약물 과민성의 IGE - 중재 메커니즘을 조사 Basophil 인증 시험

다음 실험의 전반적인 목표는 잘 특성화된 HAP 유도체 단백질 접합체를 사용하여 호염기구 활성화 검사로 IgE 매개 약물 과민증을 검출하는 것입니다. 이는 먼저 화학적으로 도입된 카르복시(carboxy) 그룹을 통해 약물을 인간 혈청 알부민의 라이신 잔류물에 화학적으로 연결함으로써 달성됩니다. 둘째, conjugate는 고성능 크기 배제 크로마토그래피 또는 H-P-S-E-C, 순차 굴절률 및 자외선 검출을 수행하여 정확한 결합 정도를 결정하기 위해 물리화학적으로 특성화됩니다.

다음으로, 잘 특성화된 약물 접합체는 약물 과민성 공여자의 호염기구를 자극하는 데 사용됩니다. 궁극적으로 호염병 활성화 검사 또는 BAT는 약물 과민증에서 IgE 매개 메커니즘을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 제 이름은 오스트리아 잘츠부르크 대학의 알레르기 연구 그룹의 마이클 슈타이너입니다.

오늘 우리는 약물 과민 반응에서 약물 특이적 IgE E 항체의 관여를 측정하는 것과 관련된 기술을 소개하고자 합니다. 여기에서는 널리 사용되는 비스테로이드성 항염증제의 두 가지 대표자, 즉 프로폰(propone)과 디클로페낙(diclofenac)의 절차를 보여줍니다. 그러나 이 방법은 즉각적인 유형의 약물 알레르기를 일상적으로 진단하는 데 사용될 가능성이 있습니다.

일반적으로 프로파페논 또는 PP 샘플에 갓 준비한 N 에틸, N 프라임, 3개의 디메틸 아미노 프로필, 카르보 이데 하이드로클로라이드 또는 EDC 원액 10마이크로리터를 추가합니다. 1분 동안 샘플을 볼텍스합니다. 다음으로, 16.9마이크로리터의 인간 혈청 알부민 또는 밀리리터당 118밀리그램 농도의 HSA 용액을 샘플에 첨가한 다음 분당 300라운드로 흔들면서 실온에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다.

진탕이 완료된 후 섭씨 4도에서 각각 몇 시간 동안 2리터의 PBS에 샘플을 세 번 투석합니다. 다음 14, 000 시간 G에 실내 온도에 10 분 동안 표본을 분리기를 하고, HSA에 활용된 NSAIDs를 포함하는 S 상등액을 모으십시오. 12%gels를 사용하여 SDS 페이지를 수행하여 단백질을 위한 상등액을 검사하십시오.

고성능 크기 배제 크로마토그래피 또는 H-P-S-E-C에 의한 NSAID 접합체의 결합 속도 분석을 위해 약 12마이크로그램의 HSA 접합체를 하나의 겔 슬롯에 로드합니다. 먼저 HSA 표준 샘플을 탈염수에서 밀리리터당 1밀리그램의 농도로 희석합니다. 검출기 보정을 위해 50마이크로리터의 HSA 표준 용액을 주입합니다.

그런 다음 7.8 x 300mm TSK 겔, G 2000 SSW XL 컬럼, 온라인 결합 굴절률 또는 RI 및 UV 검출기 시스템을 사용합니다. 검출기에 대한 RI 상수 케이스 sub RI 및 UV 상수 K sub UV를 계산합니다. 이 두 가지 공식을 사용하여 탈염수에 대한 H-P-S-E-C에 대한 PP 유도체 표준물질을 주입의 용이성을 위해 동물성 양으로 5, 10, 30으로 희석한 다음 두 표준물질에 대해 약물의 DC별 DN 및 약물의 DC별 DA에 대한 평균값을 계산합니다.

이제 이 두 가지 포뮬러를 사용하여 약물 접합체를 H-P-S-E-C에 주입하고 RI 및 UV 피크 면적을 측정할 수 있습니다. 그런 다음 동일한 두 방정식을 사용하여 PP 유도체의 농도와 미지 물질 첫 번째 라벨, 7개의 유세포 분석 바이알에 대한 HSA를 함량에 따라 계산합니다. 염색되지 않은 대조군, 음성 대조군, 양성 대조군 및 약물 접합체.

다음으로, 50마이크로리터의 호염질 자극 완충액을 염색되지 않은 음성 대조군을 위해 남겨둔 바이알에 피펫팅합니다. flow two cast kit의 anti FC epsilon R one 용액 50마이크로리터를 positive control 바이알에 추가합니다. 이제 1-10 희석 시리즈로 약물 접합체 바이알에 PP 접합체의 밀리리터당 0.02-20 마이크로 그램을 추가 한 다음 100 마이크로 리터의 자극 버퍼와 50 마이크로 리터의 환자의 EDTA 전혈을 각 튜브에 추가합니다.

