Una panoramica sull'analisi dei biomarcatori bGDGT per la paleoclimatologia
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Overview
Fonte: Laboratorio di Jeff Salacup – Università del Massachusetts Amherst
Attraverso questa serie di video, campioni naturali sono stati estratti e purificati alla ricerca di composti organici, chiamati biomarcatori, che possono mettere in relazione informazioni su climi e ambienti del passato. Uno dei campioni analizzati era sedimento. I sedimenti si accumulano nel corso del tempo geologico in bacini, depressioni nella Terra in cui i sedimenti fluiscono attraverso l’azione del fluido (acqua o aria), movimento e gravità. Esistono due tipi principali di bacini, marini (oceani e mari) e lacustri (laghi). Come si può immaginare, in questi contesti vivono tipi di vita molto diversi, guidati in gran parte dalla differenza di salinità tra di loro. Negli ultimi decenni, i geochimici organici hanno scoperto una cassetta degli attrezzi di proxy di biomarcatori, o composti che possono essere utilizzati per descrivere il clima o l’ambiente, alcuni dei quali funzionano in ambienti marini e alcuni dei quali funzionano in lacustri. Rivolgiamo qui la nostra attenzione al regno lacustre e ai tetraeteri di glicerolo dialchilglicerolo ramificato (Figura 1).
In questa sezione ci concentriamo sull’analisi della paleotemperatura terrestre utilizzando tetrateri di glicerolo dialchilglicerolo ramificato(Figura 1;brGDCT) e il proxy MBT/CBT. Questo proxy è stato inizialmente descritto da Weijers et al. 1 e si basa sulla distribuzione di strutture ad anello e di diramazione in brGDCT. Hanno scoperto che la ciclizzazione dei tetraeteri ramificati (CBT) era direttamente correlata al pH del suolo.
CBT = -log ((Ib + IIb) / (I + II))
E che la metilazione dei tetraeteri ramificati (MBT) è stata determinata dalla temperatura media annuale dell’aria (MAAT) e, in misura minore, dal pH del suolo.
MBT = (I + Ib + Ic) / (I + Ib + Ic) + (II + IIb + IIc) + (III + IIIb + IIIc)
Pertanto, presi insieme e calibrati, MBT / CBT mette in relazione la distribuzione dei brGDCT sia alla temperatura del suolo che al pH.
MBT = 0,122 + (0,187 x CBT) + (0,020 x MAAT)
Si pensa che i GDCT ramificati siano lipidi a membrana e la loro produzione è stata inizialmente attribuita a batteri acidobatteri anaerobici che vivono nei terreni e nella torba2-5,ma lavori successivi hanno suggerito che potrebbero anche essere prodotti in colonne e sedimenti di lago ossico e anossico e marino6-9. L’ipotesi sostiene che gli acidobatteri trasformino i siti di metilazione in ciclizzazioni in risposta all’abbassamento della temperatura al fine di aumentare l’insaturazione (la ciclizzazione rimuove efficacemente due atomi di idrogeno) e mantenere la fluidità della membrana (per analogia, il grasso saturo (burro) è un solido a temperatura ambiente mentre il grasso insaturo (olio d’oliva) è un liquido), ma i GDCT ramificati non sono ancora stati identificati come i principali lipidi di membrana nelle colture di acidobatteri. Quindi la loro esatta provenienza è sconosciuta.
La calibrazione dei GDCT ramificati a variabili ambientali (temperatura, pH, salinità, precipitazioni, ecc.) è un argomento di ricerca diffusa. I laboratori di geochimica organica di tutto il mondo sono coinvolti nel compito di sviluppare calibrazioni globali1,10 e regionali11-13 tra DGT ramificati e (principalmente) temperatura. Pertanto, le equazioni sopra indicate vengono regolarmente perfezionate e perfezionate.
I GDCT ramificati vengono solitamente estratti da sedimenti lacustri, sebbene siano stati studiati anche i sedimenti marini costieri. Gli estratti subiscono una colonna di gel di silice per purificare i GDCT da altri composti che potrebbero non essere suscettibili di LC o che potrebbero co-eluire con i GDCT cromatograficamente. I GDCT escono nella frazione polare che eluisce nel metanolo.
