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화합물 투여 III

Overview

출처: 케이 스튜어트, RVT, RLATG, CMAR; 발레리 A. 슈뢰더, RVT, RLATG. 노틀담 대학교, IN

실험실 마우스와 쥐에서 화합물 관리를 위한 많은 일반적으로 사용 되는 경로. 그러나, 특정 프로토콜 은 상인, 비강 내 및 두개 내 주사를 포함하여 덜 일반적으로 사용되는 경로의 사용을 요구할 수 있습니다. 이러한 절차를 성공적으로 수행하기 위해서는 전문 교육이 필수적입니다. 이러한 경로에 대한 정당성은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 승인을 얻기 위해 제공 될 수있다.

Principles

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Intraderma l주입은 진피의 외부 층으로 전달되며, 상부 피부 층(표피). 이 주사 경로는 일반적으로 항원에 염증, 피부 혈류 진단, 또는 알레르기 반응의 평가를 위해 예약되어 있습니다.

예방 접종 이나 충 혈 스프레이의 로컬 배달에 대 한 자주 사용 하지만, 비 강 내 관리 또한 전신 및 중추 신 경계에 사용할 수 있습니다 (CNS) 배달. 비강을 줄 점막은 급속한 전신 흡수및 CNS에 직접 표적을 허용하는 혈관 및 신경의 풍부한 공급을 가지고 있습니다. 작은 지방 성 분자로 구성 된 물질은 더 큰 분자를 포함 하는 것 보다 훨씬 더 큰 흡수 속도. 2

마취는이 절차에 대 한 필요 하지 않습니다, 그것은 nares에서 화합물의 적절 한 배치를 촉진할 수 있습니다., 정확한 적인 주전을 보장. 마취된 동물은 의식이 있는 동물에 비해 뇌에 약물의 5배 더 큰 전달을 갖는 것으로 입증되었습니다. 2 마취되지 않은 쥐는 비강 내 투여에 매우 내성이 있습니다. 그러나, 자유롭게 움직이는 쥐의 비강 내 투여를 위한 효과적인 전달 기술을 입증한 연구 결과가 있습니다. 3 또한, 경고 동물은 파이펫 팁, 또는 바늘에 물린 시도 할 수 있습니다, 물질의 전달을 어렵게 만들기.

비강 내 투여의 장점은이 기술은 최소한의 훈련과 기술이 필요하며 동물에게 비침습적이라는 것입니다. 그러나, 에어로졸화의 가능성때문에, 특히 의식이 있는 동물과 함께 일할 때, 생물안전 캐비닛및 눈 보호의 사용을 권고합니다. 또한, 동물을 익사 하지 않도록, 가능한 가장 작은 복용량을 사용 해야 합니다. 이 시술 중에 언제든지 시안색, 입 호흡 또는 다른 고민 징후가 동물에서 나타나면 절차는 즉시 중단되어야합니다.

성인 마우스와 쥐에서 두개 내 주사는 주입의 적절한 위치와 깊이를 보장하기 위해 스테레오 탁스 장비의 사용을 사용합니다. 그러나, 생쥐에서 3~28일의 나이, 그리고 14까지의 쥐는, 두개골은 그것을 통해 직접 주입할 만큼 충분히 얇습니다; 스테레오탁스 장치를 지원하기에는 너무 취약합니다. 마우스 또는 쥐 새끼는 절차가 완료 될 때까지 어머니와 함께 남아 있어야하며, 절차가 완료되면 가능한 한 빨리 그녀에게 반환해야합니다. 사후 관리는 간호를 포함하여 일반적인 운동 및 행동이 관찰될 때까지 열원에 대한 지속적인 모니터링을 포함합니다. 이 기술을 사용하는 주된 이유는 혈액-뇌 장벽을 교차해야 하는 중추 신경계에 약리학제를 제공하거나 전신 경로에 관련된 효과를 피하기 위한 것입니다. 1

