Name: Yaşlanma Sırasında C. elegansta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Öğrenin, C. elegans'ta yaşlanma sırasında mitokondriyal morfolojiyi görüntüleme ve ölçme yöntemini. Bu protokol, doku spesifik mitokondri değişikliklerini niceliksel olarak analiz etmek için standartlaştırılmış bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Analizi

<table><tbody><tr><td>Proliferasyon inhibisyonu için</td> <td>5-floro-2'-deoksiüridin (FUDR)</td> <td>Spektrum Kimyasalı</td><td>F2026-10GMBL</td></tr><tr><td>RNAi için</td><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td></tr><tr><td>NGM plakaları için</td><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>90000-764</td></tr><tr><td>NGM plakaları için</td><td>Bacto Peptone</td><td>VWR</td><td>97064-330</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>NGM plakaları için</td></tr><tr><td>RNAi Kolesterol için</td> <td>Karbenisilin</td><td>VWR</td><td>76345-522</td></tr><tr><td></td><td>NGM plakaları için</td><td>VWR</td><td>80057-932</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop ve nbsp;</td><td>İlaçlar için Stellaris 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>HistoBond mikroskop slaytları</td><td>VWR</td><td>16005-110</td><td>slayt hazırlama için</td></tr><tr><td>LB Et suyu</td><td>VWR</td><td>95020-778</td><td>LB</td></tr><tr><td>için LEICA S7E Diseksiyon Kapsamı</td><td>Leica</td><td>10450840</td><td>Standart diseksiyon mikroskobu</td></tr><tr><td>LEICA STELLARIS 5</td><td>Leica</td><td>158101100</td><td>Konfokal Mikroskop</td></tr><tr><td>LEICA THUNDER</td><td>Leica</td><td>11525679</td><td>Bileşik Mikroskobu</td></tr><tr><td>NGM plakaları için magnezyum</td><td>sülfat heptahidrat</td><td>VWR</td><td>97062-132</td>, M9</tr><tr><td>pL4440 boş vektör plazmid</td> için boş <td>vektör plazmid</td><td>addgene</td><td>plazmid # 1654</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>çamaşır suyu çözeltisi için</td></tr><tr><td>Potasyum NGM</td><td>plakaları için</td>fosfat dibazik <td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td></tr><tr><td>M9 için</td><td>potasyum fosfat monobazik</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td></tr><tr><td>Felç edici solucanlar için</td><td>sodyum azid</td><td>VWR</td><td>97064-646</td></tr><tr><td>NGM plakaları için</td><td>Sodyum Klorür</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td>,</tr><tr><td>çamaşır suyu çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>için M9 Sodyum hipoklorit VWR RC7495.7-32</td><td>M9 Tetrasiklin</td>hidroklorür için sodyum fosfat dibazik <td>VWR</td><td>71003-472</td></tr><tr><td></td><td>RNAi</td>WOB-L için <td>VWR</td><td>97061-638</td></tr><tr><td>; &AElig; Kuru Vakum Pompaları, Standart Hizmet, Welch&Not; &AElig;</td><td>Aspirasyon için</td> <td>VWR</td><td>80077-612</td></tr></tbody></table>

yaşlanma sırasında c. elegans'ta mitokondriyal morfolojinin görüntülenmesi ve Ölçülmesi