Una volta purificato l’estratto lipidico totale, il campione estratto e purificato viene eseguito su un cromatografo liquido ad alte prestazioni accoppiato a uno spettrometro di massa a ionizzazione chimica. La concentrazione relativa dei GDCT è determinata ottenendo l’area sotto la curva per lo ione di massa selezionato (m/z; Figura 1) per ciascuno dei composti su software per computer progettati proprio per questo scopo (come Agilent Chemstation). Queste aree vengono quindi inserite nell’equazione di calibrazione selezionata per arrivare a una determinazione della paleotemperatura.
Figura 1. Strutture dei GDCT ramificati utilizzati per il calcolo della temperatura tramite proxy MBT / CBT (utilizzato con il permesso della dott.à 0 Isla Castañeda, che ha prodotto l’immagine). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I composti organici chiamati biomarcatori possono essere utilizzati nelle scienze della Terra come paleotermometri per mettere in relazione informazioni su climi e ambienti del passato.
Gli organismi viventi producono questi biomarcatori, che ci forniscono informazioni sull’ambiente in cui vivevano. Possono fungere da proxy per dirci informazioni su eventi passati, come la temperatura della Terra milioni di anni fa.
La paleotemperatura terrestre può essere analizzata utilizzando biomarcatori trovati nei sedimenti dei bacini d’acqua dolce. Una classe chiave di questi biomarcatori sono i tetraeteri di glicerolo dialchilglicerolo ramificato o gDFT ramificati.
Questo video introdurrà l’area di studio, chiamata paleoclimatologia, che indaga i cambiamenti passati negli ambienti di acqua dolce nel corso di centinaia di milioni di anni. Questo aiuta a chiarire i cambiamenti climatici e ambientali attuali e futuri.
I sedimenti si accumulano nel corso del tempo geologico, a causa del movimento del fluido e della gravità, nei bacini sedimentari o nelle aree basse della crosta terrestre. I bacini sedimentari includono oceani, che raccolgono sedimenti marini, o laghi, che raccolgono sedimenti lacustri. I bacini marini e lacustri contengono diversi tipi di organismi, guidati in gran parte dalla differenza di salinità tra di loro. Pertanto, i bacini marini e lacustri contengono diversi biomarcatori.
Si ritiene che i GDCT ramificati siano lipidi che attraversano la membrana degli acidobatteri anaerobici. La ricerca suggerisce che gli organismi produttori cambiano le proprietà della membrana in risposta al cambiamento di temperatura.
Questo cambiamento è causato dalla trasformazione di siti metilati sui GDGT ramificati in siti ciclizzati a temperature più fredde, migliorando così la fluidità della membrana. Questo cambiamento nella struttura può quindi essere correlato alla temperatura attraverso un proxy. I proxy sono fenomeni fisici misurabili che sono correlati a variabili incommensurabili.
Questo proxy mette in relazione il numero di metilazioni o MBT e ciclizzazioni, o CBT, nel biomarcatore con la temperatura. Un’equazione derivata sperimentalmente può mettere in relazione MBT e CBT con la passata temperatura media annuale dell’aria.
Per studiare la relazione tra i biomarcatori GDGT ramificati e la temperatura del suolo, i sedimenti lacustri devono essere raccolti, estratti con una delle tre tecniche, purificati e analizzati.
Per iniziare a studiare la relazione tra i biomarcatori GDGT ramificati e la temperatura del suolo, le molecole lipidiche vengono prima estratte dai sedimenti lacustri, utilizzando una varietà di tecniche. L’estrazione tramite sonicazione è il metodo più semplice e meno costoso per ottenere l’estratto lipidico totale, o TLE, da un campione di sedimento. Per questo, un bagno ad ultrasuoni viene utilizzato per agitare il campione in una fiala contenente solvente organico. Una miscela di metanolo e diclorometano viene utilizzata per estrarre biomarcatori con una vasta gamma di polarità. Un’altra tecnica di estrazione utilizza l’estrazione Soxhlet. Un estrattore Soxhlet consente il reflusso, o ciclo continuo, di solvente organico da un pallone a fondo tondo verso l’alto in un condensatore, che viene raffreddato da acqua fredda e restituito. Il solvente condensato cade in un ditale in fibra di vetro contenente il campione. Una volta piena, la camera riversa il solvente organico nel pallone a fondo tondo, consentendo un’estrazione continua nel tempo.
