Düşük Tutarlı Holotomografi ile Bağırsak Organoidlerinin Etiketsiz, Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme ve Makine Öğrenmesi Analizi

Canlı organoidlerin gelişim sırasında ve ilaçlara yanıt olarak meydana gelen biyofiziksel değişiklikleri izlerken gerçek zamanlı, etiketsiz görüntüleme yöntemleri oluşturmayı hedefliyoruz. Bu protokol, biyomedikal araştırmalar için yapay zeka odaklı mutasyon ve kantitatif doku seçimi ile desteklenen canlı organoidlerde görüntüleme ölçeğinin ve invazif olmayan ilaç testlerinin kolaylaştırılmış ölçeğini kolaylaştırır. Hastalık modelleme ve hassas tıpta yüksek çözünürlüklü, invaziv olmayan organoid çalışmaları için etiketsiz 3D görüntülemeyi ve bir yıllık analizi daha da entegre etmeyi planlıyoruz.

Başlamak için, hücre dışı matrisi içeren 48 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğundan harcanan ortamı aspire edin. Her oyuğa 200 mikrolitre hücre geri kazanım solüsyonu ekleyin ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bir pipet kullanarak organoid süspansiyonu yavaşça toplayın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Tüpü 150 g'da üç dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın. Peleti mekanik olarak ayırmak için, 200 mikrolitre kültür ortamında yeniden süspanse edin ve süspansiyonu üç dakika santrifüjlemeden önce bir P200 pipeti kullanarak 20 ila 30 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Santrifüjleme ve süpernatantın çıkarılmasından sonra, pelete bire dört oranında orta ve taze hücre dışı matris veya ECM ekleyin ve iyice karıştırmak için hafifçe pipetleyin.

Kubbe başına 15 mikrolitre karışımı 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dağıtın. ECM'nin polimerizasyonuna izin vermek için plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derece, %5 karbondioksit inkübatörüne baş aşağı yerleştirin. Polimerizasyondan sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre taze kültür ortamı ekleyin ve boş dış kuyucukları PBS ile doldurun.

Numuneyi görüntülemeye hazırlamak için, 15 mikrolitre organoid ECM kubbesini 1.5 numaralı lamel tabanlı görüntüleme kabına dağıtın ve oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin. Plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derece, %5 karbondioksit inkübatörüne baş aşağı yerleştirin. Ardından, organoidleri tamamen batırmak için yavaşça yeterli kültür ortamı ekleyin.

Geçişten beş gün sonra, görüntülemeden hemen önce numuneyi PBS ile iki ila üç kez yıkayın. Ardından, görüntüleme için ortam denetleyicisini açın. Oda kontrol ünitesi otomatik olarak sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve karbondioksiti %5'e ayarlayacaktır Kapıyı açmak için Kapı düğmesine basın.

Hazne kuyusunun içinde ince bir tabaka oluşturacak şekilde su ekleyin. Görüntüleme çanağını kap tutucuya yerleştirin, görüntüleme odasına yerleştirin ve hareketi önlemek için bir pim kullanarak sabitleyin. Harici ışık girişimini önlemek için kapıyı kapatın.

Şimdi TomoStudio X yazılımını başlatın ve oturum açın. Ana pencereyi açmak için Başlat'a tıklayın ve ardından sol üst köşedeki Proje Ekle'ye tıklayın ve denemeyi atayın. Uygun kırılma indisi kullanımı için doğru ortam tipinin seçildiğinden emin olun.

Panelde istediğiniz kuyuya tıklayın ve ardından kuyuyu numune olarak kaydetmek için üstteki Oluştur'a tıklayın. Ardından, yemeğin ilgilendiği bölgeyi tanımlamak için sağ üst köşedeki ROI Kurulumu'na tıklayın. Ayarlandıktan sonra, Görüntü Edinme penceresini açmak için sağ alt köşedeki Denemeyi Çalıştır'a tıklayın.

Parlak bir alan görüntüsü görüntülemek için köşedeki Tekne Yükle'ye tıklayın. Görüntüyü odağa getirmek için Z ve Z düğmelerini kullanarak Z konumunu ayarlayın. Tek Görüntüleme sekmesinde, ROI boyutunu ayarlayın.

Organoidleri 160 mikrometreye 160 mikrometre görüş alanında yakalayın ve 140 mikrometre derinliğe kadar yığınlar elde edin. Uzun süreli görüntülemeyi ayarlamak ve istenen süreyi ve aralık süresini ayarlamak için Hızlandırılmış Görüntüleme sekmesine gidin. Geçerli ROI konumunu yakalamak için Tara simgesine tıklayın.

Parlak alan görüntüleme için yoğunluk ve pozlama değerlerini ayarlamak üzere BF düğmesini tıklatın. ROI'yi seçmek için Önizleme panelindeki ROI kutusunu taşıyın. İstenen ROI seçildikten sonra, alttaki Nokta Ekle'ye tıklayın, görüntüleme noktası listesi oluşturulacaktır.