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Procedure

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1. 인트레이더말 관리

  1. 대부분의 상인 주사는 수성 기반 화합물. 주사 부위에서 조직 괴사를 피하기 위해 중성 pH를 갖기 위해 생리적으로 완충되어야 한다.
  2. 바늘 크기 범위는 25-30 게이지이며 가능한 가장 작습니다.
  3. 주사 부위당 투여량 범위는 50-100 μL입니다. 과도한 부피를 주입하면 주사 부위에 괴사또는 압력으로 인해 화합물이 누출될 수 있다.
  4. 빈상인 공간에 바늘을 정확하게 배치하려면 쥐와 쥐를 마취할 필요가 있습니다. 흡입 마취는 급속한 유도 및 회복을 허용합니다; 그러나, 주 사용 마취는 지역의 준비를 위한 충분한 시간을 제공하고 주입을 능력을 발휘하는 장점이 있습니다. 1
  5. 탈필 크림을 사용하거나 부위를 면도하여 주사 부위에서 머리카락을 제거하십시오.
  6. 잔류 제분 크림이나 헤어 이물질을 철저히 제거하십시오.
  7. 요오드 용액, 클로르헤시딘 용액 또는 알코올과 같은 국소 살균제를 적용하십시오.
  8. 관리 절차
    1. 엄지와 검지 손가락 사이에 팽팽한 피부를 스트레칭합니다. 이것은 바늘을 배치 할 때 피부에 안정성을 제공합니다.
    2. 바늘을 피부에 베를 놓습니다.
    3. 표피와 진피 사이에 피부에 바늘을 부드럽게 삽입합니다. 바늘을 배꼽 너머로 전진시다.
    4. 물질을 천천히 주입하십시오. 화합물의 주입은 피부에 출혈, 또는 작은 물집을 만들 것입니다.
    5. 바늘을 철회하기 전에 피부가 스트레칭하고 조정할 수 있도록 주입 후 일시 중지합니다.
  9. 예방 조치
    1. 플런저를 다시 당기는 것은 필요하지 않습니다.
    2. 바늘이 피하 공간에 삽입되면 출혈이 형성되지 않습니다. 너무 깊이 주입 피하 주사 결과.
    3. 화합물이 주입 부위에서 누출될 수 있으므로 부위를 블로팅하거나 닦지 마십시오.
    4. 여러 주사를 수행 할 때, 블렙이 겹치지 않도록 그들을 공간.

Figure 1
그림 1. 쥐에서 상인 주사.

2. 비강 내 관리

  1. 설비
    1. 정확한 볼륨을 제공하기 위해 보정할 수 있는 마이크로파이프팅 유닛 파이펫을 사용합니다.
    2. 일회용 파이펫 팁은 교차 오염을 방지하기 위해 사용되어야 합니다. 결핵 주사기, 무딘 바늘 및 유연한 튜브도 투약에 사용할 수 있습니다.
    3. 쥐에 대한 총 사출 부량은 40-100 μL을 초과해서는 안되며 6-10 μL 방울로 주어져야합니다. 마우스의 경우 최대 총 부피는 24 μL이며 3-4 μL 방울로 제공됩니다.
  2. 의식적인 동물의 행정
    1. 의식동물의 수동 구속은 피펫 팁이나 무딘 바늘이 화합물을 전달하기에 충분히 가까이 배치될 수 있도록 머리가 상대적으로 움직이지 않도록 해야 하지만, 비강을 찌르거나 레이스화하는 것만큼 가깝지 않다.
    2. 동물을 억제하고 수직 위치에 고정합니다.
    3. 비강 개구부에 액체 화합물의 작은 방울을 놓습니다. 동물은 물방울을 흡입해야합니다.
    4. 전체 볼륨이 주어질 때까지 nares를 번갈아 가며 추가 볼륨을 관리합니다.
    5. 더 큰 볼륨을 투여 할 때 구속 하는 동안 가슴을 수축 하지 않는 것이 중요 하다. 가슴 압박은 동물이 기관지와 폐에 액체를 그리기 위해 충분히 심호흡을 하는 능력을 방해합니다.

Figure 2
그림 2. 의식마우스에서 비강 내 투여.

