Mikrodesenli Elastomerler Kullanarak Tek Hücreli Kasılmanın Basitleştirilmiş, Yüksek Verimli Analizi

Bu çalışma, floresan olarak etiketlenmiş elastomerik büzülebilir yüzeyler (FLECS) Teknolojisini, floresan protein mikrodesenlerinin görselleştirilmiş yer değiştirmelerine dayanan tek hücreli kontraktil kuvvetlerin basitleştirilmiş, eller kapalı nicelleştirilmesi için mikrowell formatında kullanmak için esnek bir protokol sunmaktadır.

Hücre tarafından üretilen mekanik kuvvetler, vücuttaki çeşitli organlarda düzgün çalışması için gereklidir. Ayrıca bağırsaklar mesane, kalp ve diğerleri. Bu organlar, iç hemostatik durumu korumak için stabil hücre kasılma ve gevşeme kalıpları üretmelidir.

Anormal düz kas hücresi kasılması, bağırsak dismotilitesi de dahil olmak üzere çeşitli bozuklukların başlamasına yol açabilir, ayrıca kas kasılması ile anormal bağırsak paternlerini ve ayrıca aşırı aktif veya az aktif mesane gibi durumları karakterize eder. Ve hava yolunda, herhangi bir düzensiz paternle sözleşme yapan bazı kas hücreleri astımlı hiper duyarlılığı tetikleyebilir. Açıkçası, hücreler ve dokular içindeki kasılma mekanizmaları, tedavi seçenekleri gerektiren hastalıklara yol açabilir.

Ve bu koşullar doğrudan hücrelerin işlevsiz kasılma davranışlarından kaynaklanabileceğinden, potansiyel ilaç adaylarını tararken hücre kontraktil fonksiyonunun kendisini ölçmek hem mantıklı hem de gerekli hale gelir. Mikro teknolojideki son gelişmeleri takiben, tek hücre kasılmasının kantitatif ölçümlerini sağlayan kullanıcı dostu bir mikro plaka tabanlı test geliştirdik. Floresan olarak etiketlenmiş elastomerik büzülebilir yüzeyler olarak da bilinen flex adı verilen yüz binlerce hücrede.

Bu yaklaşımda, floresan protein mikro desenlerini ve böylece hücreler onlara çekiş kuvvetleri uyguladığında deforme olan ve küçülen yumuşak filmleri gömüyoruz. Önemli olarak, protein mikro desenleri hücre pozisyonunu, şeklini ve yayılma alanını kısıtlar. Tek tip test koşulları ve sadece boyutsal değişimlerine dayanan basit ölçümlere izin verir.

Genel olarak, tarayıcı tabanlı bir görüntü analiz modülü içeren platform, hassas kullanım prosedürleri veya güvenilir belirteçlerin tescili gerektirmeden büzülebilir hücre kuvvetinin doğrudan analizini sağlar ve temel hücre kültürleri ve düşük büyütmeli basit floresan mikroskobu ile herhangi bir araştırmacı tarafından çalıştırılabilir. Bu teknoloji, son kullanıcı göz önünde bulundurularak tasarlanmıştır ve herhangi bir laboratuvar bilimcisinin hücresel kuvvet biyolojisini incelemesi için giriş engelini azaltmayı amaçlamaktadır Kronik bir tüpe 20 mililitre medya ekleyerek başlayın, hücre kontraktilitesini test etmek için tasarlanmış 24 kuyucuklu bir plaka elde edin. Pipetinizi 500 mikrolitreye ayarlayın ve hücre patojeni için bir hücre süzgeci elde edin.

24 delikli plaka üzerindeki kapağı çıkarın, plakayı bu şekilde tutun, ardından plakanın üstündeki plastik tabakayı yavaşça çıkarmaya devam edin. Plakayı dikkatlice geri yerleştirin. Herhangi bir dökülmeyi önlemek için her bir kuyucuktan sadece üst tabaka PBS'yi aspire edin.

