Name: Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Öğrenin, desteklenen lipid çift katmanları üzerinde membrana bağlı aktomiyozin ağlarının dinamiklerini ileri düzey ışık mikroskobisi ile nasıl incelenir. Bu yöntem, sitoskelet proteinlerinin sıralı eklenmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma AXA araştırma fonu ve DVK için Warwick-Wellcome Kantitatif Biyotıp Programı (Wellcome ISSF, RMRCB0058), AB ve ST için NCBS-TIFR ve SM için Wellcome-DBT Margdarshi bursu (IA/M/15/1/502018) tarafından desteklenmiştir. DVK ayrıca Biyofizik Derneği'ne "Molekülerden mezo ölçeğine kadar çok bileşenli sitoiskelet ağlarını anlamadaki zorluklar" sanal ağ etkinliğini etkinleştirdiği için teşekkür eder. bu protokol koleksiyonunun oluşturulmasına katkıda bulunmuştur.

<ol><li>Köster, D. V., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+and+the+plasma+membrane%3A+Inextricably+intertwined%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined.</a> Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).</li>
<li>Rao, M., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+organization+of+membrane+constituents+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active organization of membrane constituents in living cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid+bound+actin+meshwork+organizes+liquid+phase+separation+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes.</a> eLife. 3, 01671(2014).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratification+relieves+constraints+from+steric+hindrance+in+the+generation+of+compact+actomyosin+asters+at+the+membrane+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex.</a> Science Advances. 6 (11), (2020).</li>
<li>Köster, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+dynamics+drive+local+membrane+component+organization+in+an+in+vitro+active+composite+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+MACs+%28minimal+actin+cortices%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The design of MACs (minimal actin cortices).</a> Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).</li>
<li>Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+actomyosin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile actomyosin arrays.</a> Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).</li>
<li>Mosby, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+filament+dynamics+in+actin+networks+revealed+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).</li>
<li>Seara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+production+rate+is+maximized+in+non-contractile+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin.</a> Nature Communications. 9 (1), 4948(2018).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7, 12615(2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> eLife. 2, 00116(2013).</li>
<li>Ditlev, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composition-dependent+molecular+clutch+between+T+cell+signaling+condensates+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin.</a> eLife. 8, 42695(2019).</li>
<li>Banjade, S., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+of+multivalent+proteins+can+promote+clustering+of+membrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors.</a> eLife. 3, 04123(2014).</li>
<li>Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+membrane+diffusion+modulated+by+a+minimal+actin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex.</a> Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).</li>
<li>Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+domain+organization+by+a+biomimetic+contractile+actomyosin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex.</a> eLife. 6, 24350(2017).</li>
<li>Block, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+at+lipid+membranes%3A+A+comparison+of+hydrodynamic+models+describing+and+experiments+quantifying+diffusion+within+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers.</a> Biomolecules. 8 (2), 30(2018).</li>
<li>JoVE, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Methods+Collection.+In+vitro+reconstitution+of+cytoskeleton+networks+for+biomaterials%2C+biophysics+and+active+matter+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+purification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myosin purification and characterization.</a> Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WH2+and+proline-rich+domains+of+WASP-family+proteins+collaborate+to+accelerate+actin+filament+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).</li>
<li>Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+ezrin+actin+binding+domain+to+probe+its+interaction+with+actin+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro.</a> PLoS One. 10 (4), 0123428(2015).</li>
<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+STED-FCS+reveals+spatiotemporal+heterogeneity+of+lipid+interaction+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells.</a> Nature Communications. 5, 5412(2014).</li>
<li>Selden, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+programmed+cell+adhesion+with+membrane-anchored+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).</li>
<li>Seu, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+treatment+on+diffusion+and+domain+formation+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+equation+to+extract+diffusion+coefficients+from+confocal+FRAP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data.</a> Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+computational+framework+for+D%28t%29+from+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching+data+reveals+various+anomalous+diffusion+types+in+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes.</a> Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).</li>
<li>Lorén, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+in+material+and+life+sciences%3A+Putting+theory+into+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).</li>
<li>Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+and+control+of+Supported+lipid+bilayer+formation+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy.</a> ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).</li>
<li>Lin, W. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membrane+formation%2C+characterization%2C+functionalization%2C+and+patterning+for+application+in+biological+science+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).</li>
<li>Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers%3A+An+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li>
<li>Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+supported+membranes+on+topographically+patterned+polymeric+elastomers+and+their+applications+to+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing.</a> Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236(2022).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e63332(2021).</li>
<li>Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurrell%2C+M+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2022).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu protokol, çok yönlü bir platform ve hücrelerin membran-korteks arayüzünü incelemek için deneyler tasarlamak için bir başlangıç noktası sunar. Kritik adımlar, verimli SUV oluşumu için taze lipitler kullanılarak temiz cam slaytların hazırlanması (her ikisi de SLB'lerin kalitesini etkiler) ve dinamik aktin filament reorganizasyonu için taze geri dönüştürülmüş miyozin II proteinlerinin kullanılmasıdır. Dinamiği uzun süre görüntülerken, bir oksijen temizleyici sistemi (örneğin, protokateçuik asit ve protokateçuat 3 4-dioksijenaz 5,31) dahil etmek çok önemlidir.
Açık odacıklı tasarım, lipit akışlarını indüklemeden bileşenlerin mevcut bir sisteme sıralı olarak eklenmesini sağlar. Bu, yaygın olarak kullanılan, kapalı odacıklı yaklaşımlara göre önemli bir avantaj olabilir veya lipozomlar içinde kapsüllenmiş proteinler kullanılarak çalışabilir36. Protein kaynaklı membran deformasyonu gibi zıt etkiler, cam adsorbe edilmiş lipid çift katmanları ile incelenemez.
Lipid çift katmanları, çok çeşitli lipit bileşimleri ile oluşturulabilir. Lipid veziküllerinin hidrofilik cam yüzeye adsorpsiyonu ile başlar, ardından yüzey-vezikül ve doğrudan vezikül-vezikül etkileşimleri nedeniyle kendiliğinden vezikül rüptürü veya adsorbe edilmiş veziküllerin kritik bir kapsama alanına ulaşması ile başlar, bundan sonra veziküllerin küçük bir kısmı yırtılır, aktif kenarlar oluşturur ve bu da sonunda çift katmanlı formasyona yol açar32 . Camın yanı sıra, Mika (örneğin, atomik kuvvet mikroskobu için), yumuşak substratlar (örneğin, poli-di-metil-siloksan), polimer yastıklar33,34,35, elektron mikroskobu ızgaralarının delikleri arasında uzanan desteklenen lipit çift katmanları oluşturmak için çeşitli substratlar kullanılabilir 14. Damlacık arayüzü çift katmanları, kararlı, bağımsız lipit çift katmanlı36 oluşturmak için başka bir ilginç yöntemdir. Akto-miyozin ağlarının veziküllere veya emülsiyonlara dahil edilmesi, bu minimal sistemi hücre benzeri bir geometride incelemek için çok güçlü bir yöntemdir 37,38 ve başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır39.