  1. 무의식적인 동물의 행정
    1. 흡입 마취제를 사용하면 화합물의 접근 및 전달 중에 고정 된 동물을 허용합니다. 이것은 동물이 투약 장비를 물고, 머리의 경련으로 인한 화합물의 손실, 동물의 비강 조직, 눈 또는 얼굴 피부에 부상을 입을 가능성을 제거합니다. 동물은 또한 흡입 하 고 투여 시 nares에서 화합물을 스프레이 가능성이 적습니다.
    2. 동물을 척추 위치에 놓습니다. 헤드의 위치는 나레에 솔루션의 배치에 영향을 미칩니다. CNS 전달에 이상적인 위치는 동물 척추와 함께 있음을 입증되었습니다. 이것은 더 나은 흡수를 허용합니다. 2
    3. 화합물의 절반을 비강 개구부의 한쪽으로 직접 투여하고 흡입으로 타이밍을 맞춰 다. 그런 다음 동물을 뒤집습니다.
    4. 위와 같이, 다른 비강 개구부로 부피의 나머지 절반을 관리한다.

Figure 3
그림 3. 무의식성 마우스에서 비강 내 투여.

3. 신생아 쥐와 쥐의 두개 내 투여

  1. 마우스 또는 쥐는 두개 내 주사를 위해 마취되어야 합니다.
마우스
나이(일) 니들 게이지(g) 나이(일) 니들 게이지(g)
0-7 29-30 0-5 27-29
7-14 27 5-10 25-27
14-28 25 10-14 25
나이(일) 바늘 길이(mm) 나이(일) 바늘 길이(mm)
0-7 2 0-4 2-3
7-14 3 4-7 3
14-21 4 7-10 4
21-28 5 10-14 5
나이(일) 부피(μL) 나이(일) 부피(μL)
0-5 <20 1-3 <20
6-20 <60 4-10 <60
20-28 <100 11-14 <100

표 1. 바늘 게이지, 바늘 길이 및 쥐와 쥐의 나이에 따라 두개 내 투여의 최대 볼륨. 4

  1. 설비
    1. 표 1에따라 올바른 바늘 게이지 및 최대 투여 량을 결정합니다.
    2. 동물을 마취하기 전에 바늘 가드를 준비하십시오.
      참고 : 바늘의 주입 깊이는 바늘 캡으로 생성 되는 가드의 사용을 통해 제어 됩니다.
      1. 가드를 만들려면 바늘이 바늘 캡에 대해 측정되고 캡에 마크가 놓아 절단 위치를 나타냅니다. 캡을 바늘에 교체 할 때 바늘의 2 ~ 5mm가 노출되도록 절단해야합니다.
      2. 노출된 바늘의 길이는 피부와 두개골을 관통하고 뇌의 원하는 깊이에 도달할 만큼 길어야 합니다.
      3. 마우스와 쥐에 필요한 바늘 길이는 표 1에나열됩니다.
    3. 새끼의 저체온증을 방지하기 위해 가열 원이 필요합니다. 낮은 전기 난방 패드, 순환 하는 물 담요, 또는 재사용 가능한 화학 반응 열 파우치 : 여러 가지 유형이 있습니다.
  2. 구속
    1. 마우스와 쥐 새끼 10 나이 의 일 또는 더 젊은이 절차에 대 한 마취를 필요로 하지 않습니다. 머리 바로 뒤에 그들을 잡고 어깨에 약간의 압력을 넣어 피부 caudally 당겨 수동으로 그들을 억제.
    2. 이소플루란 흡입으로 10 일 이상 새끼를 마취합니다. 유도 챔버를 정밀 기화기 또는 이소플루란으로 담근 면공을 가진 벨 항아리에 부착하십시오. 강아지가 고정되면 마취는 약 40 초 동안 효과적이며 주입에 충분한 시간을 제공합니다.
  3. 사출 기술
    1. 주사기에 물질을 넣고 캡/바늘 가이드를 바늘 위에 놓습니다.
    2. 신생아 마우스 또는 쥐당 최대 부피로 권장되는 주사 부피는 100 μL이며, 짜는 쥐또는 더 오래된 마우스의 경우 최대 300 μL입니다.
    3. 신생아의 대뇌 피질에 주입하려면, 눈 뒤에 바늘 5mm를 삽입, 두개골의 중간선에서 약 3mm.
    4. 짜는 마우스 주입 부위는 눈과 귀 사이의 약 절반 정도이며 중간선 바로 바 떨어져 있습니다.

Figure 4
그림 4. 마우스 새끼의 두개 내 투여.

