Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Drosophilia sineklerinde, bir avcının yaklaşımını işaret eden yaklaşan bir görsel uyaran, bir kaçış tepkisini tetikleyen nöronal devreleri aktive eder. Böyle bir yanıtı kontrol eden nöronal devreyi manipüle etmek için, o devre içindeki belirli nöronlarda channelrhodopsin-2 gibi transgenik ışığa duyarlı bir opsin ifade edin.
Channelrhodopsin, parlak mavi ışığa maruz kaldığında açılan fotoğrafa duyarlı bir katyon kanalıdır. Sonraki sodyum iyonları girişi, nöronun devre boyunca ateş etmesine ve bilgi aktarmasına neden olan bir eylem potansiyeline sahiptir. Işık uyarana ek olarak, channelrhodopsin'in açılması için kofaktör all-trans-retinal gereklidir.
Bu nedenle, sinek gıdasında tamamen trans-retinal sağlayın, çünkü genellikle çok küçük miktarlarda bulunur. Ayrıca, görsel bir uyarana yanıt veren bir sinir devresinde nöronların rolünü araştırırken, diğer ışık tepkilerini önlemek için görsel olarak kör olan sinekleri kullanın.
Son olarak, yaklaşan uyaranın neden olduğu aynı davranışı tetiklemek için mavi bir LED ışık kullanın. Örnek protokolde, optik lob nöronlarında channelrhodopsin eksprese eden sineklerin gıda hazırlığını ve ışık kaynaklı davranışsal tepkisini göreceğiz.
- Standart mısır unu sineği yiyeceklerini mikrodalga fırında eriterek başlayın ve dokunmak için ılık olana kadar soğumaya bırakın. Soğuduktan sonra, önceden hazırlanmış 20 milimolar all-trans retinal'ın 50 mikrolitresini her şişeye karıştırın.
İlk olarak, Sinekleri buz üzerinde kısaca uyuşturun. Daha sonra, P1000 pipet uçlarına tek tek sinekleri yaklaşık 2,25 milimetrelik bir gözenek çapı oluşturmak için uç kesimli yerleştirin ve her ucunu bantla kapatın. Sinek uyandıktan ve pipet ucunu keşfettikten sonra, bandı çıkarın ve ucu dikey tutucudaki oluğa hızlıca yerleştirin. Çipi ucun altını kapatan bir başparmak vidası ile yerine sabitleyin.
Sinekler genellikle ucu 30 ila 60 saniye arasında keşfeder. Sinek ucun tepesine yaklaşırken, sinek platforma çıkmadan hemen önce kamera kaydını başlatın. Sinek platforma çıktıktan sonra bir ila iki saniye bekleyin ve ardından mavi LED'leri açın. Sinek uçuşa başlayana kadar geçen süreyi manuel olarak ölçmek için bir zamanlayıcı kullanın.