Canlı bir hayvan hücresinin plazma zarı, bitişik aktin sitoiskeleti ile sürekli etkileşime girer ve birlikte çok sayıda hücresel işlevi yerine getiren aktif bir kompozit materyal oluştururlar 1,2. Bu lipid membran-aktin arayüzündeki süreçleri incelemek için, desteklenen lipit çift katmanlarının (SLB'ler) üstünde sitoiskelet ağlarının yeniden yapılandırılmasının çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu minimal sistem yaklaşımı, sitoiskelet ağ bileşenlerinin ve lipit kompozisyonunun hassas kontrolünü sağlar. Dev unilamellar veziküllerin bağımsız lipit membranlarıyla karşılaştırıldığında, SLB'lerin düzlemsel geometrisi, süper çözünürlüklü3,4, toplam iç yansıma floresansı (TIRF)5,6,7 veya interferometrik saçılma 8 gibi son teknolojimikroskopi tekniklerinin verimli bir şekilde kullanılmasına izin verir sitoiskelet ağlarının mekansal organizasyonunu ve dinamiklerini incelemek. TIRF, floresan etiketli bileşenler için en yüksek kontrastı sağlar, çünkü çözeltideki arka plan sinyaline katkıda bulunan bağlanmamış etiketli moleküllerin sinyali minimumdur.
Burada, aktif, yarı-2D ağların fiziğini incelemek için alanda yaygın olarak kullanılan desteklenen lipit çift katmanlarına bağlı aktomiyozin ağlarının oluşumu için temel bir protokolü tarif ediyoruz 9,10,11 ve membran organizasyonu üzerindeki etkileri 3,5,12,13,14,15,16 (Şekil 1 ). Bu yaklaşım aktin bazlı ağlarla sınırlı değildir, aynı zamanda mikrotübülleri, ara filamentleri veya karışık doğadaki kompozit ağları keşfetmek ve yüzeye duyarlı mikroskopi yöntemlerini kullanarak lipit membran proteinleri ve sitoiskelet bileşenleri arasındaki çeşitli etkileşimleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.
Bu protokolün odaklanmasını sağlamak için, aktin ve miyozin proteinlerinin saflaştırılması ve etiketlenmesinin ayrıntılı bir tanımını veya aktomiyozin ağlarının kontraktilitesinin ve organizasyonunun nasıl ayarlanacağı ve kontrol edileceği ile ilgili ayrıntıları hariç tuttuk. JoVE Methods Collection, In Vitro Reconstitution of Cytoskeleton Networks for Biomaterials, Biophysics and Active Matter Research17'de bunun yanında yayınlanan diğer protokollere de başvurulmalıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig01.jpg"> Resim 1: İn vitro aktin-membran aktif kompozit sistemin şeması. Biorender ile oluşturuldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>1,2 dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N- (lissamin rodamin B sülfonil)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>810158</td><td>16:0 RhoPE</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3- [(N-(5-amino-1 karboksipentil) iminodiasetik asit) süksinil] (nikel tuzu)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>790404</td><td>DGS-NTA-Ni2+</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin</td><td>Avanti Polar Lipidleri</td><td>850375</td><td>DOPC</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfokolin</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850355</td><td>DPPC</td></tr><tr><td>Amber cam şişeler</td><td>ThermoFisher</td><td>B7990-2A</td><td></td></tr><tr><td>ATP disodyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor hücre odası</td><td>ThermoFisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Banyo sonikatörü</td><td>GT Sonic</td><td>1860QTS</td><td></td></tr><tr><td>beta-kazein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>12135</td><td></td></tr><tr><td>kloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td>alternatif olarak Elektron Mikroskobu Bilimleri, 50980296</td></tr><tr><td>Kapak kaymaları, #1, 25 mm çap, Altın Mühür</td><td>Harvard Aparatı</td><td>64-0705B</td><td></td></tr><tr><td>Kapak fişleri, #1, 40x22 mm, Altın Mühür</td><td>ThermoFisher</td><td>48404-031</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>G12635</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Himedia</td><td>MB130</td><td></td></tr><tr><td>Gaz geçirmez cam şırıngalar, removebla iğneli, künt, hacim 10 ve mikro; L, 100 ve mikro; L, 500 ve mikro; L</td><td>Hammilton</td><td>1700 serisi</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma Analytics</td><td>Z805939</td><td>temizleme solüsyonu</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Himedia</td><td>RM380</td><td></td></tr><tr><td>KaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G13405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ThermoFisher</td><td>G13305</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G26708</td><td></td></tr><tr><td>Lipid ekstruder</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>61000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>G15535</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotip sonikatör</td><td>Sonics</td><td>VC750</td><td>3 mm Uç çapı</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>ThermoFisher</td><td>G15955</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Himedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G15825</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G27815</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti Eclipse TIRF mikroskobu</td><td>Nikon</td><td></td><td>Polarizasyonu koruyan bir optik fiber aracılığıyla Agilent monolitik lazer birleştirici MLC400'e bağlanan bir TIRF ünitesi ile 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective ile iki adet 512 x 512 piksel EMCCD kamera ile (Photometrics Evolve 512) 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objektif ile iki adet 512 x 512 piksel EMCCD kamera ile (Photometrics Evolve 512)</td></tr><tr><td>NOA88</td><td>Norland Products</td><td>8801</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Kaplı Cımbız Stil #2A</td><td>Yapı Probu</td><td>0S2AT-XD</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>ThermoFisher</td><td>G15925</td><td></td></tr><tr><td>UV aydınlatıcı</td><td>Novascan</td><td>PSD PRO-UV,</td><td>vakum ve O2 kaynağına ihtiyaç duyar</td></tr></tbody></table>

