Крупномасштабные данио рерио эмбриональных Сердце Вскрытие для транскрипционных анализа

Общая цель этой процедуры заключается в сборе сердец путем быстрого ручного препарирования из живых эмбрионов рыбок данио-рерио для получения специфичного для сердца Mr.NA. Это достигается путем предварительного пипетирования, многократного обезболивания эмбрионов вверх и вниз через узкий кончик пипетки, чтобы одновременно освободить сердца от эмбриональных тел. Затем вскрытые сердца отделяются от эмбрионального мусора в два этапа быстрой фильтрации. Затем сердечки с флуоресцентной маркировкой вручную сортируются от оставшегося мусора.

Наконец, сердечная специфическая РНК извлекается из собранных сердец. В конечном счете, протокол вскрытия сердца используется для сбора достаточного количества эмбриональных сердец для проведения транскриптомного анализа. Этот метод поможет задать ключевые вопросы в области развития сердца чешуйниц, например, какие транскрипты экспрессируются в сердце на разных стадиях развития, а также сравнить дикую и мутантную экспрессию сердца.

Следите за развитием эмбрионов. Убедитесь, что сердца действительно помечены флуоресцентной меткой, и вручную защитите эмбрионы, когда эмбрионы достигнут желаемой стадии. Пересадите около 100 эмбрионов в 1,5-миллилитровую пробирку и добавьте 16 миллиграммов на миллилитр трики в среде Е три, чтобы обезболить их.

Положите трубку на лед. Удалите раствор трики и используйте один миллилитр ледяного L 15 10% FBS medium для промывания эмбрионов, держа их на льду. После удаления этой промывки добавьте один миллилитр L 15 FBS и с помощью круглого гелеобразного наконечника пипетируйте эмбрионы вверх и вниз пять-восемь раз, чтобы полностью разрушить желтки, пипетируйте эмбрионы по каплям на поверхность раствора, чтобы капля лопнула и эмбрионы были аккуратно нарушены.

Для этой первой партии препарированных эмбрионов под стереомикроскопом оцените их целостность и долю рассеченных сердец и соответствующим образом отрегулируйте способ пипетирования. Для последующих партий поместите 100-микрометровый фильтр на 50-миллилитровую центрифужную пробирку и нанесите эмбриональный образец. Затем используйте один миллилитр L 15 FBS для промывки дымовой трубки и нанесите раствор на фильтр, чтобы промыть сердца, оставшиеся в фильтре.

Используйте L 15 FBS, чтобы промыть его дважды. Затем поместите фильтр 30 микрометров на 15-миллилитровую центрифужную трубку и проведите через нее, содержащую сердца. Используйте L 15 FBS для промывки этого фильтра, который сохраняет сердцевину и смывает более мелкий мусор.

Затем переверните 30-микрометровый фильтр вверх дном над чашкой Петри, покрытой агросом, и нанесите три промывки по одному миллилиру среды L 15 FBS, чтобы вымыть сердца из фильтра. Под флуоресцентным микроскопом с помощью пары щипцов вручную отделите GFP-положительные сердца от нефлуоресцентных тканей, концентрируя их в центре чашки. Физиология сердец выглядит нормальной, так как они все еще бьются после вскрытия. Процедура. Чтобы выделить мРНК из сердца, соберите их в минимально возможном объеме среды и пипетируйте в 1,5-миллилитровую пробирку на льду, содержащую 0,75 миллилитров РНК.

Позже под флуоресцентным микроскопом. Просмотрите наконечник пипетки, чтобы убедиться, что на наконечнике пипетки не осталось сердец. После вытягивания сердец из нескольких раундов изоляции в пробирку с РНК, позже, согласно текстовому протоколу, образцы центрифуги при 15, 700 G и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.

Затем под флуоресцентным микроскопом тщательно соберите как можно больше насыщения и переложите в чашку Петри, покрытую 1%-ным агросом, содержащую три миллилитра среды L 15 10%FBS. Далее под химическим колпаком добавьте 0,5 миллилитра триола в пробирку, содержащую осажденные сердца, и держите на льду Под флуоресцентным микроскопом переложите сердца, оставшиеся в надосадочной жидкости, в свежую посуду, покрытую 1% агросом, с L 15 10% FBS, чтобы позже разбавить РНК, которая очень вязка. Затем соберите сердечки в небольшом объеме и перенесите их в трубку с отстоявшимися сердцами в триоле, чтобы нарушить работу сердец, сделайте трубку вихревой и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем под химический колпак добавьте 100 микролитров хлороформной смеси тщательно и переложите раствор в 1,5 миллилитровую пробирку PrepU, пробирку PLG инкубируйте в течение трех минут при комнатной температуре, центрифугируйте образец при 15, 700 G и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут, и перенесите водную фазу в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра. Затем добавьте от пяти до 10 микрограммов гликогена и 250 микролитров предварительно охлажденного изопропанола. Хорошо перемешайте и выдерживайте в течение ночи при температуре минус 20 градусов Цельсия на следующий день.

Центрифугируйте образцы при давлении 15, 700 G и четырех градусах Цельсия в течение 30 минут, а затем выбросьте нат. Нанесите один миллилитр 75%-ного этанола для промывки палитры центрифуги и выбросьте сна. Дайте оставшемуся этанолу испариться из гранулы при комнатной температуре, пока пеллета не станет белой.

Добавьте в гранулу 20 микролитров свободной РНК дважды дистиллированной воды и инкубируйте при температуре 55 градусов в течение 10-15 минут, чтобы растворить РНК. Затем поместите трубки на лед. Используйте спектрофотометр для определения концентрации и чистоты РНК и проведите отбор образца на 1%-ном геле, чтобы оценить целостность РНК, сравните образцы сердца перед сортировкой от эмбриональных остатков через 56 часов после оплодотворения по сравнению с 36 часами после оплодотворения.

Эмбрионы через 56 часов после оплодотворения дали больше эмбриональных остатков, чем через 36 часов после оплодотворения, после фильтрации для определения чистоты образца сердца 56 HPF, уровни экспрессии сердечных и экстрасердечных транскриптов сравнивали с R-T-Q-P-C-R. Этот гель содержит РНК, извлеченную из изолированных сердец и из разрушенных эмбрионов без сердца. Измерения абсорбции показали, что 300 сердец содержат около 660 нанограммов РНК.

То есть 33 нанограмма на микролитр при итоговом объеме 20 микролитров. Относительные уровни экспрессии генов были рассчитаны с помощью экспериментов R-T-Q-P-C-R для показанных здесь маркеров. Как и ожидалось, седьмая миля была сильно обогащена в образце сердца по сравнению с эмбрионом без образца сердца, как показано здесь.

Маркер эндотелиальных клеток, KDRL, был умеренно обогащен в сердце. Эритроцитарный маркер гемоглобина бета эмбриональный 1.1 был чрезмерно представлен в образце сердца, даже несмотря на то, что сердца все еще бились после вскрытия, что должно было изгонять эритроциты из сердца. При контрасте уровни маркера хрусталика альфа А кристаллического и маркера ЦНС, GFAP были значительно снижены в образце сердца.

Эти результаты показывают, что протокол вскрытия сердца дает высококачественную сердечную специфическую РНК из цельных эмбрионов рыбок данио. Для этого эксперимента важно следить за образцом, чтобы не потерять сердце во время процедуры вскрытия.