때때로, 다른 실험 적인 접근 설치류에 화합물 관리의 덜 일반적으로 사용 되는 경로의 사용을 필요로. 인트레이더피, 비강 내 및 두개 내은 생물 의학 연구원이 오늘날 실험실에서 사용하는 3개의 대체 경로입니다.

그들의 이름에서 알 수 있듯이, 상인은 진피의 외부 층으로 화합물을 전달하고 있다. 비강 내는 동물의 나레에 용액을 배치하고 있습니다. 그리고 두개 내 설치류의 뇌에 직접 바늘을 삽입하는 것을 포함한다.

이러한 절차를 성공적으로 수행하기 위해서는 전문 교육이 필수적입니다. 여기에서는 이러한 각 방법에 대한 고려 사항을 먼저 설명한 다음 동물의 안전과 실험의 성공을 보장하면서 절차를 배우는 데 도움이되는 기술을 시연 할 것입니다.

이러한 경로가 일반적으로 사용되는 시기와 이러한 특수 관리 기술을 수행하기 전에 염두에 두어야 할 것들에 대한 논의부터 시작합시다.

상인 주사는 표피와 진피 사이의 공간으로 기사를 전달하는 데 사용이 경로는 일반적으로 염증의 평가를 위해 예약, 피부 혈류 진단, 또는 항원에 알레르기 반응. 다른 경로와 마찬가지로, 상인용액도 멸균 기술을 사용하여 준비되어야 한다. 그리고 주사 부위에서 조직 괴사를 피하기 위해 중성 pH를 갖기 위해 생리학적으로 완충되어야 한다. 25-30 게이지 바늘을 가진 허브리스 시스템은 종종이 주입에 사용됩니다. 이 시스템은 주사 부위당 50-100 마이크로리터 범위에 있는 관리의 양을 보존하는 데 도움이 됩니다. 초과 를 주입하면 압력으로 인해 괴사 또는 바람직하지 않은 화합물 누출이 발생할 수 있습니다.

비강 내 경로는 종종 예방 접종 이나 충 혈 스프레이뿐만 아니라 전신 및 CNS 배달의 로컬 배달을 위해 선택됩니다. 비강을 줄 점막은 급속한 전신 흡수및 CNS에 직접 표적을 허용하는 혈관 및 신경의 풍부한 공급을 가지고 있습니다. 이것은 최소한의 훈련과 기술, 간단한 장비 - 보정 된 마이크로 파이프와 일부 일회용 팁이 필요한 비 침습적 인 방법입니다. 쥐에 대한 투여 량은 6-10 마이크로 리터 방울에 주어진 40-100 마이크로 리터를 초과해서는 안됩니다. 그리고 마우스의 경우, 최대 총 부피는 3-4 마이크로리터 방울에 주어진 24 마이크로리터입니다.

마취는이 절차에 필요하지 않지만, 그것은 의식 동물에 비강 내 투여에 비해 몇 가지 장점이 1) 그것은 nares에서 화합물의 적절한 배치를 용이하게, 정확한 투약 2) 투약 장비 3) 동물의 비강 조직에 부상이 없다는 것을 보장, 동물의 비강 조직에 부상이 없다는 것을 보장, 눈 또는 머리의 경련으로 인한 얼굴 피부, 및 4) 동물은 투여 시 나레에서 화합물을 흡입하고 분사할 가능성이 적습니다.

성인 마우스와 쥐에서 두개 내 주사는 "신경 과학의 필수" 컬렉션의 비디오에 설명되는 스테레오탁스 장비의 사용을 사용합니다. 장비는 적절한 위치와 정확한 사출 깊이를 보장합니다. 여기서는 두개골이 직접 주입할 수 있을 만큼 얇고 스테레오탁스 장치를 지원하기에는 너무 취약할 수 있는 신생아 쥐와 쥐의 두개내 전달에 초점을 맞출 것입니다. 이 기술의 주요 목적은 CNS 약리학 에이전트를 CNS에 직접 전달하고, 어떤 전신 경로를 통해 발생하는 효과를 피하는 것입니다. 바늘 게이지, 길이 및 투여량은 새끼의 종 과 나이에 따라 결정됩니다. 동물의 나이가 증가함에 따라 게이지 수가 감소하고 필요한 바늘 길이가 증가하고 최대 권장 투여 량도 증가합니다.

