Flowcytometrisk analyse af mitofagi, i murin pancreas β-celler ved hjælp af den genetisk kodede mt-Keima Reporter

For at vurdere mitofagi, i murine pancreas beta-celler ved hjælp af den genetisk kodede mitofagi-reporter, dyrker bugspytkirteløer isoleret fra vildtype og Mt-Keima-mus natten over ved 37 grader Celsius. Den følgende dag tilsættes 100 holme i en seks centimeter petriskål indeholdende to milliliter holmmedium for hver eksperimentel tilstand, der anvendes i denne protokol. Dernæst at adskille øjerne i enkeltceller og plette med FluoZin-3-AM og DAPI som tidligere demonstreret for den Mt-fagiske farvestofbaserede tilgang.

Fortsæt derefter med den flowcytometriske analyse af prøverne. Juster fremadspredningen eller FSC- og sidesprednings- eller SSC-spændingerne for at opnå en jævn fordeling af celler på et SSCA versus FSCA-plot. Hvis du vil markere enkelte celler og udelukke multipleter, skal du tilføje en rektangulær port på FSC-højde versus FSC-bredde efterfulgt af SSC-højde versus SSE-bredde.

Multipletterne er udelukket på grund af deres signalværdier med højere bredde. Opret derefter en DAPI-negativ port for at udelukke døde celler. Derefter skal du oprette FluoZin-3-AM-positive porte til at filtrere efter levende betaceller.

Opret et trekantet gating-skema ved hjælp af den Mt-Keima-positive prøve til at identificere sure og neutrale cellepopulationer. Når de primære og fluorescensporte blev etableret, skal du vurdere mitofagiflux ved hjælp af basale og valinomycin-inducerede ændringer i Mt-Keima-fluorescens.