Optik tabanlı bir sistem kullanarak hidrojel gömülü bozulmamış fare kas liflerinin yüksek verimli kasılma ölçümleri
5 Mayıs 2023
İskelet kası fonksiyonu, geleneksel olarak zahmetli, düşük verimli yaklaşımlar kullanılarak, izole kas liflerinin kontraktilitesini ölçerek değerlendirilebilir. Burada, hidrojel gömülü kas liflerinin kontraktilitesini ölçmek için optik tabanlı, yüksek verimli bir yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşımın ilaç taraması ve terapötik gelişim için uygulamaları vardır.
Bu protokol, genetik mutasyonların kas lifi fonksiyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Ek olarak, kas sağlığını iyileştirmeyi amaçlayan ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilir. Bu teknik, ileri eğitime gerek kalmadan nispeten kısa bir süre içinde çok sayıda kas lifindeki kontraktiliteyi izole etmek ve ölçmek için kullanılabilir.
Hidrojellerin bileşimi, hem sağlıklı hem de hastalıklı kaslardaki çevresel ipuçlarının etkisini kanıtlamak için değiştirilebilir. İşlemin en zorlu kısmı kasın ilk diseksiyonudur. Yeterli özen gösterilmezse, kasın hasar görmesi kas liflerinin canlılığında bir azalmaya neden olabilir.
Prosedürü gösterenler, araştırma teknisyeni Leander Vonk ve laboratuvarımda doktora adayı olan Osman Esen olacak. Ötanazi farenin alt arka bacağını ayak bileğinin hemen üstünde keserek başlayın. Ayağın dorsal tarafındaki deride ayak parmaklarına doğru bir kesi yapın.
Kaslara zarar vermemeye özen göstererek cildi ayak parmaklarına doğru dikkatlice soyun. Disseke edilmiş ayağı, 37 santigrat derecede 10 mililitre önceden ısıtılmış diseksiyon ortamı içeren bir conta koruma kabına yerleştirin. Ayağı hala ayak parmaklarına bağlı olan deriden geçirin.
Alt bacağı ayak bileğinin ötesine sabitleyin ve kasın üstündeki bağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Tendonu topuktan kesin ve kası kaldırın. Ayak parmağı tendonları açığa çıkana kadar bağ dokusu boyunca kasın yanında ve altında kesin.
Üç tendonun uzunluğunun yarısı açığa çıktığında tendonları kesin. Kasları ayaktan serbest bırakın ve FDB kaslarının tendonlarını sabitleyin. Kalan bağ dokusunu kastan çıkarın.
Temiz kas dokusunu önceden ısıtılmış diseksiyon ortamı içeren bir tüpe aktarın. Brevis kasını kas sindirim ortamını içeren bir tüpe aktarmak için serolojik bir pipet kullanın. Dokuyu 80 dakika boyunca% 5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.
Kas, üç mililitre diseksiyon ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hazırlanan tritürasyon uçlarını kullanarak, en büyüğünden en küçüğüne giden kası pipetleyin ve kas lifleri tendondan çıkana kadar tritürasyona devam edin. Tendonlar bir P200 ucu ile çıkarılabilir.
Ayrışmış kas liflerini, 10 mililitre diseksiyon ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir pelet oluşana kadar liflerin inkübatöre 20 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Tüm ortamı fiber peletin üstünden dikkatlice pipetin.
Buz üzerinde, hücreleri kas başına 875 mikrolitre hücre karışımında yeniden askıya alın. 125 mikrolitre hücre süspansiyonu aliquot içeren tüplere 125 mikrolitre matris hücre karışımı ekleyin. Kabarcık oluşumunu önleyerek nazik pipetleme ile karıştırın.
Son karışımı hemen bir kuyuya aktarın. Kas liflerinin canlılığını mikroskop altında kontrol edin. Katılaşmayı teşvik etmek için jelleri 30 ila 45 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
İşiniz bittiğinde, her bir kuyucuğa dikkatlice 500 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Optik tabanlı kontraktil ölçüm sistemini, floresan lambayı, elektrik hücresi pacer'ı ve bilgisayarı açın. İzole kas liflerini uyarmak için elektrik stimülatörü 10 voltta 1.0 hertz'e ayarlayın ve beş milisaniyelik bir nabız süresine sahip olun.
Plakayı ölçüm sistemine yerleştirin. Pacer'ı kesici uca bağlayın ve kültür plakasına yerleştirin. IonWizard programını açın.
Tamam'ı tıklatın. Dosya simgesine tıklayarak yeni bir dosya açın ve ardından Yeni'yi tıklayın. Programın doğru deney iskelet sarkomerinde olup olmadığını kontrol etmek için Deneyi Topla'yı seçin. Denemeyi değiştirmek için, istediğiniz denemeye tıklayın ve ardından Ekle'ye basın.
SARC 20X, ortalama çizgiler, tek FFT, 250 hertz örnekleme hızı ve 10 saniyelik bir alma süresi ayarlarını uygulayın. Ölçüm sistemi sıcaklığını 25 santigrat dereceye değiştirin. Yeni bir ekran açılır penceresi oluşturmak için açık hücre bulucuya tıklayın.
Plaka Tipini ve Aktif Kuyuları seçin. Netleme kaydırma çubuğunu ayarlayarak fiberleri odaklayın. Elektriksel stimülasyonu indüklemek ve lif seğirmesini gözlemlemek için tempoyu etkinleştirin.
Sarkomerleri odakta tutarak, ölçüm alanının fiber ucuna sabitlendiğinden emin olun, böylece sarkomerler dikey olarak çalışır. Sarkomerler odaklandığında, araç çubuğunda kasılma üzerine sağa doğru hareket edecek tek bir tepe görülebilir. Ölçüm sistemindeki lifleri ölçün.
