Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- I Drosophilia fluer aktiverer en truende visuel stimulus, der signalerer tilgangen hos en rovdyr, neuronale kredsløb, der udløser en flugtrespons. For at manipulere det neuronale kredsløb, der styrer et sådant svar, skal du udtrykke en transgen lysfølsom opsin, som channelrhodopsin-2 i specifikke neuroner inden for dette kredsløb.
Channelrhodopsin er en fotofølsom kation kanal, der åbner, når de udsættes for stærkt blåt lys. Den efterfølgende tilstrømning af natriumioner spikes en handling potentiale, der forårsager neuron til at fyre og viderebringe oplysninger langs kredsløbet. Ud over lyset stimulus, cofaktoren all-trans-nethinde er nødvendig for channelrhodopsin at åbne.
Derfor giver alle-trans-nethinde i fluefoder, da det normalt er til stede i meget små mængder. Derudover, når man undersøger neuronernes rolle i et neuralt kredsløb, der er involveret i en reaktion på en visuel stimulus, skal du bruge fluer, der er visuelt blinde for at forhindre andre lysresponser.
Endelig skal du bruge et blåt LED-lys til at udløse den samme adfærd, der er forårsaget af den truende stimulus. I eksempelprotokollen vil vi se madlavning og lysinduceret adfærdsmæssig reaktion fra fluer, der udtrykker channelrhodopsin i optiske lobe neuroner.
- Begynd med at smelte standard cornmeal flyve mad i en mikrobølgeovn, og lad det køle af, indtil det er varmt at røre ved. Når afkølet, bland 50 mikroliter af tidligere forberedt 20-millimolar all-trans-nethinde i hvert hætteglas. Derefter lad hætteglas køle af og holde beskyttet mod lys, indtil det kræves.
Først skal du kort bedøve fluerne på is. Placer derefter individuelle fluer i P1000 pipettespidser med spidsen skåret for at danne en porediameter på omkring 2,25 millimeter, og luk hver ende med tape. Når fluen er vågnet og udforsker pipettespidsen, skal du fjerne båndet og hurtigt placere spidsen i rillen i den lodrette holder. Fastgør chippen på plads med en tommelfingerskrue, der lukker bunden af spidsen.
Fluer udforsker typisk spidsen i mellem 30 og 60 sekunder. Når fluen nærmer sig toppen af spidsen, skal du starte kameraoptagelsen lige før fluen kommer frem på platformen. Når fluen er opstået på platformen, skal du vente et til to sekunder og derefter tænde de blå lysdioder. Brug en timer til manuelt at måle tiden, indtil fluen starter flyvningen.