Şimdi, görüntülemeye başlamak ve ham görüntü verilerini almak için Edin'i tıklayın. Masaüstü simgesine tıklayarak HTX İşleme Sunucusunu başlatın. Ham görüntü dosyalarını HTX İşleme Sunucusuna sürükleyip bırakın.

Ham görüntü dosyasından bir TCF dosyası oluşturmak için İşlem'i tıklatın. Masaüstü simgesine tıklayarak TomoAnalysis Viewer'ı başlatın. İşlenen TCF dosyalarını görüntüleyici penceresine sürükleyip bırakarak yükleyin.

ROI Tomogramını açmak için bir dosya küçük resmini çift tıklatın. Yakınlaştırma, kaydırma ve kaydırma kontrollerini kullanarak X, Y, Z düzlemleri arasında gezinerek 2B görünümü inceleyin. 3B oluşturma moduna geçmek için soldaki MIP oluşturma görünümü simgesine tıklayın.

Görüntüyü döndürerek, yakınlaştırarak ve kaydırarak 3B görünümde gezinin. Makine öğrenimi tabanlı görüntü segmentasyonu için, verilerin ilastik ile uyumlu çok boyutlu bir formatta olduğundan emin olmak için TCF görüntü dosyasını HDF5 formatına aktarın. ilastik'i açın ve Yeni Proje'ye gidin.

Segmentasyon İş Akışı bölümünün altında Piksel Sınıflandırması'nı seçin ve projeyi belirlenen bir klasöre kaydedin. HGF5 dosyasını yüklemek için Giriş Verileri sekmesine gidin, Yeni Dosya Ekle'ye tıklayın, uygun H5 veri kümesini seçin ve doğru görüntü kanalı atamalarını doğrulayın. Şimdi, segmentasyonu optimize etmek için renk, yoğunluk, kenar ve doku gibi özellikleri seçmek için Özellik Seçimi sekmesine gidin.

Eğitim sekmesinde, organoid ve organoid olmayan bölgeleri farklı renkli fırça darbeleri kullanarak etiketleyin. Segmentasyon sonuçlarını önizlemek ve gerekirse ayarlamalar yapmak için Canlı Güncelleme'yi tıklayın. İşiniz bittiğinde, Tahmin Dışa Aktarma sekmesine gidin.

Etiketli tahminleri dışa aktarmak için kaynak olarak Basit Segmentasyon'u seçin ve Tümünü Dışa Aktar'a tıklayın. Analiz gereksinimlerine göre dışa aktarma formatını H5 veya TIFF olarak ayarlayın. Nicel analiz için Ek Kodlama Dosyası 2'yi açın.

Maske dosyası ve komut dosyası içindeki ilgili TCF dosyası için uygun klasör yollarını belirleyin. Nicel analizi başlatmak için kodu çalıştırın. Kod, her veri kümesi için organoid hacmini, protein yoğunluğunu ve toplam protein içeriğini hesaplayacaktır.

Bu şekil, ince bağırsak organoidlerinin genel morfolojisini görselleştirmek için kullanılan yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu kırılma indisi rekonstrüksiyonlarını göstermektedir. Oluşturulan rekonstrüksiyonlar, üç optik kesit derinliğinin tamamında araçla işlenmiş ve sisplatin ile muamele edilmiş organoidler arasındaki belirgin yapısal farklılıkları ortaya koymaktadır. Sisplatin ile tedavi edilen organoidler, tedaviden 10 dakika sonra araçla tedavi edilen organoidlere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek hacim, daha düşük protein yoğunluğu ve daha yüksek toplam protein içeriği gösterdi, bu da erken yapısal şişmeyi ve protein bileşiminin değiştiğini gösteriyor.

24 saat boyunca hızlandırılmış görüntüleme, araçla tedavi edilen organoidlerin yapısal bütünlüğü koruduğunu, sisplatin ile tedavi edilen organoidlerin ise kript çökmesi ve artan hücre ayrışması dahil olmak üzere ilerleyici yapısal bozulma yaşadığını gösterdi ve bu da zamana bağlı sitotoksik hasarı düşündürdü. Kantitatif izleme, araçla tedavi edilen organoidlerin zamanla hacim ve protein içeriğinin arttığını doğrularken, sisplatin ile tedavi edilen organoidlerin her iki parametrede de zamana bağlı bir düşüş gösterdiğini, bu da sisplatinin büyümeyi baskıladığını ve hücresel bozulmayı indüklediğini gösterdi. Protein yoğunluğu, araçla tedavi edilen organoidlerde sabit kaldı, ancak 24 saatlik süre içinde sisplatin ile tedavi edilen organoidlerde giderek azaldı, bu da hücresel yapıda bir bozulma ve pul pul dökülme nedeniyle hücre dışı boşluğun arttığını düşündürdü.