membrana bağlı minimal aktin kortekslerinin desteklenen lipid Çift katmanlı Üzerinde yeniden sulandırılması

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

Canlı bir hücrenin yüzeyi, plazma zarının altta yatan aktin korteks ile etkileşiminden kaynaklanan çok sayıda hücresel süreç için çok yönlü bir aktif platform sağlar. Son yıllarda, aktin filament ağları ile kombinasyon halinde desteklenen lipit çift katmanlarına dayanan yeniden yapılandırılmış, minimal sistemlerin, membrana bağlı aktin ağlarının temel mekanizmalarını ve sonuçlarını çözmede ve ayrıca bireysel membranla ilişkili proteinlerin işlevlerini incelemede çok etkili olduğu kanıtlanmıştır. Burada, membranla ilişkili aktin bağlayıcı proteinler aracılığıyla dinamik aktin filamentlerine ve miyozin motorlarına bağlanan sıvı destekli lipit çift katmanlarından oluşan ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu ile kolayca gözlemlenebilen bu tür aktif kompozit sistemlerin in vitro olarak nasıl yeniden oluşturulacağını açıklıyoruz. Açık odacıklı bir tasarım, sistemin adım adım monte edilmesini ve bağlayıcı protein konsantrasyonu, aktin konsantrasyonu, aktin filament uzunluğu, aktin / miyozin oranı ve ATP seviyeleri gibi birçok parametrenin sistematik olarak kontrol edilmesini sağlar. Son olarak, sistemin kalitesinin nasıl kontrol edileceğini, yaygın olarak ortaya çıkan sorunların nasıl tespit edileceğini ve giderileceğini ve bu sistemin canlı hücre yüzeyine kıyasla bazı sınırlamalarını tartışıyoruz.