Denemeyi başlatmak için Başlat'ı tıklayın. 10 kasılma geçicisini ölçmeye başlamak için Q tuşuna basın. Dörtten fazla geçici ses gürültüsüz görünüyorsa, Z tuşuna basarak ölçümü kabul edin.
Geçiciler çok fazla gürültü içeriyorsa, ölçümleri reddedin. Deneme tamamlandıktan sonra hücre bulucu penceresini kapatmak için Durdur'a basın. Dosyayı kaydedin ve yeni bir dosya oluşturun.
CytoSolver masaüstü programını açın, ardından İçe Aktar'a tıklayın ve analiz edilecek dosyaları seçin. Analiz tamamlandıktan sonra mavi, kırmızı ve gri tepeleri tanımlayın. Dışa Aktar'a tıklayın.
Geçici Verilere Ortalama başlıklı kutuları seçin ve Excel'e aktarın. Yanal hareketleri ve diğer etkileyen faktörleri önlediği için 3D fibrin hidrojelde kullanılabilir kasılma kas ölçümlerinin daha yüksek bir yüzdesi elde edildi. Fiber gömmenin maksimum büzülme hızı veya sarkomer kısalması üzerinde önemli bir etkisi yoktu.
Saf bazal matrikste azalmış kasılma, muhtemelen jel sertliği veya artmış hücre matriksi etkileşimi nedeniyle gözlenmiştir. Benzer şekilde, bazal matris gömme de fibrin hidrojeline kıyasla sarkomer kısalmasını azaltmıştır. İzole kas liflerinin oldukça kırılgan olduğunu ve pipetleme sırasında onlara zarar vermemek için ekstra özen gösterilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.
İzolasyon işleminden sonra immün boyama, protein ve RNA izolasyonu gibi yöntemler de uygulanabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, olgun kas lifi fonksiyonunu yüksek verimli bir şekilde incelemek için yeni olanaklar açmıştır.
Genel Bakış
Bu makale, hidrojel ile gömülmüş kas liflerine ait kasılabilirliği kantifiye etmek için yüksek verimli, optik tabanlı bir yöntemi açıklamakta olup, geleneksel düşük verimli tekniklerin sınırlamalarını gidermektedir. Bu yaklaşım, genetik mutasyonların değerlendirilmesini sağlar ve kas sağlığını iyileştirmeyi amaçlayan ilaç taraması çabalarını desteklemektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- İskelet kası fonksiyonu
- Yüksek verimli tarama
- Terapi geliştirme
Arka Plan
- Geleneksel yöntemler zahmetli ve düşük verimlidir.
- Yalıtılmış kas liflerinin kasılabilirliğini değerlendirmek, kas sağlığını anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Hidrojeller, çevresel etkilerin kas fonksiyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için modifiye edilebilir.
Kullanılan Yöntemler
- Fare dokusundan kas liflerinin izolasyonu ve sindirimi
- Optik tabanlı kasılma ölçüm sistemi
- Kasılma verileri için yazılım kullanarak analiz
Ana Sonuçlar
- Geliştirilen teknik, çok sayıda kas lifindeki kasılabilirliği verimli bir şekilde ölçmeye izin verdi.
- 3D fibrin hidrojel içine gömme, ölçüm güvenilirliğini artırdı.
- Jel bileşimindeki değişiklikler, kas fonksiyonu metriklerini etkiledi.
Sonuçlar
- Bu çalışma, kas lifi fonksiyonunu yüksek verimli bir şekilde incelemek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.
- Temel biyoloji ve kas sağlığındaki terapötik uygulamalar için geçerlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-throughput contractile measurement of hydrogel-embedded intact mouse muscle fibers enables robust functional assessment of skeletal muscle in discovery-stage research. This optics-based system supports scalable evaluation of genetic mutations and pharmacological interventions, directly impacting target validation and early screening workflows. The approach enhances predictive confidence for muscle-related therapeutic programs and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of genetic mutations affecting muscle contractility.
- Supports biological de-risking by preserving native muscle architecture in ex vivo assays.
- Facilitates rapid hypothesis testing for muscle-targeted therapeutic strategies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, physiologically relevant muscle fiber systems for compound screening.
- Delivers quantitative, reproducible contractile readouts for assay standardization.
- Enables high-throughput evaluation of pharmacological agents on muscle function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for genetic muscle disorder studies.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of muscle-targeted interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of muscle health programs.
Pipeline & Workflow Integration
This optics-based contractility system integrates from early discovery through lead identification and preclinical research for muscle-targeted therapies.
- Discovery Biology: Supports mechanistic hypothesis testing and pathway clarification in muscle function.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible contractile measurements for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as sarcomere shortening and contraction velocity for comparative analysis.
- Translational Research: Enables ex vivo modeling of genetic muscle disorders for translational continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for diverse muscle biology and pharmacology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in muscle-targeted programs.
- Operational Value: Standardizes contractile measurements and enhances throughput for screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in early-stage muscle research.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of muscle health and genetic disorder assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in muscle dissection and ex vivo tissue handling.
- Needs access to optics-based contractile measurement instrumentation and compatible analysis software.
- Demands careful standardization of hydrogel composition and electrical stimulation parameters.
- Adaptable to different muscle models and environmental conditions for broader application.
- Muscle fiber fragility and dissection complexity may limit throughput if not carefully managed.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Murine Flexor Digitorum Brevis Muscle Dissection
2:07
Muscle Digestion, Trituration, and Gravity Sedimentation
2:59
Fiber Embedding
3:44
Optics‐Based Contractile Measurements
6:20
Results: Embedded Muscle Contraction Assessment
6:59
Conclusion
