ya basın. Ardından dönüştürme işlemini gerçekleştirin. Kesitler arasında kabul edilemez düzeyde görüntü hareketi varsa, Eklentiler, Kayıt ve SIFT ile Doğrusal Yığın Hizalama seçeneklerini belirleyerek görüntü yığınlarını hizalayın ve hizalamayı rijit gövde yerine yalnızca öteleme moduna ayarlayın.Görüntü, Ayarla, Tuval Boyutu (Image, Adjust, Canvas Size) seçeneklerini belirleyerek hizalamadan önce tuval boyutunu genişletin. Alternatif olarak, istenen bölgeyi seçip kırparak görüntüyü ilgi alanına indirgeyin. Gerekirse, önce ImageJ'de Görüntü ve Ölçeklendir (Image and Scale) seçeneklerini belirleyerek görüntüleri daha küçük ve yönetilebilir bir boyuta ölçeklendirin.Düşük yoğunluklu nöronal kültürler üzerinde yapılan konfokal mikroskopi, nöronal somada bulunan mitokondrilerin retiküler bir ağ oluşturduğunu, distal nöritlerde bulunanların ise belirgin bir uzamış morfoloji sergilediğini göstermiştir. Seri blok-yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBFSEM) tekniği kullanılarak, fare beynindeki mitokondriler, dendritler ve aksonal varikositeler net bir şekilde gözlemlenmiştir. Fare beyin dokusunun nöritlerindeki mitokondrilerin üç boyutlu rekonstrüksiyonları, dendritik ve aksonal mitokondriler arasında boyut farkı olduğunu ortaya koymuştur.Temsili bir 2-D SBFSEM görüntüsünden elde edilen veriler, nöronal presinapslarda bulunan mitokondrilerin hacim veya boyutlarının, ekstrasinaptik bölgede bulunanlardan anlamlı derecede daha küçük olduğunu ortaya koymuştur. SBFSEM analizi ile elde edilen görüntüler, bireysel mitokondrilerin ultrastrüktürel özelliklerini görselleştirmek için artırılmış çözünürlük sağlar. Sinaptik olmayan somatik mitokondriler ve presinaptik mitokondriler gibi kolayca tanımlanabilen yapılara yakınlığı belirlenerek, mitokondrilerin hücresel kompartımanı sınıflandırılabilir.Bu teknik; üç günlük boyama, iki günlük reçine kürleme, analiz için uygun bir istif oluşturmak amacıyla bir günlük görüntüleme ve analiz hazırlığı için yaklaşık iki ila dört saatlik görüntü son işlemleme sürecini içeren toplamda yaklaşık yedi günde tamamlanabilir. Bu prosedür, mitokondriyal taşınım ile füzyon ve fissiyon dinamikleri hakkındaki soruları yanıtlamak için genetik olarak işaretlenmiş mitokondrilerin canlı görüntülemesi gibi mitokondri görüntülemeye yönelik diğer yöntemlerle birlikte de kullanılabilir.

analysis-brain-mitochondria-using-serial-block-face-scanning-electron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Mukherjee, K., et. al. Beyin Mitokondrilerinin Seri Blok Yüz Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanılarak Analizi. J. Vis. Uzm.  (2016)Bu video hazırlığı göstermektedir,  Mitokondriyal üst yapıyı görselleştirmek için bir seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBFSEM) kullanarak fare beyin dokusunun görüntülenmesi ve analizi, aksonal ve dendritik nöronal bölmelerdeki morfolojilerinin ve uzamsal dağılımlarının hassas bir şekilde haritalanmasını sağlar.

 Nöronal Mitokondrinin Seri Blok Yüz Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanılarak Görüntülenmesi

Konfokal mikroskopi taraması, canlı bir hayvanda perfüze kalp ya da iskelet kaslarında bir mitokondriyal etkinlik görüntülenmesi için uygulanır. Süperoksit basması ve membran potansiyel dalgalanmalar gibi tek mitokondriyal süreçlerinin gerçek zamanlı izleme fizyolojik ilgili bir bağlamda ve patolojik tedirginlikler sırasında mitokondrial fonksiyon değerlendirilmesini sağlar.

Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme In Vivo

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Bozulmuş mitokondriyal taşıma ve morfolojisi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda rol oynamaktadır. Sunulan protokol, kalıtsal spastik paraplejide mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı ön beyin nöronlarını kullanır. Bu protokol, aksonların boyunca mitokondriyal ticaretinin karakterizasyonuna ve nörodejeneratif hastalıkların incelenmesini kolaylaştıracak morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.

Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi beyin organoidlerinin üretimi ve mitokondriyal hastalıkların modelinde kullanımları için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Mitokondriyal Hastalık Modellemesi için İnsan Beyni Organoidlerinin Üretimi

Mitokondriyal ağ son derece karmaşıktır ve analiz edilmesini çok zorlaştırır. Yeni bir MATLAB aracı, hızlandırılmış görüntülerde canlı konfokal görüntülenen mitokondriyi analiz eder, ancak bireysel manuel dikkat gerektiren büyük bir çıktı hacmine neden olur. Bu sorunu çözmek için, hızlı dosya analizine olanak tanıyan rutin bir optimizasyon geliştirildi.

İzoforma Özgü Retinoik Asit Reseptörleri ile Canlı Nöronal Mitokondri Homeostaz Modülasyonunun Optimize Edilmiş Otomatik Analizi

Bu çalışma, fare beyin dokusunda immün boyama ve görüntü analizine dayalı olarak mitokondri morfolojisini analiz etmek için bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, bunun Parkinson hastalığı modellerinde protein agregasyonunun neden olduğu mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri nasıl tespit etmesine izin verdiğini de açıklar.

Bir Parkinson Hastalığı Modelinde Mitokondriyal Morfolojinin Histolojik İncelemesi

Bu protokol, sadece küçük miktarlarda numune mevcut olduğunda solunum süper komplekslerinin analizi için bir tekniği tanımlar.

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu 

Bu protokol, yaşlanma sırasında C. elegans'ın çoklu dokularında mitokondriyal morfolojiyi görüntülemek için standart bir yaklaşım sağlar.

Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

Bu çalışmada, adım adım bir protokol açıklıyoruz ve canlı hücrelerde mitokondrinin morfolojik özelliklerini belirlemek için numune hazırlama, görüntü elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere temel ayrıntıları vurguluyoruz. Bu yöntem, çeşitli koşulları incelemek için mitokondriyal morfolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılır.

Canlı Hücrelerde Mitokondriyal Morfolojinin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Belirlenmesi

Öğrenin fare beynindeki mitokondri morfolojisini seri blok-yüz taramalı elektron mikroskopi ile analiz etmeyi. Bu yöntem nörodejeneratif hastalıklarda mitokondri yapısındaki değişiklikleri incelemeye yardımcı olur.

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Daha fazla video keşfet