이 배경 정보를 염두에 두고 이러한 주입 방법의 절차를 자세히 살펴보겠습니다. 첫 번째는 상인 관리 기술입니다. 이 절차는 마취 된 동물에서 수행되어야합니다. 마취 유도 및 유지 보수 절차를 이해하기 위해이 컬렉션의 다른 비디오를 검토하십시오.

동물이 마취되면 전기 면도기 또는 탈모 크림을 사용하여 주사 부위를 면도하십시오. 물에 약해진 거즈로 현장에서 느린 머리카락을 철저히 제거하십시오. 그런 다음 다른 거즈 패드를 사용하여 소소 살균 용액을 면도 부위에 적용합니다. 투여를 위해 먼저 엄지와 검지 손가락 사이에 스트레칭하여 주사 부위의 피부를 안정시킵니다.

이제 바늘을 피부에 베벨을 올려 놓고 개구부가 표피와 진피 층 사이에 있도록 벨 바로 너머로 부드럽게 삽입하십시오. 그런 다음 천천히 주입하고 피부에 출혈을 일으킨다는 점에 유의하십시오. 바늘이 너무 깊게 삽입되면 흠이 형성되지 않습니다. 주입 후, 피부를 스트레칭하고 조정 할 수 있도록 일시 중지한 다음 천천히 바늘을 철회합니다. 조직을 작성하고 주사 부위에 외상을 일으킬 것이기 때문에 언제든지 플런저에 다시 당기지 마십시오. 또한 주입 부위를 닦거나 얼룩지지 마십시오. 여러 주사를 수행 할 때, 흠이 서로 겹치지 않도록 충분히 넓은 간격을 두십시오.

다음으로, 의식적이고 마취된 동물에서 비강 내 투여 절차를 배우도록 합시다.

깨어있는 동물의 경우 목덜미에서 피부를 뒤처진 다음 머리를 고정한 후 동물을 수직 으로 고정하여 억제하십시오. 액체를 폐로 끌어들이기 위해 충분히 심호흡을 하는 동물의 능력을 방해할 수 있기 때문에 가슴을 수축시키지 않도록 주의하십시오. 마이크로 피펫을 사용하여 비강 개구부에 작은 액체 방울을 배치하여 용액의 일부를 관리하십시오. 동물은 물방울을 흡입합니다. 이 과정을 반복하여 관리될 전체 부피가 주어질 때까지 두 비강 개구부 간에 교대로 처리합니다. 리콜 - 투여의 총 부피는 각각 24 μl및 100 μl을 초과해서는 안됩니다.

마취 된 마우스와 쥐의 경우 동물을 등삼 재조건 위치에 놓습니다. 이 위치는 화합물의 더 나은 흡수를 허용 으로 CNS 전달에 이상적입니다. 동물의 머리를 회전시키고 화합물의 절반을 비강 개구부의 한쪽으로 직접 관리하여 흡입으로 타이밍을 맞습니다. 그런 다음 동물의 머리를 회전하여 다음 관리를 위해 배치합니다. 2 호흡 정도 후, 두 번째 비강 개구부로 남은 부피를 관리한다. 완전한 투여 후 동물을 다시 케이지로 되돌리게 합니다.

다음으로, 신생아 마우스와 쥐에 대한 두개 내 투여 절차를 검토해봅시다. 시술을 시작하기 전에 케이지에 새끼와 댐을 낮게 설정된 전기 난방 패드에 놓습니다. 케이지의 일부가 가열 패드에서 벗어났는지 확인합니다. 이것은 저체온증을 방지하고 동시에 댐이 원한다면 열에서 벗어나게하는 것입니다. 다음으로, 동물의 나이에 적합한 바늘 게이지를 선택한다. 리콜, 바늘 게이지; 두개 내 주사 중 바늘의 깊이를 조절하는 데 사용되는 바늘 길이; 그리고 관리의 볼륨 ... 모든 동물의 나이와 종에 따라 다릅니다.