Şimdi, her seferinde bir sıra, kalan PBS'yi kuyudan çıkarın ve 500 mikrolitre hücre ortamı ile hızla doldurun. Plakayı yavaşça sallayın ve kuyucuğun tüm tabanının çözelti ile kaplandığından emin olmak için yan tarafına dokunun. Tüm kuyular medyayla doldurulduktan sonra, plakayı yana doğru ayarlayın.

Bu noktada, hücre kültürünüzü inkübatörden alın. Sağlam bir ortaklık protokolü yürüteceğiz. Bu protokolün amacı, mililitre başına 50.000 hücrelik bir süspansiyon oluşturmaktır.

Hücreleri tohumlamadan önce, hücrelerinizi süzgeçten bir kez süzdüğünüzden emin olun, hücre kümelerini tek hücrelere ayırmak için, hücre çözeltinizin 500 mikrolitresini dikkatlice her bir kuyucuğa yerleştirin. Hücre tohumlamasından sonra, plakaların bir saat boyunca oturmasına izin vermek önemlidir, böylece hücreler doğrudan desenlere yerleşebilir. Bir saat geçtikten sonra, plakayı gece boyunca bir inkübatöre yerleştirin.

Deneyin ikinci kısmı, ilaçların 24 delikli plakaya eklenmesi ve plakanın floresan görüntülenmesinden oluşmaktadır. Protokolün bu kısmı için, sağlam hücre canlılığı ve yanıtı sağlamak için iki önemli gereksinimimiz var. Birincisi, DMSO'nun hücreli kuyucuklardaki son konsantrasyonunun% 1'den fazla olmamasıdır, yani ilaç stoklarımızdan 100 tam seyreltme yapmamız gerekir.

İkincisi, DMSO'yu doğrudan kuyucuklara ekleyemeyiz, çünkü bu karışımın dibine çarpacak ve daha sonra yüksek konsantrasyona sahip hücrelere zarar verecektir. Bunun yerine, hücrelere yüksek lokal DSSO maruziyetini önlemek için iyice karıştırabileceğimiz bir DMS0 ilaç ve ortam ara çözeltisi oluşturmalıyız. Bu protokolde, 40 mikromolardan bir nano molar arasında bir aralığı kapsayan altı adımlı sekiz katlı bir seyreltme yapacağız 30 mikrolitre stok ilaç çözeltisini ardışık 210 mikrolitre hacim DMSO'ya aktararak ve her transfer adımı arasında iyice karıştırarak altı adımlı sekiz aşamalı seyreltme serisini oluşturun Deneyimizde, blebbistatinin etkisini değerlendireceğiz.

kas hücreleri yoluyla insan mesanelerinde. Her iki gereksinimi de karşılamak için öncelikle bir ara ilaç DMSO ve medya çözümü oluşturacağız. Bu, DMSO'nun 16.7 kat seyreltilmesini sağlar.

Daha sonra bu ara ilaç çözeltisini hücrelerimize ekleyeceğiz, ilave altı kat seyreltme sağlayan oranlar kullanarak, toplam 100 tam seyreltme ve% 1'lik son konsantrasyonla sonuçlanırDMSO Bunu başarmak için, her stok ilaç çözeltisi için, 30 mikrolitre ilacı 470 mikrolitre hücre kültürü ortamına karıştırın, ardından bu ara çözeltinin 200 mikrolitresini 24 delikli plakadaki uygun kuyuya aktarın, her kuyuda 1000 mikrolitre içerir. Bu, toplu olarak, uygun süre boyunca% 1'lik bir DMSO İnkübat nihai konsantrasyonu verir. Deneyimizde, 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırıyoruz, görüntü almaya hazır olduğunuzda, kuyularınızın her yerine canlı bir nükleer leke ekleyin, stoktan bir ila 10.000 seyreltme ekleyin.

15 dakika daha kuluçkaya yatmasına izin verin. Görüntülemeye hazır olduğunuzda, hem etiketli hücre çekirdeği hem de floresan boya için floresan kanallarını görüntülemek üzere donatılmış bir floresan mikroskobuna ihtiyacınız olacaktır. Mikro desenler, örneğimizde tri C kanalı olan etiketlenmiştir.