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans During Aging

C. elegans , aşırı numune hazırlama olmadan kolay bütün kurt, canlı hayvan görüntülemeye izin veren şeffaf gövdesi nedeniyle mitokondriyal görüntüleme için harika bir modeldir. Ek olarak, farklı dokulardaki mitokondriyal morfoloji, mitokondri hedefli floresan proteinleri eksprese etmek için dokuya özgü promotörler kullanılarak kolayca görselleştirilebilir. Burada, mitokondri hedefli bir GFP'nin (ATP-1 proteininin mitokondriyal lokalizasyon dizisi) ekspresyonunu sağlamak için myo-3p (kas mitokondri için), vha-6p (bağırsak mitokondri için) ve col-19p (hipodermal mitokondri için) kullanıldı. C. elegans'ın vücut duvarı kaslarının mitokondrisi, kas lifleri (miyofibriller) boyunca hizalanan tübüler morfoloji sergiler (Şekil 1A); bağırsak mitokondrisi, daha az düzgün hizalama ile yüksek derecede birbirine bağlı, ağ benzeri yapılar gösterdi (Şekil 1B); ve hipodermis, bağırsak veya kasa kıyasla daha yuvarlak veya oval şekilli görünen tübüler mitokondriye sahiptir (Şekil 1C). Mitokondriyal morfoloji genellikle kas ve bağırsaktaki solucanın uzunluğu boyunca tutarlıdır, ancak hipodermis, solucanın proksimal ve distal uçları arasındaki mitokondrinin birbirine bağlılığında bazı küçük farklılıklar gösterir. Bu nedenle, tekrarlanabilir deneysel sonuçlar elde etmek için vücutlarının belirli bir bölgesine odaklanılması önerilir. Burada, farenks ile farenksin ~100-200 μm altındaki vulva arasındaki alan tutarlı bir şekilde görüntülenir.
Kas ve hipodermal mitokondri için, bunları bir bileşik mikroskop altında görüntülemek, hücrelerin düzlüğü ve düşük odak dışı ışık seviyeleri nedeniyle yeterli çözünürlük sağlar. Bununla birlikte, bağırsak mitokondrisini bileşik mikroskopla gözlemlemek zordur, çünkü bağırsağın büyük hacmi, bağırsağın diğer bölümlerinden gelen büyük miktarda odak dışı ışık nedeniyle çözünürlüğü sınırlar (Şekil 2). Bu nedenle, odak dışı ışığı azaltmak ve uygun mitokondriyal morfolojiyi görselleştirmek için bağırsak mitokondrisinin konfokal mikroskop altında görüntülenmesi önerilir.
Mitokondrinin şekli oldukça dinamiktir ve hayvanlarınmetabolik ortamına 23 veya hatta değişken substrat sertliklerine24 maruz kalmaya bağlı olarak değişir. Bu nedenle, hayvanları bir besin kaynağının yokluğunda ve sert cam alt tabakası üzerinde uzun süre mikroskop slaytlarında bırakmak, mitokondriyal morfolojiyi potansiyel olarak etkileyebilir. Burada, bu çalışma, solucanların mitokondrilerinin M9 çözeltisindeki bir slayt üzerinde yaklaşık 30 dakika sonra parçalandığını ve hipodermal mitokondrinin en fazla parçalanmayı gösterdiğini buldu (Şekil 3). Bu nedenle, numune hazırlandıktan sonra mitokondrinin görüntülenmesi hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
Sodyum azid ve tetramisol de dahil olmak üzere solucan hareketliliğini kısıtlayan kimyasallar, C. elegans'ın canlı görüntülenmesi için yaygın olarak kullanılır, çünkü sabit solucanların 3D görüntüleme için hayvanların birden fazla z-kesitini yakalaması gerekir. Önceki çalışmalar, sodyum azid veya tetramisole maruz kalmanın mitokondriyal parçalanmaya neden olabileceğini göstermiştir25. Şaşırtıcı bir şekilde, sodyum azidin - yüksek konsantrasyonlarda bile - kas veya bağırsaktaki mitokondriyal morfoloji üzerinde sınırlı bir etkiye sahip olduğu bulundu. Bununla birlikte, hipodermis, M9 kontrollerinden daha erken mitokondriyal parçalanma göstermiştir (Şekil 3). Daha da önemlisi, yüksek konsantrasyonlarda tetramizol (100 mM), tüm hücre tiplerinde maruziyetten hemen sonra önemli mitokondriyal parçalanmaya neden oldu. Karşılaştırıldığında, orta konsantrasyonlar (10 mM), bir M9 kontrolüne kıyasla daha hızlı parçalanma ile sonuçlandı. Düşük konsantrasyonların (1 mM) mitokondriyal morfoloji üzerinde sınırlı bir etkisi olmuştur. Bu veriler, sodyum azid kullanımının mitokondrinin hızlı görüntülenmesi için uygun bir seçenek olabileceğini, tetramisolden ise genellikle kaçınılması gerektiğini göstermektedir.
Beklendiği gibi, C. elegans'ın tüm dokularının mitokondrileri, doğal yaşlanma sürecinde parçalanma gösterir (Şekil 4A). Parçalanma, genç hayvanlarda görüntülenen doğrusal, tübüler mitokondriden önemli ölçüde farklı olan daha kesik ve küresel yapılar olarak ortaya çıkan mitokondri olarak görselleştirilebilir. Bağırsağın daha sonraki yaşlarda küresel otofloresan yapılarda arttığına dikkat etmek önemlidir, bu nedenle otofloresanı gerçek mitokondriyal yapılarla karıştırmamaya özen gösterilmelidir. Solucanlar arasında mitokondriyal yapıdaki değişikliklerin değişkenliği olabileceğinden, mitokondriyal morfolojinin nicelleştirilmesini sadece birkaç solucanı görüntülemek yerine önemli bir örneklem büyüklüğünde yapmak önemlidir. Burada, nesneler, ağlar, ağ başına bağlantılar, bağlantı noktaları, nesne uzunluğu, mitokondriyal ayak izi, mitokondriyal kapsama alanı ve nesne alanı dahil olmak üzere çeşitli metrikler kullanılarak mitokondriyal morfolojinin otomatik olarak ölçülmesine izin veren mitoMAPR kullanılmıştır (Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2). Otomasyon, kullanıcıdan öznel önyargıyı ortadan kaldırır. Burada, yaşlanma sırasında kas ve bağırsak mitokondriyal morfolojisindeki değişiklikleri kantitatif olarak ölçmek için nesne uzunluğu metriğinin ve yaşlanma sırasında hipodermal mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri ölçmek için bağlantı noktaları metriklerinin optimal olduğunu rapor ediyoruz (Şekil 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig01.jpg"> 