길이는 가드를 사용하여 조정됩니다. 이 가드를 준비하려면 캡에 올바른 바늘을 측정하고 마크를 만듭니다. 그런 다음 두 번째 마크를 캡에 배치하여 절단 위치를 나타냅니다. 두 마크 사이의 거리는 원하는 바늘 길이입니다. 그런 다음 면도칼로 캡을 잘라냅니다. 그들은 캡을 분쇄하고 깨끗한 레벨 컷을 생성하지 않습니다로 가위를 사용하지 마십시오. 이것은 "바늘 가드"입니다. 더 이상 멸균되지 않는 가드를 만드는 데 사용되는 바늘을 폐기하고 대신 새 바늘을 가드에 삽입하고 올바른 길이가 노출되도록하십시오. 다음으로, 적합한 주사기에 부착된 다른 바늘을 사용하여 주사 물질을 끌어당는다. 다른 바늘은 스토퍼에 배치크게 두개 내 관리에 이상적이지 않은 이러한 미세 게이지 바늘을 둔하게하기 때문에,이 작업을 수행하는 데 사용됩니다. 그런 다음 채워진 주사기를 바늘에 가드와 함께 놓습니다. 이제 시스템은 주입에 대한 준비가되어 있습니다.

10 일 이상 새끼의 경우 흡입 마취를 투여하십시오. 10 일 미만의 새끼는 마취 할 필요가 없습니다. 주사를 수행하려면 먼저 눈 뒤에 5mm와 두개골 의 중간선에서 약 3mm 인 사이트를 찾습니다. 다음으로 바늘 을 바늘 가드에 의해 허용 된 깊이에 삽입합니다. 그런 다음 뇌에 대한 외상을 피하기 위해 느린 꾸준한 방식으로 주입하십시오. 즉시 뇌 조직의 부상을 방지하기 위해 세심한주의를 기울여 바늘을 제거하십시오. 마지막으로, 적절한 회복을 위해 동물을 댐에 다시 배치합니다.

이제 이러한 드문 행정 경로를 활용하는 실험실에서 수행되는 몇 가지 실험을 검토해 보겠습니다.

상인 주사는 종종 피부 염증 반응을 연구하는 데 사용됩니다. 이 실험에서, 연구원은 한 귀에 알러지 유발 물질과 미리 감이 있는 마우스의 반대 귀에 중성 물질을 주입하기 위하여 이 방법을 이용했습니다. 다음으로, 그들은 알레르겐 주입으로 인한 혈관 투과성의 변화를 조사하기 위해 동물의 순환 시스템에 파란색 염료를 전달했습니다.

앞에서 언급했듯이, 비강 내 투여의 응용 프로그램 중 하나는 백신을 투여하는 것입니다. 여기서 과학자들은 이 경로를 사용하여 유전자 변형, 세포형 및 형질전환 마우스로 감쇠된 인플루엔자 백신을 전달하고 특정 유형의 T 세포의 생산을 통해 점막 면역을 연구했습니다.

마지막으로, 이러한 생체 의학 연구는 인간 뇌종양 모델을 만들기 위해 면역 손상된 마우스에 암세포를 이식하기 위해 두개내 투여를 사용하였다. 주사의 효능은 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 분석하였다.

당신은 jus 실험실 마우스와 쥐에서 화합물 관리의 특별한 방법의 일부에 JoVE의 비디오를 보았다. 이러한 절차가 언제 도움이 되는지, 이러한 기술을 수행하기 전과 동시에 염두에 두어야 할 고려 사항, 그리고 행정부가 동물의 건강과 수집할 실험 데이터에 최소한의 영향을 미치는지 확인하는 필수 절차 단계를 이해해야 합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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Applications and Summary

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동물로 화합물의 관리 동물의 웰빙과 실험 데이터 및 과학적 가치의 결과 모두에 중요 한 영향을 미칠 수 있습니다. 적절한 전달 방법은 실험의 성공에 필수적입니다. 연구의 과학적 목표, 물질의 pH, 필요한 투여량, 물질의 점도, 동물의 웰빙 등 최상의 경로를 결정하는 데 많은 요소를 고려해야 합니다. 기술 전문 지식은 또한 모든 주입 방법에 대한 요구 사항입니다.

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References

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  4. Morton, D.A., Jennings, M., Buckwell, A., Ewbank, R., Godfrey, C., Holgate, B., Inglis, I., James, R., Page, C., Sharman, I., Verschoyle, R., Westall, L., and Wilson, A.B. 2001. Refining procedures for the administration of substances Report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Members of the Joint Working Group on Refinement. Laboratory Animals. 35: 1-41.

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