Şimdi, tek hücreleri tanımlamak için floresan görüntüleme blebbistatin çekirdekleri olacağız, leke hücresi çekirdeklerini mikro deseni görüntülediğiniz gibi tam olarak aynı konumda görüntülediğinizden emin olun, böylece analiz sırasında hizalanabilirler. Alınan görüntüleri bilgisayarınıza yükleyin, desen kanallarının PT'nin alt çizgisiyle biteceği şekilde görüntülerin düzgün etiketlendiğinden emin olun. Ve nükleer kanaldaki görüntüler dapi'nin altını çiziyor. Şimdi, tif görüntülerini PNG görüntülerine dönüştüreceğiz, J resmini kullanarak J resmi açıldıktan sonra, bir seferde bir kanala yükleyin.

Sinyali en üst düzeye çıkarmak ve arka planı en aza indirmek için önce desen kanalını yükleyeceğiz ve kontrastı ayarlayacağız. Ayrıca, görüntüyü düzgünleştireceğiz. Görüntü beğenimize göre değiştirildikten sonra, görüntü türünü sekiz bit olarak değiştireceğiz.

Ardından görüntüyü PNG türü olarak dışa aktarın. Ardından kutuyu işaretleyin, dosya adları olarak dilim etiketleri kullanın. PNGs adlı yeni bir klasör oluşturun.

Ardından PNG dosyalarını oraya kaydedin, Görüntüleri analiz etmek için Biodock nokta AI'ya gidin, bir hesap oluşturun ve analiz modülüne ücretsiz erişim sağlamak için yazarlarla iletişime geçin. Hesabınız oluşturulduktan sonra giriş yapın. Burada yeni resimler yükleyebilirsiniz.

Bu yeni toplu iş web deneyi verilerine JoVE adını vereceğiz. Şimdi, görüntüleri sürükleyip bırakarak içe aktarabiliriz, bu noktaya OK.At basın, verilerinizi seçin. Ardından analiz et'e tıklayın, kontraktilite analizi etiketli modüle ilerleyin ve ardından seç'e basın.

Büyütmeyi görüntüleme için kullandığınız değere ayarlayın Veriler tamamlandıktan sonra, üzerine tıklayın ve ardından verileri indir'i seçebiliriz. Veriler indirildikten sonra, girilen her görüntü için bindirmeli görüntü çiftlerini görebiliriz. Ayrıca, her bir hücre kümesi için ortalama kasılmayı bize verecek özet bir istatistiğe de erişebiliyoruz.

Kasılma için ölçü birimi piksel cinsindendir. Buradaki verilere baktığımızda, sadece DMSO ile tedavi edilen kuyularda, blebbistatin ile tedavi edilen hücrelere kıyasla çok daha yüksek bir hücre kasılması olduğunu görebiliriz. Ayrıca, görüntülerin herhangi birinde algılanan her bir desen için verilere erişimimiz vardır.

Bu bize görüntünün konumu, görüntü kaynağı, konum türü, sıfır bir veya birden fazla hücre sayısı, mikro modelin boyutu ve hücrelerin hesaplanan daralması hakkında ayrıntılı bilgi verir. Bu döşeme, mikro plaka içindeki tanımlanmış her bir modelden oluşur. Bu listedeki tek hücre desenleri, diğer dosyadaki PNG görüntüsünün ortalama daralmasını hesaplamak için ortalamaydı.

Tek hücreli verileri denemeniz için gerektiği şekilde sıralayabilir ve analiz edebilirsiniz. Videonun bu kısmı için, iki farklı ilaçla tedavi edilen mesane düz kas hücrelerinden alınan yanıt verilerini gösteren 24 kuyucuklu bir plakadan toplanabilen temsili verileri göstereceğiz. Bunlar sırasıyla DMSO ve blebbistatin ile tedavi edilen kuyuların görüntüleridir.

Burada, sadece DMSO ile tedavi edilen hücrelerin çok sayıda sözleşme mikro modeli sergilediğini, ancak blebbistatin ile tedavi edilen hücrelerin daha büyük olduğunu ve daha az kasılma olduğunu fark etmeye açık olduğunu görebiliriz. Bu histogramdaki veriler, hücrelere yapılan farklı tedavilerin bir sonucu olarak varyasyon hücresi kontraktilitesini gösterir. Blebbistatin ile tedavi edilen hücreler için dağılım merkezi, DMSO ile tedavi edilen hücreler için dağılım merkezinden daha düşüktür.