Şekil 1: C. elegans'ın tüm vücudu boyunca mitokondri görüntüleri. Mitokondriyal görüntüleme, kas (A), bağırsakta (B) ve hipodermiste (C) MLS::GFP ekspresyonu olan transgenik hayvanlarda L1 aşamasından EV üzerinde yetiştirilen 5. günün tamamı boyunca gerçekleştirildi. Ölçek çubuğu: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig02.jpg"> 
Şekil 2: Bileşik mikroskop ve konfokal mikroskop arasındaki mitokondriyal görüntülemenin karşılaştırılması. Mitokondriyal görüntüleme, kas (A), bağırsakta (B) ve hipodermiste (C) MLS::GFP ekspresyonu olan transgenik hayvanlarda L1 aşamasından EV üzerinde yetiştirilen 1. gün yetişkin hayvanlarda gerçekleştirildi. Ölçek çubuğu: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig03.jpg"> 
Şekil 3: M9, sodyum azid ve tetramisol ile tedavi sonrası farklı dokuların mitokondriyal parçalanmasının değerlendirilmesi. Mitokondriyal görüntüleme, kas, bağırsak ve hipodermiste MLS::GFP ekspresyonu olan 1. gün yetişkin hayvanlarda gerçekleştirildi. Hayvanlar, L1 aşamasından itibaren EV'de yetiştirildi. Hayvanlar M9, sodyum azid (1 mM, 10 mM ve 100 mM) veya tetramizol (1 mM, 10 mM ve 100 mM) içeren slaytlara yerleştirildi ve görüntüleme slayt hazırlığından hemen sonra (0 dk) veya 15 dk veya slayt hazırlığından 30 dakika sonra yapıldı. Temsili görüntüler, 2 biyolojik kopya için suş başına n &gt; 5 hayvan için gösterilmiştir. Ölçek çubukları: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig04.jpg"> 
Şekil 4: Farklı dokularda yaşlanma sırasında C. elegans'ın mitokondriyal görüntülenmesi ve MitoMAPR kullanılarak mitokondriyal morfolojinin nicelleştirilmesi. (A) Mitokondriyal görüntüleme, yetişkinliğin 1, 5, 9, 13 ve 15. günlerinde kas, bağırsak ve hipodermiste MLS::GFP ekspresyonu ile yetişkin hayvanlarda gerçekleştirildi. Hayvanlar, L1 aşamasından itibaren EV üzerinde büyütüldü ve 1. gün yetişkin aşamasından itibaren FUDR içeren EV plakalarına taşındı. Görüntüler, ≥ 3 biyolojik kopya için suş başına n ≥ 5 hayvanı temsil eder. Ölçek çubuğu: 5 μm. (B) 1, 5, 9, 13 ve 15. günlerde solucanların kas mitokondri ve bağırsak mitokondrilerinin nesne uzunluğunun ölçülmesi ve 1, 5, 9, 13 ve 15. günlerde solucanların hipodermal mitokondrilerinin birleşme noktalarının nicelemesi. ±Grafikler çizildi ve öğrenci t-testi kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi. ns = anlamlı değil, *p &lt; 0.03; **p &lt; 0.002; p &lt; 0.0002; p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solucan günleri</td>
			<td>Solucan sayısı</td>
			<td>Tampon hacmi (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Slaytlar hazırlanırken önerilen solucan sayıları ve tampon hacimleri.
Ek Şekil 1: MitoMAPR kullanılarak tek bir görüntü nicelemesinin uygulanmasının iş akışları ve birden fazla görüntü için toplu işleme. (A) MitoMAPR makrosu kullanılarak tek bir görüntüden mitokondriyal morfolojiyi ölçme iş akışı. (B) Fiji kullanılarak ham 3D görüntü dosyasının Z projeksiyonu (Maks. projeksiyon). (C) Z'nin yansıttığı görüntüden ilgilenilen bölgeyi kırpma. (D) MitoMAPR makrosundan elde edilen iskelet görüntüleri. Ölçek çubukları: 5 μm. (E) MitoMAPR makrosunu kullanarak toplu işlem kullanarak birden fazla görüntüden mitokondriyal morfolojiyi ölçme iş akışı. (F) Kırpma makrosunun ekran görüntüsü. (G) Z projeksiyonu için bir toplu işlemin ekran görüntüsü. (H) Toplu kırpma makrosunun seçim onay penceresinin ekran görüntüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Mitokondriyal morfoloji metriklerinin kantitatif analizi C. elegans kas dokusu. Kaydedilen metrikler arasında nesneler, ağlar, ağ başına bağlantı noktaları, nesne uzunluğu, mitokondriyal ayak izi, nesne alanı ve farklı günlerde ölçülen mitokondriyal kapsama alanı yer alır. Veriler, yaşlanma ile birlikte mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri değerlendirmek için bir temel sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 2: İmmobilize edici kimyasalların C. elegans'ta mitokondriyal morfoloji üzerindeki etkileri. Veriler, M9 tamponu veya farklı tetramisol ve sodyum azid konsantrasyonları ile numune hazırlandıktan sonra değişen konsantrasyonlar ve zaman noktalarında nesneler, ağlar, ağ başına bağlantı noktaları, nesne uzunluğu, mitokondriyal ayak izi, nesne alanı ve mitokondriyal kapsama alanı gibi ölçümleri içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