Questa tecnica è utile nell’estrazione di grandi masse di sedimenti e nella preparazione di grandi volumi di standard per la calibrazione degli strumenti. Infine, l’estrazione accelerata con solvente, o ASE, è un metodo di estrazione registrato che utilizza alte temperature e pressioni per aumentare la cinetica del processo di estrazione. Lo strumento ASE può contenere fino a 24 campioni singoli e consente un controllo preciso di tutti i parametri nel processo di estrazione. Grazie alla sua velocità e semplicità d’uso, l’ASE è comunemente usato come metodo standard di estrazione con solvente.
Una volta che il campione lipidico viene estratto utilizzando una di queste tecniche, viene purificato in preparazione per l’analisi. Tipicamente, la cromatografia a colonna di gel di silice viene utilizzata per purificare il campione lipidico in base alla sua polarità. Per questo, una piccola colonna di vetro viene caricata con una polvere fine di silice, chiamata gel. La colonna viene quindi satura di un solvente apolare, tipicamente esano, e quindi il campione caricato sulla parte superiore. La separazione dell’estratto si basa sull’affinità del composto bersaglio sia per la fase solida che per la fase solvente.
I composti polari, in questo caso i GDGT ramificati, sono più attratti dalla silice polare rispetto all’esano apolare. Pertanto, i composti apolari, come gli idrocarburi, i composti mediopolari, come chetoni e alcoli, e i composti altamente polari, percorreranno la colonna a velocità diverse e in risposta a solventi di polarità crescente.
Gli eluenti vengono quindi raccolti in frazioni separate.
I GDGT purificati vengono quindi analizzati utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata a uno spettrometro di massa o LC-MS. LC-MS prima separa i composti e poi li analizza in base al loro rapporto massa-carica.
Ciò consente di determinare la concentrazione relativa di ciascun tipo di GDGT utilizzando l’area sotto la curva per lo ione di massa selezionato. MBT è calcolato come la frazione delle molecole del gruppo 1 al totale.
La CBT viene quindi calcolata come log negativo utilizzando molecole nei gruppi 1 e 2. MBT e CBT vengono quindi inseriti in un’equazione derivata sperimentalmente, al fine di arrivare a una determinazione paleotemperatura.
La determinazione della paleotemperatura utilizzando proxy di biomarcatori è utile in una serie di applicazioni nelle scienze della terra.
In primo luogo, la paleotermometria consente la determinazione della temperatura terrestre per lunghi periodi di tempo. Utilizzando varie tecniche, la temperatura della Terra è stata stimata fino a 500 milioni di anni fa. Questo ci dice l’involucro di temperatura entro il quale si sono evolute diverse forme di vita e informa le indagini sugli effetti della temperatura sulla biosfera, l’idrosfera, la litosfera e l’atmosfera della Terra nel passato e, per estensione, nel futuro.
Le tendenze più recenti della temperatura terrestre possono anche essere quantificate rispetto ai record costruiti utilizzando la paleotermometria. La temperatura della superficie terrestre è aumentata di quasi 1 grado dal 1850 ad oggi con un’accentuata tendenza al riscaldamento negli ultimi due decenni. Per comprendere l’impatto antropogenico sul clima globale, è necessario sviluppare e utilizzare come contesto registrazioni paleoclimatiche accurate.
Hai appena visto la panoramica di JoVE sulla paleotermometria del glicerolo dialchilglicerolo ramificato tetraetere. Ora dovresti capire come vengono utilizzati i biomarcatori GDGT ramificati e la tecnica generale di estrazione e purificazione. I seguenti video di questa serie entreranno più in dettaglio su questo complesso processo.
Grazie per l’attenzione!
Procedure
References
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Transcript
Organic compounds called biomarkers can be used in Earth Science as paleothermometers to relate information on climates and environments of the past.
Living organisms produce these biomarkers, which provide us with information about the environment in which they lived. They can act as a proxy to tell us information about past events, like the Earth’s temperature millions of years ago.
Terrestrial paleotemperature can be analyzed using biomarkers found in sediment from fresh-water basins. One key class of these biomarkers are branched glycerol dialkyl glycerol tetraethers, or branched GDGTs.
This video will introduce the area of study, called paleoclimatology, which investigates past changes in fresh-water environments over hundreds of millions of year. This helps elucidate current and future climate and environmental changes.
Sediments accumulate over geologic time, due to fluid movement and gravity, in sedimentary basins, or low areas in the Earth’s crust. Sedimentary basins include oceans, which collect marine sediment, or lakes, which collect lacustrine sediment. Marine and lacustrine basins contain different types of organisms, driven in large part by the difference in salinity between them. Thus, marine and lacustrine basins contain different biomarkers.