Bu, önceki görüntülerde görüntülenen bilgilerle tutarlıdır. Çünkü blebbistatin ile tedavi edilen hücreler çok daha küçük kasılma sergiledi. Bu, blebbistatin ile tedavinin hücreleri önemli ölçüde rahatlattığını gösterir.

Bu veri kümelerinin her biri, videoda gösterilen protokolleri izleyerek, tek bir 24 delikli plakadan toplanabilen doz yanıt eğrisindeki bir noktaya katkıda bulunur. Burada, sitokalasin D'nin, daha yüksek ilaç konsantrasyonları göz önüne alındığında, daha düşük kasılma değerleriyle gösterildiği gibi blebbistan'dan daha güçlü olduğunu görebiliriz. Deneylerinizi önemli ölçüde ölçeklendirmek istiyorsanız, 384 kuyu plakası versiyonu mevcuttur ve bu, deneyleri önemli ölçüde ölçeklendirmek için otomasyonla birlikte kullanılabilir.

Bu veriler, 24 kuyucuklu plakadaki her ilaç için altı seyreltme adımına sahip olmak yerine, 384 kuyu plakasından toplanabilir, 384 kuyu plakası, birden fazla kopyaya sahip her ilaç için 20 seyreltme adımı gerçekleştirmemize izin verir. Kar taneleri teknolojisi benzersizdir. Şimdiye kadar imkansız olan mikroskopi kullanılarak tek hücreli kasılmanın görselleştirilmesine izin verir.

Bu nedenle, teknoloji, floresan olarak etiketlenmiş protein ile desenli metriklerin biçimine dayanır. Sistematik model, hücresel kasılma için oluşacak ve herhangi bir ilaç tarafından bir fenotip sözleşmesinin modülasyonunun hassas bir şekilde ölçülmesine izin verecektir. Tabii ki, bu teknoloji hala astım, kardiyovasküler hastalıklar, inflamasyon immün onkolojisi ve tabii ki anormal hücresel kasılmanın hastalığın ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı hastalık endikasyonlarımızdan herhangi biri gibi uygulamalar ve birçok farklı hastalık alanı için aktif olarak geliştirilmektedir.

Hücre kontraktilitesini ölçmek için bu mikro modelleme tabanlı teknolojiyi gösterdiğimiz gibi, geleneksel çekiş kuvveti mikroskobuna basitleştirilmiş bir alternatif sunarak, sezgisel analiz sağlar, modelin küçülmesini izler ve büyük hücre popülasyonlarında tek hücre çözünürlüğü sağlar. Bazı hususlar, bu yöntem, T hücreleri ve nötrofiller gibi çok küçük hücrelerin veya yapışmayan hücre tiplerinin kullanımı için zorluklar doğurabilir. Ek olarak, haftalık olarak bağlanan, ağırlıklı olarak birbirine bağlanan veya tamamen yayılmayan hücreler, ölçülebilir kontraktil sinyaller üretmeyecektir.

Teknolojinin kullanıcıları, kendi hücre tipleri için farklı olası hücre kültürü ortam formülasyonlarını dikkatlice değerlendirmelidir. farklı bileşenler olarak, büyüme faktörleri, serum seviyeleri ve pH duyarlılıkları değişken davranışları tetikleyebilir. Protokollerin optimizasyonu, deneysel iş akışlarının ölçeklendirilmesine devam etmelidir.

Sonuç olarak, tek hücre çözünürlüğü gerekli değilse veya hedef hücre tipi minimum yayılma kapasitesine sahipse, bu tür deneyler için geleneksel çekim kuvveti mikroskopi yöntemleri kullanılabilir. Aksi takdirde, bu aracın hücre biyologlarının hücresel kasılmayı incelemeleri ve çalışmalarını gerçekleştirmeleri için ek bir yol sağladığını umuyoruz.