Temsil için, burada fotobeyazlatmadan sonraki 1. görüntüden tipik bir postağartıcı profili (Şekil 3A'da t = 0 s'deki görüntü) ve aşağıdaki işlev28'e (bkz. Şekil 6A) uyumu gösterilmiştir:
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq04.jpg" style="margin: auto;">
Bu eğriye uyum ile hesaplanan r e (23.94 μm) değeri, adım 2.8.4'te hesaplanan re'ye çok benzer. (23.24 μm). Burada K, F0'dan doğrudan tahmin edilebilen bir ağartıcı derinliği parametresidir (adım 2.8.4'te açıklanmıştır). Benzer şekilde, Şekil 6B, kurtarma profilini ve aşağıdaki işlev28'e uyumunu gösterir:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq05.jpg" style="margin: auto;">
Difüzyon katsayısının takılı değerini 1.34 μm 2 / s olarak buluyoruz, bu da adım 2.8.4'teki formülle hesaplanan 1.39 μm2 / s değeriyle yakından aynı fikirde olan bir değer. Burada, MF, geri kazanılan ağartılmış popülasyonun fraksiyonunu temsil eden lipit çift katmanının hareketli fraksiyonunu temsil eder. Lipide bağlı moleküllerin hareketliliği, elbette, lipit bileşimine ve fiziksel durumuna (sıvı veya jel fazı) bağlıdır. DOPC bazlı lipit membranları kullanan deneylerimiz için, hareketlilik &gt;1 μm2 / s olmalı ve iyi bir lipit çift katmanını belirtmek için mobil fraksiyon 0.9'dan az olmamalıdır. Çift katmanın kalitesini ve hareketliliğini hızlı bir şekilde test etmek için manuel bağlantı gerektirmeyen yöntemin kullanılmasını öneririz. Montaj yöntemi, birçok FRAP eğrisi için analizi otomatikleştirirken yararlı olabilir. Ayrıca, sistemdeki difüzyonu sistematik olarak karakterize etmek için daha sofistike bir FRAP deneyi yapmak istiyorsak, okuyucuyu deneysel tasarımdaki modellerin ve potansiyel tuzakların takılması hakkında daha fazla ayrıntı için Lorén ve ark.30'dan bu incelemeye tavsiye ederiz.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig06.jpg"> Şekil 6: Lipid çift katmanlarının difüzyon katsayısının ölçülmesi. (A) Fotobeyazlatmadan sonraki ilk görüntünün çizgi profili ( Şekil 3A'da t = 0 s) ve etkili ağartıcı yarıçapını hesaplamak için denklem 4'e uyumu. (B) Ağartılmış bölgenin geri kazanım profili ve difüzyon katsayısını ve hareketli fraksiyonu hesaplamak için denklem 5'e uyumu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
TIRF mikroskobu ile görüntülenen desteklenen bir lipit çift katmanlı üzerine bağlı bir akto-miyozin ağının dinamik montajını ve organizasyonunu gösteren yukarıda açıklanan deneylerin tipik bir sonucu Şekil 7 ve Ek Video S1'de gösterilmiştir.
Şekil 7 , bağlayıcı protein, F-aktin ve miyosin-II'nin görüntü montajını göstermektedir.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig07.jpg"> Şekil 7: Kontraktil aktomiyozin akışları, membran-aktin bağlayıcı protein HYE'nin lokal kümelenmesini sağlar. HYE ve F-aktin içeren bir SLB'ye miyozin II eklenmesi üzerine HYE (YFP etiketli), aktin filamentlerinin (Atto-635 maleimid ile etiketlenmiş) ve miyozin II filamentlerinin (Atto-565 maleimid ile etiketlenmiş) TIRF anlık görüntüleri. Süre üstte belirtilmiştir: TIRF alanında floresan miyofilamentlerin ortaya çıkmaya başlamasından hemen önce 0 dakikadır. HYE ve F-aktin, miyozin ilavesinden önce (0 dakika) lipid çift katmanı üzerine homojen olarak dağıtılır. Myosin aktivitesi, kararlı durumda (15 dakika) aster benzeri yapılara ortaya çıkan ve bağlı membran bileşeninin (HYE) yerel kümelenmesini sağlayan kontraktil aktomiyozin akışlarını indükler. En düşük sıra, aktin (sarı) ve miyozin II (macenta) görüntülerinin farklı zaman noktalarında aktin ve miyozin organizasyonunu gösteren bir birleşimidir. Bu montajların yapımında kullanılan görüntüler Fiji'de arka plan sinyali, düzgün olmayan yoğunluk kalıpları ve translasyonel hareket için düzeltildi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Ayrıntılar için Ek Video S1 başlıklı makaleye bakın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig07large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Arabellek Adı</td>
			<td colspan="2">Kompozisyon</td>
		</tr><tr><td>Lipid Rehidrasyon tamponu</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, %5 sakaroz, pH 7,5</td>
		</tr><tr><td>SLB Oluşum tamponu</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6</td>
		</tr><tr><td>SLB Depolama tamponu</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Protein Seyreltme tamponu</td>
			<td colspan="2">20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1mM TCEP veya DTT, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>1X ME veya Aktin iyon değişim tamponu</td>
			<td colspan="2">50 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2 (4°C'de depolayın)</td>
		</tr><tr><td>1X KMEH veya Aktin polimerizasyon tamponu</td>
			<td colspan="2">50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>100 mM ATP stok</td>
			<td colspan="2">100 mM ATP disodyum tuzu, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, pH 7.5 (-20°C'de saklayın)</td>
		</tr><tr><td>2x Hedef arabellek</td>
			<td colspan="2">2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2mM ATP, 5mM TCEP (4°C'de depolanır)</td>
		</tr><tr><td>G-tamponu</td>
			<td colspan="2">2 mM Tris, 0,1 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, %0,04 NaN3, pH 8 (4°C'de saklayın)</td>
		</tr><tr><td>Myosin II tampon</td>
			<td colspan="2">500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Ağırlık, pH 7,0</td>
		</tr><tr><td>Jel filtrasyon kromatografisi tamponu</td>
			<td colspan="2">50 mM Tris-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, %0,1 Ara-20, pH 7,5</td>