샘플을 조심스럽게 섞습니다. 그런 다음 20 마이크로 리터의 흐름을 피펫으로 만듭니다. PE 표지 항 CCR 항체 3개 및 ZI 표지 항 CD 63 항체를 함유하는 2개의 캐스트 염색 시약을 각 약물 접합체 및 양성 및 음성 대조 튜브에 혼합하고 혼합합니다.

다시 말하지만, 섭씨 37도의 수조에서 45분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 반응을 중지하려면 샘플을 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 다음으로, 각 바이알에 2ml의 2개의 주조 용해 시약을 추가하여 적혈구를 이가 만듭니다.

실온에서 10분 동안 어두운 곳에서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 실온에서 500 배 G에서 5 분 동안 샘플을 펠릿화 한 후. 상등액을 조심스럽게 기하하고, 500 마이크로 리터의 세포를 현탁액으로 현탁시켜 세척 완충액을 캐스팅하고, 유세포 분석까지 샘플을 얼음에 보관합니다.

염색되지 않은 샘플을 사용하여 유세포 분석기 전압 설정을 조정합니다. 그런 다음 side scatter forward scatter plot 내에서 림프구로 예측된 세포를 게이트합니다. 이 샘플 그림과 유사하게, 호염기구는 먼저 CCR 3 high side scatter low로 식별됩니다.

이 산점도와 유사합니다. 세포를 fit EPE 플롯에 게이팅한 후, 활성화된 호염기구는 FIT E 표지 CD 63 양성의 발현에 의해 추가로 식별될 수 있습니다. 음성 대조군에서 CD 63이 높은 호염기구의 최대 2.5%로 컷오프를 설정한 후, 호염기구가 5% 이상인 경우 호염기구가 CD 63 높음이고 샘플의 MFI를 음성 대조군의 MFI로 나눈 값이 2를 초과하는 경우 샘플은 호염기구 활성화에 대해 양성으로 간주될 수 있습니다.

이 방법은 박쥐를 IgE 의존성 약물 과민성 단백질을 검출하는 데 유용한 도구로 평가합니다. NSAIDs의 Conjugate는 RI 및 UV 검출 응집체와 함께 H-P-S-E-C에 의한 호염기구의 활성화에 사용됩니다. state coupling degree 및 conjugates의 유효 수율은 이 그림에 표시된 대로 결정됩니다.

DF 접합체의 43.5%는 응집체에 대해 HSA에 대한 5.0 DF의 결합 정도와 함께 단량체를 유지했습니다. 9.5의 커플링 정도는 여기에 표시된 대로 결정되었습니다. PPP 접합체는 결합 정도가 21.2인 68.5% 단량체로 구성되는 것으로 나타났습니다.

골재의 결합 정도는 27.9였습니다. 전체적으로 DF 접합체의 결정된 결합 정도는 7.6df였고 PPP 접합체의 결합 정도는 23.2였습니다. 최적화된 조건에서 접합체로 수행된 BAT를 통해 NSAID 과민증에서 IgE 의존성 반응을 조사할 수 있습니다.

여기에서 볼 수 있듯이 PP conjugate만이 상향 조절에 의해 시각화된 호염류 활성화를 트리거할 수 있었습니다. CD 63 표면 표현에서. 호염기구의 20.6%가 형광 강도의 로그로 특징지어지는 바와 같이 활성화되었으며, MFI는 음성 대조군의 경우 3,86에서 1893년까지 4.9배 증가했습니다.

대조적으로, DF 접합체를 사용하면 호염기구의 3.1%만 활성화되었으며, 이는 5% 컷오프 미만이었습니다. 또한 MFI는 네거티브 대조군의 197에서 210으로 1.1배 증가에 그쳤습니다. 분석 유효성은 음성 대조군에서 5% 미만의 바소필 활성화로 입증됩니다.

둘째, 호염병 하위 집단의 형광 강도의 로그 변화와 양성 대조군에 대한 50% 이상의 활성화된 호염기구 3개. 이 동영상을 시청한 후에는 호염기구 활성화 검사를 수행하는 방법, 그리고 가장 중요한 것은 IgE를 IgE가 아닌 비IgE 매개 약물 과민 반응과 구별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한, 약물 알레르기에 대한 호염병 활성화 검사의 적용 범위를 꽃가루 식품 및 곤충 Eno.Allergies에 이미 확립된 용도 이상으로 확장하는 방법을 이해해야 합니다.