Branched GDGTs are thought to be membrane-spanning lipids of anaerobic acidobacteria. Research suggests that the producing organisms change membrane properties in response to changing temperature.
This change is caused by the transformation of methylated sites on the branched GDGT’s to cyclized sites at colder temperatures, thereby enhancing membrane fluidity. This change in structure can then be correlated to temperature through a proxy. Proxies are measureable physical phenomena that are correlated to immeasurable variable.
This proxy relates the number of methylations or MBT, and cyclizations, or CBT, in the biomarker to temperature. An experimentally-derived equation can relate MBT and CBT to the past Mean Annual Air Temperature.
To study the relationship between branched GDGT biomarkers and soil temperature, lacustrine sediment must be collected, extracted by one of three techniques, purified, and analyzed.
To begin studying the relationship between branched GDGT biomarkers and soil temperature, the lipid molecules are first extracted from lacustrine sediments, using a variety of techniques. Extraction via sonication is the simplest and least expensive method of obtaining the total lipid extract, or TLE, from a sediment sample. For this, an ultrasonic bath is used to agitate the sample in a vial containing organic solvent. A mixture of methanol and dichloromethane is used to extract biomarkers with a wide range of polarities. Another extraction technique utilizes Soxhlet extraction. A Soxhlet extractor enables the reflux, or continuous cycling, of organic solvent from a round-bottom flask upward into a condenser, which is cooled by cold water and returned. The condensed solvent falls into a glass fiber thimble containing the sample. Once full, the chamber siphons the organic solvent back into the round-bottom flask, enabling continuous extraction over time.
This technique is helpful in the extraction of large sediment masses, and the preparation of large volumes of standards for instrument calibration. Finally, accelerated solvent extraction, or ASE, is a trademarked method of extraction that utilizes high temperature and pressure to increase the kinetics of the extraction process. The ASE instrument holds up to 24 individual samples, and allows for precise control of all parameters in the extraction process. Due to its speed and simplicity of use, ASE is commonly used as the standard method of solvent extraction.
Once the lipid sample is extracted using one of these techniques, it is purified in preparation for analysis. Typically, silica gel column chromatography is used to purify the lipid sample based on its polarity. For this, a small glass column is loaded with a fine powder of silica, called a gel. The column is then saturated with an apolar solvent, typically hexane, and then the sample loaded on the top. The separation of the extract is based on the affinity of the target compound for either the solid phase or the solvent phase.
Polar compounds, in this case branched GDGT’s, are more attracted to the polar silica than the apolar hexane. Thus, the apolar compounds, such as hydrocarbons, the mid-polar compounds, such as ketones and alcohols, and the highly polar compounds, will travel the column at different rates and in response to solvents of increasing polarity.
The eluents are then collected in separate fractions.
The purified GDGT’s are then analyzed using high performance liquid chromatography coupled to a mass spectrometer, or LC-MS. LC-MS first separates the compounds, and then analyzes them based on their mass-to-charge ratio.
This enables the determination of the relative concentration of each type of GDGT using the area under the curve for the selected mass ion. MBT is calculated as the fraction of the group 1 molecules to the total.
CBT is then calculated as a negative log using molecules in groups 1 and 2. MBT and CBT are then plugged into an experimentally-derived equation, in order to arrive at a paleotemperature determination.
The determination of paleotemperature using biomarker proxies is useful in a range of applications in earth science.
First, paleothermometry enables the determination of the Earth’s temperature over long periods of time. Using various techniques, the temperature of Earth has been estimated as far back as 500 million years. This tells us the envelope of temperature within which different forms of life evolved and informs investigations of the effects of temperature on Earth’s biosphere, hydrosphere, lithosphere, and atmosphere in the past, and by extension, the future.
More recent trends in the Earths temperature can also be quantified against records constructed using paleothermometry. The Earths surface temperature has increased by nearly 1 degree from 1850 to the present with an accentuated warming trend in the last two decades. To understand the anthropogenic impact on global climate, accurate paleoclimate records must be developed and used as context.
You’ve just watched JoVE’s Overview of Branched Glycerol Dialkyl Glycerol Tetraether Paleothermometry. You should now understand how the branched GDGT biomarkers are used, and the overall technique of extracting and purifying them. The following videos in this series will go into more detail about this complex process.
Thanks for watching!