		</tr><tr><td>Protein depolama tamponunun kapatılması</td>
			<td colspan="2">10 mM Tris· Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7.5, gliserol</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tampon bileşimlerinin listesi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Sık karşılaşılan sorunlar ve bunların sorun giderme</td>
			<td>Sorun</td>
			<td colspan="4">Neden</td>
			<td colspan="4">Olası çözümler</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>Lipid çift katmanlı difüzyon göstermez</td>
			<td colspan="4">Bu sorunun en olası nedeni, temizleme çözeltisi yaşlandığında veya banyo sonikasyonu sırasında ısıtma gerçekleşmediğinde meydana gelebilecek kirli kapak camıdır. Bu çift katmanlar 'veziküler' bir görünüme sahiptir, çünkü patlamış veziküller kapak camına yapışır, ancak birbirleriyle kaynaşmaz. 6 haftadan eski MLV'leri veya 6 günden eski SUV'ları kullanmak veya düşük miktarda SUV eklemek de veziküler çift katmanlı oluşumuna yol açabilir.</td>
			<td colspan="4">Taze temizleme solüsyonu kullanın. Isıtıcının açık olduğundan ve sıcaklığın 45-65 ° C arasında olduğundan emin olun. Taze lipit karışımları kullanın. (Bir floresan protein probuna karşı bir floresan lipit probu kullanmak bazen farklı şekilde ortaya çıkabilir. örneğin, çift katmanın alt kırınım kusurları varsa ve yüzey pasivasyon adımı atlanırsa (veya çalışmazsa), lipit probu eşit bir yoğunluk dağılımı gösterecektir, ancak floresan protein probu parlak floresan lekeleri gösterebilir. )</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>Lipid çift katmanlı parlak yamalara sahiptir</td>
			<td colspan="4">SUV'ların çift katmanlı oluşum için uzun süre inkübasyonu, genel olarak dağınık ancak ara sıra parlak yamalarla bir lipit çift katmanı oluşturabilir. Bu yamalar, büyük miktarlarda floresan probu çekebilen çok katmanlı çift katmanlı olabilir.</td>
			<td colspan="4">SUV'larla 15-20 dakikalık kuluçka yeterlidir. Probun toplanmadığından emin olun: bağlayıcı proteinin hızlı bir sert dönüşü (4 ° C'de 15 dakika boyunca 300 x g) agregaları çıkarabilir</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>Lipid çift katmanının karanlık delikleri vardır</td>
			<td colspan="4">Bu, çift katmanlı eski SUV'lardan yapıldığında ve uzun saatler boyunca (&gt; 4 saat sonra) görüntülendiğinde veya çözeltinin pH'ı uzun süreli görüntüleme nedeniyle (örneğin, yüksek ATP durumunda ve belirli oksijen temizleyicilerinin varlığında) veya yüzey beta-Kazein ile aşırı pasifleştirildiğinde (10-15 dakikadan fazla bir süre için çok fazla beta-Kazein eklendiğinde veya yıkanmadığında) meydana gelir.</td>
			<td colspan="4">Taze lipitler kullanın. Görüntüleme kare hızını veya etkili lazer aydınlatma süresini azaltın. Daha yüksek arabelleğe alma kapasitesine sahip arabellekler kullanın.</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>Lipid çift katmanı yavaş difüzyon gösterir</td>
			<td colspan="4">Yüksek kolesterol yüzdesine sahip lipit çift katmanları, uzun doymuş lipitler veya yüklü lipitler daha yavaş yayılır.</td>
			<td colspan="4">Bu gibi durumlarda, numunenizi yüksek bir sıcaklıkta hazırlayın. Basit, test edilmiş bir lipit bileşimi, karmaşık ve test edilmemiş lipit bileşimleri ile birlikte bir kontrol olarak da kullanılabilir. Camın temiz olduğundan emin olun.</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Aktin polimerize olmaz</td>
			<td colspan="4">Hedef tampon eski, G-aktin stoğu çok eski, eski ve yeni G-aktin kopolimerize edildi.</td>
			<td colspan="4">Polimerizasyondan önce Ca 2+'nın Mg2+ ile değiştirildiğinden emin olun (ME tamponu kullanarak). Taze ATP-Mg2+ stoğu kullanın. Yeni geri dönüştürülmüş G-aktin kullanın. Çift katmana eklenen F-aktin konsantrasyonunun (G-aktin açısından) 0.2 μM'den yüksek olduğundan emin olun. Daha düşük konsantrasyonlar için, falloidin stabilize F-aktin kullanın.</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>Aktin, çift katmana bağlanmaz</td>
			<td colspan="4">Membran-aktin bağlayıcı çok düşük konsantrasyonda eklenmez veya eklenmez – bu, bağlayıcı proteinin floresansından çıkarılabilir. Floresan iyi ise, membran-aktin bağlayıcı aktin bağlama kapasitesini kaybetmiştir. Ayrıca, bağlayıcı protein cam yüzeye spesifik olarak bağlı değilse (çift katman kötü olduğunda), aktin filamentlerini işe almayabilir.</td>
			<td colspan="4">Çift katmanın yayıldığından emin olun. Taze bağlayıcı protein kullanın</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>Floresan F-aktin sinyali zayıf</td>
			<td colspan="4">Etiketli koyu aktin'e oranı çok düşüktür. Etiketli aktin veya etiketsiz aktin çok eskidir ve birbirleriyle kopolimerize olmazlar.</td>
			<td colspan="4">Aktin'i tekrar geri dönüştürün ve yeni geri dönüştürülmüş aktin ile ploymerizasyonu yeniden deneyin. Fotohasar, F-aktin'i yok edebilir veya depolimerize edebilir; mümkünse, aktin (ve miyosin) için kırmızı veya uzak kırmızı boyalar kullanın.</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>Myosin kontraktiliteyi göstermez</td>
			<td colspan="4">miyozin infüzyonlu sisteme ATP eklendikten sonra, akto-miyozinin kontraktilitesinin olmadığı gözlenebilir.</td>