Mitochondria, important cellular organelles found in most eukaryotic cells, are major sites of energy production through aerobic respiration. Beyond this ...

imaging-quantifying-mitochondrial-morphology-c-elegans-during

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İskelet kası hareket etmek için gerekli olan ve bedenimizin ana protein deposudur. C. elegans içinde kas sağlık ölçüleri tanımlanmıştır. Kas yapısı ve fonksiyonu için Aday değişiklikler lokalize GFP ve katyonik boyalar kullanılarak değerlendirilir.

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP ° C. elegans

Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Mitofaji'yi elektron mikroskobu, genetik sensörler ve immünofloresan yoluyla keşfetmek, pahalı ekipman, yetenekli personel ve önemli bir zaman yatırımı gerektirir. Burada, ticari bir floresan boya kitinin hem Caenorhabditis elegans hem de bir karaciğer kanseri hücre hattındaki mitopaji sürecini ölçmedeki etkinliğini gösteriyoruz.

Caenorhabditis elegans ve Memeli Hücrelerinde Mitopajinin Organele Özgü Boyalar Kullanılarak Saptanması

Mitokondriyal boya terminali olan Schwann hücre mitokondrilerinin in vivo konfokal mikroskopi için yerel enjeksiyonları. Bu yöntem, sağlıklı veya hasta kaslı farelerin iskelet kas dokularında gösterilen kavram kanıtını kullanarak yüksek çözünürlüklü mitokondriyal görselleştirme sağlar.

Farelerin Kas ve Terminal Schwann Hücrelerinde Mitokondriyal Morfolojinin Yerinde Niceletilmesi Yöntemleri

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Niceliksel kemotaktik tepkiyi değerlendirmek için bir...

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Burada C. elegans'ta gelişimsel süreçlerin nasıl izleneceği ve nicelleştirileceği gösterilmektedir. Sunulan yöntemler, kolayca uygulanabilen açık kaynaklı araçlara dayanmaktadır. 3B hücre şekli modellerinin nasıl yeniden yapılandırılacağı, hücre altı yapıların manuel olarak nasıl izleneceği ve kortikal kasılma akışının nasıl analiz edileceği gösterilmiştir.

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Burada sunulan yöntem model organizma C. elegansnormal yaşlanma sırasında protein toplama keşfetmek için hedeftir. Protokolü temsil eden yaş ile oluşturmak son derece çözünmez büyük toplamları çalışmaya ve nasıl protein toplama proteostasis değişiklikleri etkisini belirlemek için güçlü bir araç.

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

Öğrenin, C. elegans'ta yaşlanma sırasında mitokondriyal morfolojiyi görüntüleme ve ölçme yöntemini. Bu protokol, doku spesifik mitokondri değişikliklerini niceliksel olarak analiz etmek için standartlaştırılmış bir yaklaşım sunar.

Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet