마우스에 현지 아나필락시스 측정

이 절차의 전반적인 목표는 혈관 투과성의 변화를 측정하여 국소 알레르기 반응을 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 동물을 O 알부민과 같은 알레르겐에 감작시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 알레르기 항원의 피내 주사로 귀에 도전

그런 다음 Evan의 파란색 염료를 꼬리 정맥에 주입합니다. 마지막 단계는 문제가 있는 귀를 하룻밤 동안 배양하여 염료를 추출하는 것입니다. 형태상, 아미드는 궁극적으로 분광 광도계로 귀에 들어간 염료의 양을 정량화하는 데 사용됩니다.

기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 염료 유출이 분광법으로 측정된다는 것입니다. 이는 분석이 관찰자 편향에 쉽게 영향을 받지 않는다는 것을 의미합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 피내 및 꼬리 정맥 주사가 기술적으로 어렵고 숙련도를 달성하기 위해 많은 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

사용을 위해 난자 스톡 용액의 부분 표본을 실온으로 가져오는 것으로 시작합니다. 실온에서 난자 스톡을 1 XPBS에서 밀리리터당 1mg 농도로 희석합니다. 5 밀리리터 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브를 사용하십시오.

중간 속도로 튜브를 와류로 만들고 조심스럽게 완전히 균질화한 동일한 부피를 추가합니다. 난자 용액에 명반을 적방울로 주입합니다. 이와 병행하여, 동일한 기술을 사용하여 PBS에 혼합된 명반의 negative control 용액을 1:1 비율로 준비합니다.

그런 다음 튜브에 캡을 씌우고 소용돌이에 고정합니다. 튜브를 부착한 상태에서 30분 동안 가장 낮은 설정에서 와류를 실행합니다. 용액이 준비되면 즉시 BAB 마우스의 감작을 진행합니다.

난자 명반 혼합물을 1ml 주사기에 넣습니다. 그런 다음 27게이지 바늘로 각 마우스의 복막에 100마이크로리터를 주입합니다. 다음 3주 동안 난자가 없는 명반 용액을 사용하여 음성 대조군 마우스에 대해 이를 반복합니다.

마지막 주입 후 마우스당 총 3회 주입에 대해 이 과정을 반복하고, 냉동 난자에서 국소 아나필락시스 분석을 수행하기 전에 최소 2주를 기다립니다. PBS에서 밀리리터당 5밀리그램 작업 용액을 만드는 것부터 시작하십시오. 5%ISO 불소를 사용하여 간단히 소용돌이칩니다.

과민한 쥐를 마취하고, 움직이지 않게 될 때, 3%에 iso 불소를 다이얼하십시오이제 난자 준비의 10 마이크로리터로 3개의 10 인슐린 주사기를 적재하고, 31 계기 바늘로 그것을 덮고 1개의 XPBS의 10 마이크로리터로 두번째 주사통을 적재하십시오. 그런 다음 투명 접착 테이프가 붙은 15ml 원뿔형 튜브를 접착 면이 바깥쪽으로 하여 해부 현미경으로 감싸고 마취된 마우스의 왼쪽 귀의 등 쪽을 튜브에 고정합니다. PBS 주사기 베벨 면의 바늘을 귀의 두 잎 사이에 위로 향하게 삽입하고 10마이크로리터를 천천히 주입합니다.

혈관에 부딪히지 마십시오. 성공적인 주사는 명백한 피내 블립을 초래할 것입니다. 전체 볼륨을 귀에 주입하는 것이 중요합니다.

주입 부위에서 액체가 누출되면 동물을 분석에 사용할 수 없습니다. 또한 바늘이 귀를 완전히 관통하거나 귀 표면을 긁으면 이러한 외상으로 인해 결과가 오른쪽 귀로 혼란스러워지기 때문에 분석이 유효하지 않습니다. 동일한 방법을 사용하여 3분 동안 난자를 주입합니다.

마우스를 구속기로 옮기고 열 램프 아래에 놓습니다. 그런 다음 꼬리 정맥에 0.5%Evans blue dye 200마이크로리터를 천천히 주입합니다. 27 게이지 바늘을 사용하면 모든 염료가 주입되기 전에 혈관이 파괴되면 급속 주입이 손상될 수 있습니다.

꼬리의 반대쪽에 계속 주입합니다. 이제 10 분 정도 기다렸다가 이산화탄소로 마우스를 안락사 시킨 다음 자궁 경부 탈구를 수행하십시오. 동물을 안락사시킨 후에는 집게와 가위를 사용하여 귀를 제거합니다.

주사 부위에 압력을 가하지 않고 집게로 귀 가장자리를 잡습니다. 그런 다음 귀 기저부의 연골 융기를 통하지 않고 가깝게 자릅니다. 가능한 한 많은 조직을 수집하십시오.

이제 적절한 예방 조치를 취하여 각 귀에 대해 700마이크로리터의 폼 아미드를 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 각 튜브에 귀를 옮기고 섭씨 63도의 건조 열 블록에서 밤새 배양하면 다음날 대부분의 염료가 추출되지만 귀가 약간 파란색으로 보일 수 있습니다. 각 샘플 300마이크로리터를 96웰 플레이트에 복제하여 추가합니다.

털을 옮기지 말고 블랭크에 거품을 형성하지 마십시오. 두 개의 웰에 300마이크로리터의 폼 아미드를 로드합니다. 그런 다음 620나노미터에서 흡광도를 측정합니다.

배경에서 값을 빼고 결과를 분석합니다. PBS에 감작된 동물은 난자 챌린지 또는 PBS 챌린지에 반응하지 않았습니다. 예상대로 양쪽 귀는 하얗게 유지되었습니다.

OVA에 감작된 동물에 대한 PBS 챌린지를 받은 해는 완전히 흰색 또는 연한 파란색이었으며, 염료 투여 후 10분 동안 난자 챌린지를 받은 귀가 점차 어두워지는 주사 부위에 국한되었으며, PBS 감작 동물의 IDE 처리된 귀 조직은 PBS 및 OVA 챌린지 후 흡수도 수치가 무시할 수 있는 수준이었습니다. 난자에 감작된 동물의 경우, PBS 주입은 일반적으로 0.13의 평균 흡광도 판독값을 나타냈습니다. 반대로, 50마이크로그램 난자 챌린지는 0.58의 평균 흡광도 판독값을 나타냈습니다.

챌린지에 사용되는 난자의 양은 한도 내에서 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 20마이크로그램의 챌린지는 0.30의 평균 흡광도를 얻었습니다. 그러나 20마이크로그램 미만의 챌린지에서는 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 없었습니다.

일단 피내 주사 및 정맥 주사에 능숙해지면 어려운 일이지만, 이 기술은 두 사람이 함께 협력하여 한 명은 귀 주사를, 다른 한 명은 꼬리 정맥 주사를 주사하여 약 15분 안에 한 동물에게 수행할 수 있습니다. 이 절차는 약 1시간 내에 10마리의 동물을 대상으로 수행할 수 있습니다. 이 분석법은 능동 및 수동 피부 아나필락시스 모두에 사용할 수 있으므로 매우 다재다능합니다.

또한 다양한 알레르기 항원에 사용할 수 있습니다. 불소는 인간의 생식 기관에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 환기가 잘 되는 방에서만 사용하고 임산부의 경우 폐가스를 중화하기 위해 인덕션 챔버에 청소 캐니스터를 부착하십시오.

불소를 사용하는 동안 노출을 최소화하기 위해 탄소 필터 마스크를 착용하십시오.