			<td colspan="4">Miyozin konsantrasyonunun veya saflık seviyesinin iyi olup olmadığını kontrol edin. Taze geri dönüştürülmüş miyozin kullanın (geri dönüşümden sonraki 6 hafta içinde kullanın). Miyozin karışımına taze ATP eklemek yardımcı olabilir. Gazdan arındırıcı tamponlar ve oksijen temizleyicileri vb. Kullanmak. motorların fotohasarını azaltabilir.  Daha fazla bilgi, Plastino ve ark. veya Stam ve ark. tarafından aynı yöntem koleksiyonunun protokollerinde bulunabilir.</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>Kapak camı hidrofilik değildir</td>
			<td colspan="4">Kapak camı düzgün temizlenmemiş.</td>
			<td colspan="4">Temiz hidrofilik kapak camı, lipit çift katmanlı oluşum için çok önemlidir. Temizleme protokolünden sonra kapak camının hidrofilikliğinin yararlı, görsel bir okuması, camın suyla ıslanmasını gözlemlemektir. Düz yatan bir örtüye az miktarda su ekleyin. Kapak kayması düzgün bir şekilde temizlenmezse su yuvarlak bir damlacık şeklinde kalacaktır. Bununla birlikte, aynı miktarda su yayılacak ve işlenmiş bir hidrofilik kapak camı üzerinde ince bir tabaka oluşturacaktır. Suyun kapak camı yüzeyindeki bu ıslanma davranışı, temizleme çözeltisi / NaOH ile temizleme adımlarının işe yarayıp yaramadığını belirlemek için kullanılabilir.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Sık karşılaşılan sorunları ve ilgili çözümleri özetleyen sorun giderme kılavuzu. 
Ek Video S1: Kasılma aktomiyozin akışları, membran-aktin bağlayıcı protein HYE'nin yerel kümelenmesini sağlar. HYE ve F-aktin içeren bir SLB'ye miyozin II'nin eklenmesi üzerine HYE (YFP etiketli), aktin filamentlerinin (Atto-635 maleimid ile etiketlenmiş) ve miyozin II filamentlerinin (Atto-565 maleimid ile etiketlenmiş) TIRF zaman aşımı. Süre üstte belirtilmiştir: TIRF alanında floresan miyofilamentlerin ortaya çıkmaya başlamasından hemen önce 0 dakikadır. Ölçek çubuğu = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/S1Movie_Act_myo_Hye_merge_timestamp_15fps.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Burada, membrana bağlı aktomiyozin ağlarını bir araya getirmek ve gelişmiş ışık mikroskobik teknikleri kullanarak dinamikleri incelemek için nispeten basit ve anlaşılır bir prosedür gösteriyoruz. En önemli avantajı, tahlilimizin, membrana bağlı ağları bozmadan proteinlerin ve küçük moleküllerin sıralı olarak eklenmesine izin vermesidir. Bu yöntem, diğer sitoiskelet proteinlerini veya kompozit ağları incelemek için kolayca uyarlanabilir.Protokolün en kritik kısmı, desteklenen lipit çift katmanının doğru bir şekilde oluşmasını sağlamaktır, bu nedenle ilk olarak, sitoiskelet proteinlerini eklemeye başlamadan önce bu adımda ustalaşmamız gerekiyordu. Başlamak için, üç ila beş dikdörtgen cam kapak kapağı alın ve bunları bir coplin kavanozunun içine yerleştirin. Banyo sonicator'u açın ve sıcaklığı 65 santigrat dereceye ayarlayın.Kapak kapaklarını tamamen suya batırmak için coplin kavanozu% 2 temizleme çözeltisi ile doldurun ve tam darbe modunda 30 dakika boyunca sonikatöre yerleştirin. Kapak kapaklarını tek tek çıkarmak için künt PTFE kaplı forseps kullanın. Damıtılmış suyla iyice durulayın ve iki normal sodyum hidroksit ile doldurulmuş başka bir coplin kavanozuna yerleştirin.Tam darbe modunda kapakları 20 dakika boyunca sonikleştirin. Kapak kapaklarını çıkarın, damıtılmış suyla iyice durulayın ve damıtılmış suyla doldurulmuş başka bir coplin kavanozuna yerleştirin. Deneye başlamadan önce, kavanozu azot gazı beslemesi ile donatılmış kimyasal bir davlumbaza alın.Eldiven ve forseps kullanarak nitrojen akımı altında kurutmak üzere kapak kapaklarını çıkarın. Her iki tarafı da kurutun ve kapaklı temiz bir plastik ızgaraya yerleştirin. Toz parçacıklarıyla teması önlemek için kapak kapaklı kutuyu bir kurutucuya yerleştirin, ardından otoklavlanmış PCR tüplerini alın ve kapaklarını ve alt konik yarılarını keskin bir cerrahi bıçakla kesin.Silindirik yarım kesilmiş tüpleri alın, her bir kesilmiş tüpün pürüzsüz kenarına UV kürlenebilir yapıştırıcı uygulayın ve yeni temizlenmiş bir kapak kapağı üzerine ters çevrilmiş olarak yerleştirin, böylece jant kapak kayması üzerine düz oturur. Tutkalın odanın merkezi boşluğuna dökülmemesini sağlamak için silindiri kapak kapağına yerleştirildikten sonra yanal olarak hareket ettirmeyin. Oda yatak kapaklarını oksijen beslemeli ve vakumlu bir UV ozon temizleyicinin içine yerleştirin.UV ışığını açın ve yapıştırıcının polimerleşmesine izin vermek için üç ila beş dakika aydınlatın. Kapak fişlerini çıkarın ve odaları sızıntı açısından test edin ve sızdıran odaları atın. Her odayı SLB oluşum tamponu ile yıkayın ve sonunda 100 mikrolitre tampon bırakın.Tamponun seviyesini kalıcı bir işaretleyici ile 100 mikrolitrede işaretleyin, ardından odaya iki mikrolitre 0.1 molar kalsiyum klorür ekleyin, ardından her odaya sekiz mikrolitre SUV çözeltisi ekleyin ve 25 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. SLB oluşum tamponunun 50 mikrolitresini çıkarın, numune haznesinde sadece 50 mikrolitre bırakın, ardından odaya 100 mikrolitre bir XKMEH ekleyin ve yavaşça karıştırın. Tamponun 100 mikrolitresini tabana dokunmadan çıkarın.Bir XKMEH'in 100 mikrolitresini ekleyerek ve 100 mikrolitreyi çıkararak yıkamaları sekiz ila 10 kez tekrarlayın. İki katmana mililitre beta-kazein başına 10 mikrolitre bir miligram ekleyin, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika kuluçkaya yatırın. Beta-kazeini bir XKMEH ile üç kez yıkayın ve tampon seviyesini 100 mikrolitre işaretine geri getirin.Beta-kazein inkübasyonu sırasında, eksi 80 santigrat derece için 37 santigrat derecede hızla çözülmüş bir membran-aktin bağlayıcı protein aliquot alın ve daha sonra buz üzerinde tutun. Aliquot'u protein seyreltme tamponu ile bir mikromolar konsantrasyonuna seyreltin. Bağlayıcı proteini tanımlanmış bir son konsantrasyonda çözeltiye ekleyin ve yavaşça karıştırın.Oda sıcaklığında 30 ila 40 dakika inkübe edin ve bağlanmamış HSE proteinini çıkarmak için bir XKMEH tamponu ile üç ila beş kez yıkayın. Her odadaki tampon seviyesini 100 mikrolitre işaretine geri getirin. Örnek artık görüntüleme için hazırdır.Mikroskopu, uyarma lazerlerini ve algılama kameralarını açın. Lazerin hizalandığından, hedefin temizlendiğinden ve yazılımın görüntü almaya hazır olduğundan emin olun. Yağı 100 kez hedefe koyun, numuneyi mikroskop aşamasına monte edin ve hedefi çift katmana odaklayın.Lazer pozisyonunun, numune üzerinde toplam iç yansımaya maruz kalacak şekilde olduğundan emin olun. 488 nanometre uyarım kullanın. İki katmanın bütünlüğünü belirlemek için, çift katmanlı üzerinde bir ilgi alanı seçerek ve beş ila bir veya daha yüksek bir sinyal-gürültü oranı sağlayan görüntüleme koşullarını kullanarak görüş alanının birkaç görüntüsünü kaydederek hızlı bir FRAP testi gerçekleştirin.Kaydı duraklatın ve floroforları yerel olarak ağartmak için çift katmanın küçük bir dairesel bölgesine konsantre bir lazer ışını odaklamak için TIRF mikroskobunun alan diyaframını kapatın. Küçük bölgeyi üç ila 10 saniye boyunca fotobeyazlatmak için lazeri maksimum çıkışına kadar açın ve ardından lazeri kapatın. Alan diyaframını orijinal yarıçapına yeniden açın, görüntüleme durumunu tekrar ağartıcı öncesi ayarlara yeniden ayarlayın ve floresan sinyalin geri kazanımını görüş alanına kaydetmeye hemen devam edin.Çift katmanın akıcı olup olmadığını kontrol edin ve görüntüleri 16 bit nokta TIF dosyaları olarak kaydedin. Etiketlenmemiş ve floresan olarak etiketlenmiş G-aktin'i 10 ila bir molar oranında karıştırın ve G-aktin konsantrasyonunun 20 mikromolar olması için G-tamponu ile doldurun. Bir kerelik bir çözelti için karışıma 10 kat ME tamponunun onda birini ekleyin ve oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin.Daha sonra, kapak proteini stoğunun şişesini 37 santigrat derecede hızlı bir şekilde çözün ve ardından buz üzerinde tutun. G-tamponları ile seyreltin, böylece kapak proteininin konsantrasyonu şimdi istenen nihai konsantrasyonun iki katı olacaktır, daha sonra seyreltilmiş kapak proteini çözeltisinin eşit bir hacmini aktin karışımına ekleyin. Son olarak, reaksiyon karışımına eşit miktarda taze iki kat hedef tampon ekleyin.Çözeltinin son hacmi, aktin karışımının hacminin dört katı olmalıdır. Bileşenlerin son konsantrasyonunun metin makalesinde açıklandığı gibi olduğundan emin olun. Polimerizasyona izin vermek için örnekleri karanlıkta 25 santigrat derecede 45 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.Künt uçlu pipet ucu ile beş mikromolar polimerize aktini nazikçe pipetleyin ve temiz bir otoklavlanmış PCR tüpüne ekleyin. Son hacmi 20 mikrolitreden fazla yapmak için tüpe bir XKMEH ekleyin ve F-aktin'in kesilmesini önlemek için hafifçe karıştırın. Monte edilmiş numune odasından, tamponun eşit hacmini çıkarın.Polimerize aktin çözeltisini odaya ekleyin ve alttaki çift katmana dokunmadan yavaşça yukarı ve aşağı üç kez pipet çekin. Numuneyi TIRF mikroskobuna monte edin ve 20 ila 30 dakika dinlendirin. F-actin ilavesi sabit bir duruma ulaştıktan sonra farklı görüş alanlarından birkaç görüntü kaydedin.30 dakikalık aktin inkübasyonundan sonra, numuneyi tekrar mikroskopa monte edin. Bağlayıcı protein ve F-aktin kanallarındaki sinyali kontrol edin. Gerekirse görüntüleme koşullarını ayarlayın.Uzun bir hızlandırılmış kayıt için iyi bir bölge seçin. Miyozin ilavesinden önce 0,1 ila 0,2 hertz'de 10 ila 15 kare kaydedin ve kaydı duraklatın. Künt uçlu pipet ucu ile stok şişesinden gerekli miktarda geri dönüştürülmüş kas miyozin ikisini pipetle çıkarın ve temiz bir otoklavlanmış PCR tüpüne ekleyin.Hacmi 20 mikrolitreden fazla yapmak için hemen tüpe bir XKMEH ekleyin ve yavaşça karıştırın. KMEH tamponunun eşit hacmini monte edilmiş numune odasından rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın ve miyozin çözeltisini numune odasına yavaşça ekleyin. Yüzeye bağlı filamentleri rahatsız edeceğinden yukarı ve aşağı pipet yapmayın.Hızlandırılmış kaydı hemen sürdürün ve tüm görüntüleri kaydedin, ardından yalnızca arabellek örneği kullanarak tüm kanallar için arka plan görüntüleri alın. Tüm görüntüleri TIF dosyaları olarak kaydedin. Difüzyon katsayısının takılı değeri saniyede 1.34 kare mikrometre idi ve bu da saniyede 1.39 metrekarelik formüle dayalı hesaplanan değerle yakından uyuşuyordu.Fotobeyazlatma sonrası çizgi profili ve ağartılmış bölgenin geri kazanım profili sırasıyla dört ve beş denklemlerine uyar. Geri kazanılan ağartılmış popülasyonun fraksiyonunu temsil eden lipit çift katmanının hareketli fraksiyonu 0.9'dan büyüktü ve bu da iyi bir lipit çift katmanını gösteriyordu. Myosin aktivitesi, kararlı durumda astro benzeri yapılara ortaya çıkan ve bağlı membran bileşeninin yerel kümelenmesini sağlayan kontraktil aktomiyozin akışlarını indükledi.Herhangi bir fotoğraf hasarına neden olmadan etiketsiz aktomiyozin ağlarının dinamiklerini incelemek için interferometrik saçılma mikroskobu gibi çeşitli mikroskopi teknikleri kullanılabilir veya süper çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanılabilir. Bu teknik, membran protein komplekslerinin mimarilerini ve kompozisyonlarını modüle etmek için dinamik bir aktomiyozin ağı ile nasıl etkileşime girdiğini anlamak isteyen araştırmacıların yolunu açmaktadır.

