Aktif Aktin Bazlı Montajların Kasılma ve Deformasyon Modlarının In Vitro Olarak Ayarlanması: İki Boyutlu Aktif Ağlardan Sıvı Kristal Damlalara

Bu araştırma, yumuşak biyolojik malzemelere odaklanmakta ve biyolojik hücrelerden ilham alan materyalleri, şekli ve organizasyonu düzenleyen altta yatan fiziksel mekanizmaları keşfetmeyi amaçlamaktadır.

Biyolojik ve in vitro model sistemleri, doğası gereği karmaşıktır ve birçok tuzakla doludur ve numune hazırlama, tekrarlanabilirlikleri için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, bu sistemlerde tekrarlanabilirliği geliştirmek için tasarlanmıştır.

Bu sonuçlar, mekanizmaları tespit etmenin, karakterize etmenin ve fiziksel kuvvetlerin ve biyomalzemelerin işlevini anlamanın yolunu açmaktadır. Bu, çeşitli biyopolimerler ve organeller için genelleştirilebilir.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, bir mikro santrifüj tüpüne beş mikrolitre 10XF tampon ekleyerek yüklenecek numuneyi hazırlayın ve kalan bileşenler eklendikten sonra nihai numune hacmi 50 mikrolitre olacak şekilde bir hacimde deiyonize damıtılmış su ekleyin. Çözeltiye bir mikrolitre %25 beta-merkaptoetanol, mililitre başına 225 miligram bir mikrolitre glikoz, bir mikrolitre glikoz oksidaz karışımı ve mililitre başına 85.000 birim katalizör pipetleyin. Daha sonra bir mikrolitre 25 milimolar ATP ve 10 mikrolitre %2, 15 centipoise metilselüloz ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Aktin polimerizasyonuna başlamak için, etiketlenmemiş aktini etiketli aktin ile karıştırın ve aktin karışımını hazırlanan F tampon çözeltisine ekleyin. Düzgün karıştırmayı sağlamak için çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyin. Aktini mikro santrifüj tüpünde oda sıcaklığında polimerleşmeye bırakın. Daha sonra, bir akış hücresi hazırlamak için, akış hücresi kanalının sınırlarını oluşturmak için mikroskop lamının genişliği boyunca birbirine paralel iki parça çift taraflı bant yerleştirin. Kapak kızağını, mikroskop lamına dik olduğundan emin olarak bant kanalının üzerine yerleştirin. İyi bir sızdırmazlık sağlamak ve hava ceplerini ortadan kaldırmak için kapak kaymasının çift taraflı bantla temas eden alanına bastırın. Bir tıraş bıçağı kullanarak, mikroskop lamındaki fazla bandı kesin ve tek görünür bant numune kanalının içinde olacak şekilde kapak kızağını kapatın. İki deplaner numunesi için bir silindir numune haznesi hazırlamak için, önce kapak fişini etanol, su ve etanol ile durulayın. Filtrelenmiş hava ile kurulayın. Cam klonlama silindirini kapak kızağına yapıştırmak için beş dakikalık ince bir epoksi tabakası uygulayın. Şeffaf veya açık renkli bir mikro santrifüj tüpüne 3,5 mikrolitre yağ yüzey aktif madde çözeltisi ekleyin. Karıştırmadan, beş mikrolitre aktin solüsyonunu yağ yüzey aktif madde tabakasının üstüne pipetleyin. Tüpü kapatın. Mikro santrifüj tüpünün üst kısmını tutun ve görünür emülsiyonlu bir başlangıç köpüğü oluşturmak için alt kenarı hafifçe vurun ve tek tip mikro emülsiyonlar oluşturana kadar hafifçe vurmaya devam edin. Akış hücresini yüklemeden önce, az miktarda beş dakikalık epoksiyi karıştırın. Bir akış hücresi yüklemek için, kanalı ıslatan küçük bir tıkaç oluşturmak için akış hücresinin numune kanalına bir ila üç mikrolitre yağ yüzey aktif madde çözeltisi pipetleyin. Numuneyi eklemeden önce, geri çekilen yağ yüzey aktif madde menisküsü nedeniyle oluşan hava boşluğunu gidermek için akış hücresini eğin. Kanalı doldurmak için numune çözeltisi emülsiyon süspansiyonunu hemen akış hücresinin girişine pipetleyin. Akış hücresi kanalının her iki tarafını beş dakikalık epoksi ile kapatın. Emülsiyon olmayan numuneler için silindir numune haznesini yüklemek için, cam silindir haznesinin dibine beş mikrolitre yağ yüzey aktif madde solüsyonu pipetleyin. Yüzeyi ve alt silindiri yüzey aktif madde çözeltisiyle kaplamak için kapak kızağını eğin ve yavaşça döndürün. Yağın tamamen buharlaşmasını önlerken ince bir tabaka elde etmek için bir pipet kullanarak fazla yağ yüzey aktif madde çözeltisini çıkarın. Örnek çözeltiyi hemen hazneye ekleyin. Buharlaşmayı ve akışı önlemek için hazneyi küçük bir parça politetrafloroetilen veya PTFE bantla örtün. Numuneyi mikroskop tablasına monte edin. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yeterince yüksek bir sayısal diyafram açıklığı sağlamak için yağa veya suya daldırılmış 20x, 40x, 60x veya 100x objektif kullanarak aktinin hızlandırılmış görüntülemesini başlatın. Bir numune odasında polimerizasyon yapılıyorsa, yaklaşık 30 dakika veya görünür filament uzaması veya hareketi olmayana kadar polimerizasyona izin verin. Numuneye bir çapraz bağlayıcı ekleyin, ardından toplam hacmin yaklaşık yarısını numuneye yavaşça pipetleyerek önceden polimerize filamentler olarak miyozin ekleyin. Son olarak, hızlandırılmış görüntülemeyi başlatın. Dolaşık aktin ağının temsili konfokal floresan görüntüsü burada gösterilmiştir. Dolaşık aktin ağı, yüzey boyunca eşit olarak dağılmıştır. Bu görüntüdeki parlak noktalar filament örtüşmelerini temsil ederken, koyu bölgeler minimum aktin varlığını gösterir. Termal dalgalanmalar, yerel yoğunluk değişikliklerine ve aktin filamentlerinin gözle görülür şekilde bükülmesine neden olur. Miyozin II ilavesi, uzun sürelerde gözle görülür miyozin punkta birikimi ile aktin ağının bükülmesine ve yeniden düzenlenmesine neden olur. Ağ kasılması, miyozin konsantrasyonuna ve ATP konsantrasyonuna bağlıdır. Çapraz bağlı aktin ağlarında, miyozinin neden olduğu kasılma, dolaşık ağlara kıyasla daha uzun uzunluk ölçeklerinde koordineli harekete yol açar.