합성, 세포 전달 및 생체 내 덴드리머 기반 pH 센서의 응용 프로그램

다음 실험의 전반적인 목표는 Dun drummers를 기반으로 생체 외, 생체 내 pH 이미징을 위한 향상된 특성을 가진 새로운 형광 센서를 개발하는 것입니다. 이는 먼저 pH에 민감한 염료를 수지상 스캐폴드에 접합하여 민감한 염료의 표적 그룹 또는 pH와 같은 다른 부분과 함께 달성됩니다. 또한 생체 외 측정을 통해 살아 있는 세포의 이미지 pH 옆에 pH 보정 곡선을 생성합니다.

센서는 electroporation을 통해 전달되며 pH 맵은 뇌의 세포 외 공간에서 pH를 이미지화하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하여 생성됩니다. 생리학적, 병리학적 신경 활동 중에, 센서는 마취된 쥐의 뇌에 마이크로 주입됩니다. 그런 다음 두 개의 광자 현미경을 사용하여 형광 데이터를 획득합니다.

얻은 결과는 드리머 기반 센서가 살아있는 세포와 생체 모두에서 높은 공간 및 시간 분해능으로 pH 변화를 측정하는 데 성공했음을 보여줍니다. pH에 민감한 거동을 가진 여러 굴뚝 염료가 이미 사용되었지만, 이동성 저하 및 세포 누출과 같은 몇 가지 단점이 있습니다. 또한 래시 미터법 절대 측정을 허용하지 않습니다.

여기에서 우리는 pH 민감성 염료를 D 유전자 골격에 conification하는 것을 시연했으며, 성능을 통해 특수 및 시간 분해능으로 정확한 측정이 가능하기 때문에 이 방법은 살아있는 세포에서 pH에 의해 조절되는 생리학적 및 병리학적 과정을 연구하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 신경 시스템의 pH 조절 중단은 뇌졸중 및 간질과 같은 여러 상태와 관련이 있으며, 사용 가능한 pH 센서는 효과가 좋지 않은 것으로 판명되어 제시된 센서의 설계로 이어졌습니다. 이 Met는 pH h 이미징에 적용되었지만, 이는 일반적인 접근 방식이며 다른 생물학적 관련 종에 적용할 수 있습니다.

이익 감지 염료를 선택함으로써 쉽고 다재다능한 합성 접근 방식은 이러한 절차를 간단하게 만듭니다. 오늘 절차를 시연하는 것은 Giovanni re, Barbara ti, Marco Brody 및 Sebastian Suli가 pH 지시약을 Piam Demers에 접합합니다. 50 micromolar의 최종 농도에서 무수 DMSO에 rimer를 용해하는 것으로 시작합니다.

무수 TMR이라고도 하는 플루오레세인 NHS 및 테트라에틸 루민 NHS의 10마이크로몰 원액, 결합된 마이크로 원심분리기 튜브의 DMSO, 8개의 등가물이 있는 G 4개의 페람 데더러 용액 1밀리리터 또는 플루오레세인 40마이크로리터 및 8개의 등가물 또는 40마이크로리터의 TMR을 준비합니다. 혼합물의 몰 비율은 디머에 적재된 염료의 양을 반영합니다. 용액을 실온에서 12시간 동안 저어줍니다.

다음으로, 혼합물을 탈이온수로 1 내지 10으로 희석하고 반응 혼합물을 분자량 컷오프가 10킬로달톤인 투석 백에 넣고 탈이온수에 대해 투석하고 저장소의 물을 24시간 동안 3회 교체합니다. 다음 날, 용액을 유리 바이알에 옮기고 영하 80도에서 몇 시간 동안 얼립니다. 용액이 완전히 얼면 바이알을 동결 건조기로 옮기고 24시간 동안 동결 건조합니다.

자주색 분말을 얻어 물결 모양으로 고체를 얻어 mqe 물에 용해시켜야 합니다. 10 마이크로 몰의 최종 농도에서. 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 50마이크로리터 분취액에 용액을 분주하고 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.

체외 보정을 위해 석영 Q 수의사에서 2밀리몰 PBS에 D 드러머의 500나노몰 용액을 준비합니다. 적정 중 pH의 급격한 변화를 방지하기 위해 매우 희석된 PBS 버퍼가 사용됩니다. 플루오레세인(fluorescein) 및 TMR의 방출 스펙트럼을 측정하고 형광계의 광학 설정을 최적화하여 우수한 신호 대 잡음비를 달성합니다.

다음으로, 0.1 일반 수산화나트륨과 0.1 일반 염산을 소량 첨가하여 pH 적정을 수행합니다. 추가할 때마다 Q 수의사를 흔들어 섞습니다. 평형을 위해 1분 동안 기다린 다음 pH를 사용하여 pH를 측정합니다.

플루오레세인(fluorescein)과 TMR의 마이크로 전극 방출 스펙트럼은 모든 단계에 대해 어떠한 변화도 없이 기록되어야 합니다. 광학 설정에서 형광 강도 대 pH를 플롯합니다. 적정을 위해 막대 도민 신호는 pH의 영향을 받지 않아야 합니다.

플루오레세인 신호는 시그모이드 곡선이어야 하며 전기천공을 위해 PK가 6.4인 단일 결합 모델을 장착해야 합니다. 72마이크로리터의 다섯 번째 헬라 세포로 6회 10회 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 통해 재현탁된 세포로 이동합니다. 2 마이크로 몰의 농도로 dendri 또는 수용액을 첨가하고 3 밀리리터의 electroporation 버퍼를 마이크로 정제 튜브에 첨가합니다.

그런 다음 10 마이크로 리터 electroporation 팁을 사용하여 세포와 rimer 혼합물을 흡입합니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 피펫 스테이션에 삽입하고 여기에서 마이크로 정제 펄스 조건을 설정합니다. 펄스 전압은 1005볼트로 설정됩니다.

펄스 폭은 35밀리초로 설정되고 펄스 수는 펄스 플레이트 뒤의 2로 설정됩니다. 20마이크로리터의 전기천공된 세포를 항생제 없이 신선한 배지와 함께 유리 바닥 접시에 넣습니다. 전기천공법 12시간 후 플루오레세인 및 R 도민에 대한 표준 필터 세트를 사용하여 컨포칼 현미경으로 세포를 이미지

표본에 초점을 맞추고 레이저 출력과 검출기 게인을 조정하여 신호 대 잡음비를 최대화합니다. 전기천공법이 성공적이었다면, 세포는 두 채널 모두에서 밝은 형광을 띠어야 합니다. 현지화는 사용되는 D의 크기와 전하에 따라 다릅니다. 자주.

작은 핵주위 소포로 보이는 태양 리소좀 국소화(sun lysosomal localization)는 세포내이입(endocytosis) 또는 콤팩탈화(com compartmentalization)로 인해 존재합니다. 리소좀 국소화가 우세한 경우, 대부분의 형광은 소포 내부에 국한되어 있고 세포질에서 공극 신호가 관찰됩니다. 이는 독성을 의미하며 측정값을 폐기해야 합니다.

두 채널을 순차적으로 획득하고, 여러 이미지를 획득하고, 이미지를 평균화하여 이미지 품질을 개선합니다. pH 검량 곡선을 생성하려면 서로 다른 phs에서 opfor와 함께 버퍼를 사용하여 세포 내 및 세포 외 pH를 동일한 값으로 응집합니다. pH당 최소 20개의 세포 이미지를 획득하고 pH 5.5에서 pH 7.5까지 최소 5개 지점을 측정합니다.

pH B 6이 세포에 독성이 있지만 짧은 시간 동안 견딜 수 있으므로 가능한 한 짧은 이미지를 획득할 수 있음을 상기시킵니다. 세포사멸의 징후가 보이면 세포를 버리고 다시 시작하십시오. 인수 후.

데이터 분석을 위해 이미지 J 또는 유사한 소프트웨어를 사용합니다. 먼저 녹색과 빨간색의 비율을 결정합니다. 그런 다음 pH 대비 비율을 플롯하여 향후 실험에서 비율을 pH로 변환하는 데 사용할 수 있는 보정 곡선을 제공하는 선형 추세를 생성합니다.

생체 내 샘플 준비를 위해 출생 후 28일에서 70일 사이에 C 57 black six J 및 암컷 마우스로 시작합니다. 우레탄으로 생쥐를 마취한 후 발가락 꼬집기를 수행하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인하고 눈 연고를 바르면 피질 스트레스 반응과 뇌부종을 줄일 수 있습니다. 수술 중에는 체중 1kg당 2mg의 덱사메타손, 인산나트륨을 근육 주사합니다.

그런 다음 수술용 가위를 사용하여 동물의 머리를 면도한 다음 수술용 드레이프를 놓고 두피에 2.5% 리도카인 젤을 바릅니다. 가위를 사용하여 양쪽 반구의 두개골을 덮고 있는 피부 덮개를 자릅니다. 노출 된 뼈를 식염수와 집게로 씻고 골막을 부드럽게 제거하십시오.

이것은 더 나은 접착 표면을 제공할 것입니다. 접착제 및 치과 용 시멘트의 경우 중앙 이미징 챔버가있는 맞춤형 강철 헤드 포스트를 적용하고 시아 노 아크릴 레이트를 사용하여 관심 영역 위의 두개골과 거의 평행 한 평원에 붙입니다. 흰색 치과 시멘트로 포스트를 제자리에 고정하십시오.

마우스의 머리를 고정하고 관심 영역을 드릴로 뚫어 직경 2-3mm의 개두술을 수행합니다. 드릴링 절차 전반에 걸쳐 주사기를 사용하여 새로운 멸균 A CSF를 두개골에 도포하여 수술 중 피질의 가열을 최소화하는 경우가 많습니다. 개두술 후 동물을 이미징 스테이지로 옮겨 머리가 대물렌즈 아래에 가만히 있도록 합니다.

이미징 챔버를 조정 가능한 포스트에 나사로 고정합니다.산소에 연결된 맞춤형 플라스틱 주둥이를 적용합니다. 이것은 실험 중에 산소가 풍부한 공기를 제공하여 동물의 호흡을 돕습니다.

뇌 피질에 센서를 주입하려면 팁 직경이 4mm인 유리 피펫과 염화은 전극을 로드합니다. 1마이크로몰 드리머 ER 솔루션을 사용하면 전극이 미세 주입 설정으로 세포 외 전위를 쉽게 기록할 수 있습니다. 약 150미크론 깊이에서 피질에 피펫을 삽입합니다.

제곱인치당 0.5파운드의 압력으로 1-2분 동안 주입하여 이미징을 위한 광학 설정을 최적화합니다. 레이저 출력을 조정하여 사진 표백 및 사진 손상을 최소화합니다. 일반적으로 사용되는 레이저 출력은 약 20밀리와트이며 PMT 이득은 667볼트에서 일정하게 유지됩니다.

레이저 파장을 820나노미터에서 센서를 여기하도록 설정하고 소프트웨어가 표준 FTSE 및 trit 필터를 통해 플루오레세인 및 막대 도민 형광을 동시에 검출하도록 지시합니다. 또한 배경 보정을 위해 획득 주파수를 2Hz의 프레임 속도로 설정합니다. 레이저 셔터를 닫은 상태에서 어두운 프레임을 획득하여 PMT와 받침대에서 발생하는 평균 열 잡음을 측정합니다.

마지막으로, pH 의존성 형광 이미지를 획득하고 후속 분석을 위해 저장합니다. 이전과 같이 데이터를 분석하여 플루오레세인과 루민의 시험관 내 거동을 평가합니다. 라이머에 적재된 pH 적정은 형광측정기를 사용하여 수행되었습니다.

이 그림은 pH 센서의 일반적인 적정을 보여줍니다. 플루오레세인(Fluorescein)과 루민(rumine)은 각각 488나노미터와 550나노미터에서 별도로 여기될 수 있으며, 이를 통해 두 채널 간의 누화를 최소화할 수 있습니다. 플루오레세인은 pH 의존적 거동을 보이는 반면 R 도민 신호는 생리학적 pH 범위에서 크게 변하지 않습니다.

따라서 이 두 신호의 비율은 센서 농도에 의존하지 않고 pH에만 의존합니다. 다음으로 지표를 세포 내로 전달하기 위해 hela 세포를 dederer 센서로 전기천공하고 이 비디오에 설명된 대로 컨포칼 이미징을 수행했습니다. 이러한 컨포칼 이미지는 왼쪽의 플루오레세인 채널, 중앙의 R 도마인 채널에 있는 세포를 보여주며, 오른쪽에는 pH 비율 메트릭 맵으로 표시됩니다.

강한 플루오레세인(fluorescein) 및 r 도민(r) 도민 신호가 관찰되며, 이는 센서 구조의 무결성을 보여주는 공동 국소화(co-localize)입니다. 비율 메트릭 맵은 두 이미지를 픽셀 단위로 나누어 재구성되며 의사 색상 스케일로 표시됩니다. 세포 내부의 센서 반응을 보정하기 위해 다음과 같이 ionophores를 사용한 pH 클램핑을 수행했습니다.

지표는 녹색과 빨간색 비율의 변화로 pH에 쉽게 반응합니다. 결과 데이터는 정확한 pH 측정을 위한 검량선을 생성하는 데 사용되었습니다. 교정의 선형 추세는 세포 환경의 섭동 없이 pH에 반응하는 센서의 능력을 보여줍니다.

dendri 기반 센서를 in vivo 이미징에 사용하는 방법을 보여주기 위해 pH 이미징은 dendri 또는 주입된 마취 마우스의 뇌에서 수행되었습니다. 플루오레세인 및 r 도민 신호는 820 나노미터 여기와 함께 동시에 얻어졌으며, 비율 맵은 살아있는 세포 측정과 유사한 픽셀 단위로 구축되었습니다. 특히, 지표는 세포 외 공간에 국한되어 있으며, 이미지의 비형광 영역은 세포체 또는 작은 혈관을 식별하여 pH에 대한 센서 반응을 확인합니다.

우리는 하이퍼캐프니아(hypercapnea)를 사용했습니다. 실제로, 이산화탄소는 혈액과 조직에 있는 탄산염 완충액의 평형을 변화시켜 조직의 산성화를 초래하는 것으로 알려져 있습니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이 30%의 이산화탄소를 흡입하면 마우스의 회전 환기 시 완전히 되돌릴 수 있는 센서의 강력한 반응을 유도하기에 충분합니다.

이러한 결과는 살아있는 세포와 생체 내에서 pH의 생리학적 및 병리학적 변화를 강조할 수 있는 잠재적인 ofer 기반 센서를 보여줍니다. A, 우리의 절차는 전기 생리학 기록과 같은 다른 측정과 호환됩니다. 이를 통해 진행 중인 생물학적 과정에 대한 보완적인 정보를 동시에 얻을 수 있었습니다.

이 방법은 개발 후 세포 생물학 및 신경 생물학 연구자들이 배양 세포 및 생체 내에서 pH 조절 과정을 탐구하는 길을 열었습니다.