reconstitution-membrane-tethered-minimal-actin-cortices-on-supported

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Desteklenen lipid çift katmanlarının hazırlanması ve atomik kuvvet mikroskobu ve kuvvet spektroskopisi kullanılarak karakterizasyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Burada, tek bir molekül duyarlılık ve ~ 15 msn zaman çözünürlüğü ile polarize TIRFM kullanılarak lipozomlar ve mikroakışkan kanallarda desteklenen iki katmanlı arasındaki tek tuzak aracılı füzyon olayları tespit etmek için bir protokol mevcut. Lipid ve çözünür kargo sürümü aynı anda tespit edilebilir. Lipozom boyutu, lipit yayınım ve füzyon gözenek özellikleri ölçülmüştür.

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Biz bir protokol vitro için zihin ve benim kendi kendine organizasyon deneyleri desteklenen lipid bilayer açık bir odasında üzerinde sağlar. Ayrıca, biz tepki doğumdan tarafından vivo koşulları taklit için PDMS microcompartments lipid kaplı tahlil içine alın anlatan.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Mitokondriyal füzyon mitokondriyal dinamiğin altında yatan önemli bir homeostatik reaksiyondur. Burada açıklanan bir in vitro reconstitution sistemi membran tethering çözebilir mitokondriyal iç membran füzyon çalışması, yerleştirme, hemifüzyon, ve gözenek açılması. Hücre zarı sistemlerinin araştırılmasında bu yaklaşımın çok yönlülüğü tartışılmıştır.

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Bu makalede, kapsüllenmiş sitoiskelet proteinleri ile dev unilamellar veziküllerin hızlı üretimi için basit bir yöntem tanıtılmaktadır. Yöntemin, hapsetmede ve sitoiskelet-membran etkileşimlerinde sitoiskelet yapılarının aşağıdan yukarıya doğru resulaştırılmasında yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

Yeniden Yapılandırılmış Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Hızlı Kapsüllenmesi

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Bu protokol, in vitro toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi testi kullanarak dinamik aktin ve mikrotübülleri görselleştirmek için bir kılavuzdur.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Hücresiz resusyon, sitoiskelet düzeneğini anlamak için önemli bir araç olmuştur ve son on yıldaki çalışmalar, septin dinamiklerini minimal sistemlerde incelemek için yaklaşımlar oluşturmuştur. Burada septin montajını farklı membran bağlamlarında gözlemlemek için üç tamamlayıcı yöntem sunulmaktadır: düzlemsel çift katmanlılar, küresel destekler ve çubuk destekleri.

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Burada, saflaştırılmış proteinlerden yarı iki boyutlu (2D) dolaşık, çapraz bağlı ve sıvı kristal aktin düzeneklerinin hazırlanması için yöntemler sunuyoruz.

Aktif Aktin Bazlı Montajların Kasılma ve Deformasyon Modlarının In Vitro Olarak Ayarlanması: İki Boyutlu Aktif Ağlardan Sıvı Kristal Damlalara

Öğrenin, desteklenen lipid çift katmanları üzerinde membrana bağlı aktomiyozin ağlarının dinamiklerini ileri düzey ışık mikroskobisi ile nasıl incelenir. Bu yöntem, sitoskelet proteinlerinin sıralı eklenmesine olanak tanır.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Daha fazla video keşfet